Name: 开发HiPSC衍生的无血清胚胎体用于使用生理相关测定的3-D干细胞培养物的询问 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习利用hiPSC构建无血清胚胎体三维培养系统，模拟人类早期皮层发育过程。该方法为药物筛选和神经生物学研究提供了可扩展的细胞平台。

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感谢 Elizabeth Benevides 对本文的校对。感谢 John Hussman 博士和 Gene Blatt 博士富有建设性的讨论和意见。

1. 神经前体细胞的制备
<ol>
	<li>将来源于成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）的hiPSCs在6孔板中培养于经γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上，使用添加小分子化合物的人iPSC培养基（见材料表）。 
	注：日常维护步骤为先前报道方法的改良版本1,16。
	<ol>
		<li>将6 × 105个MEF细胞接种至6孔组织培养板的每孔中，每孔加入300 μL推荐培养基（按照制造商说明书操作）。</li>
		<li>48小时后，将MEF细胞的培养基更换为每孔300 μL的hiPSC培养基，孵育1小时后再接种hiPSCs。</li>
		<li>在37 °C水浴中快速解冻hiPSCs，缓慢逐滴加入1 mL hiPSC培养基。将细胞与培养基转移至15 mL锥形离心管中，补加培养基至总体积5 mL。以129 × g离心4分钟，吸除上清液，轻轻将沉淀重悬于含ROCK抑制剂（1:1,000浓度）的1 mL hiPSC培养基中。</li>
		<li>将细胞悬液（通常接种密度为300,000个细胞/孔）接种至MEF饲养层上，于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养。</li>
		<li>使用光学显微镜密切观察iPSC培养状态。48小时后，移除边缘不规则、呈囊状生长或在光学显微镜下呈现黄褐色的培养物，以减少自发性分化。 
		注：接种后7–10天，hiPSC应形成克隆。克隆应呈圆形，边界清晰，细胞密度均匀，无松散排列或形态不均一的细胞。</li>
		<li>人工挑选圆形hiPSC克隆，以清除自发分化的细胞。通过将克隆转移至新的MEF饲养层进行扩增。当培养接近汇合时，每7天按1:3比例传代一次，并进行冻存1,16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞扩增并冻存（作为备份）后，继续在培养板上培养hiPSC克隆，直至达到50–75%汇合度。</li>
	<li>接种后第7天，采用温和的酶消化法（使用300 μL酶溶液处理5–10分钟）并轻柔吹打（用1,000 µL移液器吹打2–4次），收集并制备用于神经前体细胞分化的hiPSCs。</li>
	<li>将细胞悬液以129 × g离心4分钟，吸除上清液，将沉淀轻轻重悬于5 mL人iPSC培养基中。将细胞悬液转移至经0.1%明胶包被的5 cm细胞培养皿中，在37 °C孵育1小时，以去除MEF细胞并最大化获得hiPSCs。将含有非贴壁细胞的培养基转移至另一块经明胶包被的5 cm培养皿中。</li>
	<li>使用移液管将非贴壁细胞转移至15 mL离心管中。用3 mL培养基轻轻冲洗原培养皿，并将冲洗液加入15 mL离心管中。</li>
	<li>将细胞悬液以129 × g离心4分钟，吸除上清液，轻轻将沉淀重悬于培养基中。使用自动细胞计数仪测定细胞数量。以每孔9,000个细胞的密度接种至96孔低吸附V型底培养板中。</li>
	<li>将培养板以163 × g离心3分钟。置于37 °C、95%湿度、5% CO2条件下培养。使用移液器每隔一天更换50%培养基，即吸除一半培养基，补充等量新鲜的化学成分明确的分化培养基1（DM1；图1；材料表），持续14天。</li>
</ol>
2. 无血清拟胚体（SFEB）诱导（图2）
<ol>
	<li>将40 µm细胞培养插件放入6孔板中，在加入类器官聚集体前至少1小时加入1 mL DM1培养基。</li>
	<li>第14天，使用200 µL宽口吸头将聚集体连同20 µL培养基转移至40 µm细胞培养插件中，并将培养基更换为DM2。 
	注意：细胞培养小室是一种特殊设计的插入式装置，可置于孔板底部上方一定位置，由聚四氟乙烯膜固定于塑料支架上构成。该膜具有生物相容性，能够有效支持营养物质和氧气向置于其上的SFEBs输送。此类装置常用于小鼠或大鼠来源的海马组织切片培养。7,17,18.
	<ol>
		<li>将4-6个类器官转移至一个细胞培养插件中，并在类器官之间留出足够的空间。使用细尖移液枪头尽可能吸除多余的溶液。例如 200 μL 吸头 
		注意：在移除 SFEB 周围溶液时，SFEB 可能会短暂移动，这是可接受的，因为它们会在细胞培养插件上自行调整位置。</li>
		<li>在37 °C、95%湿度和5% CO₂条件下，用1 mL DM2培养基维持培养2使用移液器每隔一天更换75%的培养基，即移除四分之三的培养基，并加入等量新鲜培养基。例如，移除750 μL培养基，加入750 μL新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养14天后，更换为DM3培养基，每隔一天更换75%的培养基，持续再培养16天。</li>
	<li>为维持细胞培养插入物上的 SFEBs 超过 30 天，分别在第 60、90 和 120 天期间每隔一天更换一次培养基。 
	注意：SFEBs 的直径将生长至约 1,000 μm，厚度通常为 100–150 μm1.</li>
</ol>
3. 确定 SFEB 的组成
<ol>
	<li>使用200 µL宽口吸头轻轻吹打培养基，使SFEBs从插入物上脱离。转移SFEBs时，用宽口吸头轻轻吸取类胚体进入吸头中。将SFEBs吸入吸头后，轻柔转移至12孔板中，并每孔加入300 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。 
	注意：SFEBs将在12孔板中悬浮于溶液中。这一点至关重要，以确保固定液、封闭液和抗体能够充分渗透。若需对多个SFEBs进行染色，每个12孔板孔中最多可加入10个SFEBs。这有助于节约试剂和抗体。</li>
	<li>在室温下用每孔300 μL的4%多聚甲醛固定SFEBs，固定时间为30–45分钟。随后用每孔300 μL PBS洗涤两次，每次洗涤3–5分钟。 
	警示：操作多聚甲醛时应穿戴适当的个人防护装备。 
	注意：可通过检测免疫反应性标志物来评估成熟度、细胞类型等。本研究中用于标记神经元的抗体为鸡源Tuj1抗体（1:500稀释），其他标志物请参见表2及参考文献1,16。</li>
	<li>在室温下使用含0.1% Triton-X100的PBS与10%正常驴血清（封闭液；每孔300 μL）对SFEBs进行透化和封闭处理，持续1小时。</li>
	<li>移除封闭液，将SFEBs与用封闭液稀释的一抗（每孔300 μL）共同孵育，在4 °C下过夜。随后用含0.1% Triton-X的PBS每孔300 μL洗涤三次，每次3–5分钟。</li>
	<li>将二抗按1:1000比例稀释于封闭液中。将SFEBs与二抗在室温下孵育1小时。再用每孔300 μL PBS洗涤三次，每次3–5分钟。 
	注意：此时SFEBs已可进行成像准备。</li>
	<li>使用宽口吸头将SFEBs转移至载玻片上，并通过轻柔抽吸去除SFEBs周围的过量溶液。 
	注意：在相同染色条件下，多个SFEBs可置于同一张载玻片上。</li>
	<li>在SFEBs上滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，轻轻按压以确保无气泡产生。待封片剂固化后，即可进行成像与定量分析（步骤3.8）。 
	注意：封片剂固化后，SFEBs即可用于成像。</li>
	<li>通过标准共聚焦显微镜，在SFEBs上选取多个感兴趣区域（ROI），并对每个ROI采集z轴层扫图像，结合最大投影图像进行细胞定量分析，具体方法见参考文献1,16。 
	注意：可采用基于图像拼接的方法对整个SFEBs进行定量（详见参考文献1,16）。由于SFEBs厚度约为100 μm，组织内光散射极小，因此无需使用双光子显微镜。此前在成纤维细胞来源的iPSCs中应用该方案时，获得了SFEB的命运图谱，揭示出结构复杂且多样化的细胞群体，其中包括转录特征类似于CGE和前脑前部命运的中间神经元亚群1,16。</li>
</ol>
4. 使用多电极阵列记录 SFEB 中的神经元活动
<ol>
	<li>按照制造商说明准备12孔MEA板。</li>
	<li>在无菌条件下，用无菌H2O清洗MEA板3次，每次5分钟以清洁表面；随后用75%乙醇清洗5分钟，再用100%乙醇清洗5分钟以灭菌。</li>
	<li>将MEA板倒置放入烘箱中，在50 °C下烘烤4–5小时，完成灭菌过程。</li>
	<li>向每孔加入500 µL 0.2%聚乙烯亚胺溶液（PEI），室温孵育1小时。吸除PEI后，用无菌蒸馏H2O洗涤4次。在生物安全柜中过夜风干。</li>
	<li>用L15培养基配制20 µL/mL的层粘连蛋白溶液，向每孔中心加入10 µL层粘连蛋白。 
	注意：避免涂覆周围的参考电极和接地电极。</li>
	<li>向周围储液槽中加入无菌dH2O，防止培养基或层粘连蛋白蒸发。将MEA板置于37 °C孵育1小时。</li>
	<li>将SFEBs（见第1和第2节）轻轻吸入宽口移液枪头中，转移至已包被层粘连蛋白的MEA板中。每孔加入200 µL DM2培养基，在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下过夜孵育。</li>
	<li>24小时后额外添加200 µL培养基，在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下恢复30分钟，然后进行记录。</li>
	<li>将MEA板放入预热至37 °C的板式记录仪中，记录神经元活动。使用配套的MEA记录软件连续记录10分钟的神经元活动。详见参考文献19。</li>
	<li>使用统计分析软件生成原始数据——包括神经元活动的连续信号流和点阵图19。 
	注意：MEA记录在SFEB接种后第7天进行。本研究中记录时长为10分钟，用于检测网络簇状放电活动、连续轨迹和点阵图。SFEB可在MEA板上长期维持，并可在环境控制条件下进行更长时间的记录（图6）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文所述方案提供了将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为类前脑皮层早期发育阶段的三维结构的条件。该方法所获得的结构既可用于电生理学研究，也适用于显微成像。最终形成的悬浮脑类器官（SFEB）在形态上类似于脑组织切片培养物，可实现高质量的共聚焦显微详细成像。本方案可成功利用成纤维细胞和外周血单个核细胞来源的hiPSC生成SFEB。由外周血单个核细胞来源的hiPSC所生成的SFEB在形态学特征上与成纤维细胞来源的hiPSC生成的SFEB相似。
该过程与其他三维培养方案类似，利用小分子细胞外信号来引导细胞命运的决定。同时结合了细胞间接触的内在特性，从而为神经网络的形成和神经元功能提供了更为真实的环境。已有研究报道表明，适当组合的小分子细胞外信号足以诱导特定的细胞命运决定，例如中脑多巴胺能神经元8,22以及皮层中间神经元8,16,<sup...

我们此前报道过一种源自患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）的三维模型系统，该系统可重现早期皮层网络发育的某些方面1该三维模型是一种无血清拟胚体（SFEB），在以往简单的hiPSC聚集模型基础上进行了改进2,3越来越多的研究表明，类似于我们所用的SFEBs的三维结构，能够近似再现通常观察到的神经发育的某些特征 体内 且早于在二维（2-D）/单层 hiPSC 模型中观察到的时间点4,5早期研究主要集中在三维结构的自组织复杂性上，尚未展示其生理复杂性。2.
本方案已应用于由成纤维细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）衍生的未分化人诱导多能干细胞（hiPSCs）。这些细胞培养在经γ射线照射的小鼠胚胎饲养层细胞（MEFs）上。人工清除hiPSC克隆中自发分化的细胞后，通过酶法收获细胞，并重悬于含有Rho激酶抑制剂Y-27632（ROCKi）的培养基中。未分化的hiPSCs经解离和离心处理后，转移至96孔低吸附V型底培养板中。接种后，采用双SMAD抑制法（SB431542、LDN193189联合dickkopf 1（DKK-1））启动神经诱导，以促进前额前脑神经元谱系的分化6。14天后，将SFEBs转移至6孔板中的细胞培养插入式小室中。转移后，圆形的SFEBs开始延展并变薄，同时维持局部的神经网络连接，这一现象在使用类似细胞培养插入式小室制备的海马体器官型脑片培养中也常被观察到1,7。
采用基于SFEB的三维培养平台可高效生成皮层神经网络，适用于基于细胞的生理学检测，如钙成像，或电生理学检测，如单细胞记录或多电极阵列（MEA）分析1。尽管三维系统具有早期皮层发育的标志特征，但其他研究显示，这些三维结构可能需要更长的孵育时间，以适应人类组织发育固有的较慢进程8。该SFEB方案可成功从未分化的hiPSCs诱导生成三维SFEBs，模拟皮层早期发育的若干特征。
SFEBs 在模拟神经系统疾病中网络异常方面的潜力是该系统的一大优势。源自患者组织的 hiPSCs 可分化为神经系统细胞，并用于开展与细胞生物学及同步基因表达相关的检测。目前，人类 iPSCs 正被用于解析患有自闭症谱系障碍（ASD）、精神分裂症等病因复杂的多种神经系统疾病的大规模人群的遗传特征9，Rett综合征10，以及阿尔茨海默病11,12直到最近，iPSC 模型通常为单层培养体系，尽管其在评估分子相互作用方面具有优势，但在解析所见的复杂细胞间相互作用方面则显得不足 体内动物模型一直是重建全器官平台的默认替代方案。然而，这些动物模型存在研究结果转化率低的问题，并且难以复制大规模基因筛查研究中发现的人类基因谱型。因此，利用诱导多能干细胞（iPSCs）开发三维系统，为人类疾病建模增添了必要的复杂性层次。13,143D hiPSC 平台的下一步是满足基于细胞检测的高通量筛选对大规模培养的需求15.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;SFEB 神经元分化细胞培养基。试剂。组分&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 神经诱导培养基（hiPSC 培养基）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM 培养基（MEF 培养基）</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM1 培养基组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x)，含 Glutamax 液体，1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液 10 mM (100x)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 (1,000x)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM2 培养基组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x)，含 Glutamax 液体，1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100x)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM3 培养基组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL 培养基 (1x)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A）(50x)，液体</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小分子&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &amp;mu;M)</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td>1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;重组蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组分/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养插件 0.4 &amp;mu;M，30 mm 直径</td><td>Millicell</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 V 型底板（带盖）</td><td>Evergreen</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5（核标记物）</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA 板</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 孔平底板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

尽管有多种 体外 已利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立疾病模型，但其中一个局限在于，这些二维（2-D）体系可能无法充分反映携带疑似致病变异个体中所存在的细胞结构和功能复杂性。传统的2-D模型仍是对真实情况不完整的再现 体内类结构，且无法充分反映大脑的复杂性。因此，迫切需要开发更多基于三维人诱导多能干细胞（hiPSC）的模型，以更真实地模拟大脑中细胞间的相互作用和功能表现 体内 系统
本文报道了一种基于无血清拟胚体（SFEB）技术，由未分化的人诱导多能干细胞（hiPSCs）构建三维（3-D）培养体系的实验方案。该三维模型可模拟腹侧化新皮质发育过程中的若干特征，适用于研究活体神经细胞及完整组织中的关键功能，如细胞迁移、连接性、信号传导以及成熟过程。具体而言，我们证明了采用本方案生成的SFEB可通过生理相关性强且信息含量高的基于细胞的功能检测方法进行分析，例如钙成像和多电极阵列（MEA）记录，而无需进行冷冻切片处理。在MEA记录中，我们发现SFEB在长期培养过程中，其尖峰放电活动和网络层面的簇状放电活动均显著增强。该SFEB方案为研究三维模型中神经网络的发育形成提供了一个稳定且可扩展的系统，能够再现早期皮质发育的关键特征。

采用本实验技术培养的SFEBs所获得的组织具有类似早期发育皮质下室下区的形态学特征，其中含有大量Tuj1阳性神经元以及神经前体细胞（图3A）。在SFEB的外层和内层均观察到多个正在发育的皮质样玫瑰花结构（图3B）。SFEB的外缘类似于正在发育的皮质板，含有终末分裂后的神经元。这一特征由Brn2的表达所支持，Brn2是发育中最腹侧皮质外层神经前体细胞的标志物。在SFEB中还可观察到表达Reelin的细胞，这些细胞可能是Cajal-Retzius细胞或其前体细胞，通常存在于发育中皮质的外层（图3C）。采用本方案培养的SFEBs表达的标志物特征提示其来源为混合性的尾侧神经节隆起（CGE）和内侧神经节隆起（MGE）。在培养物中可观察到表达CGE标志物Couptf2的细胞，以及表达MGE标志物Nkx2.1的其他细胞（图3D）。这一现象可能部分归因...

本文报道了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立三维（3-D）培养体系的方案，称为无血清拟胚体（SFEB）。该三维模型可类似于器官型脑片培养，用于模拟人类大脑皮层发育过程，并对发育中的神经环路进行生理学研究。

尽管已利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）开发出多种体外疾病模型，但其中一项局限在于这些二维（2-D）系统可能无法……

本方案针对3D人iPSC无血清拟胚体的总体目标是提供一种体外系统，以模拟人类早期皮层发育过程，可用于药物发现。该方法有助于回答干细胞领域的一些关键问题，例如神经元如何从iPSCs衍生而来，并在3D组织中形成功能性神经网络。该技术的主要优势在于，它使我们能够在培养皿中模拟皮层发育的某些方面，所用人类组织含有疾病个体的遗传背景，因此该系统可作为基于细胞的药物筛选平台，具有可扩展性，并可用于研究多种不同的神经生物学疾病。尽管该方法可为神经生物学或神经发育障碍提供研究线索，但也适用于其他系统，例如专注于神经免疫功能或神经信息模型的研究。本实验方案首先需建立胎儿细胞。为建立该培养体系，将600,000个胎儿细胞接种至6孔板的每一孔中，每孔加入300毫升培养基。将胎儿细胞培养 48 小时后，更换培养基。在准备干细胞的同时，将培养板孵育 1 小时。在 37 摄氏度水浴中解冻干细胞。待细胞解冻后，将其转移至15毫升锥形管中，并以培养基滴加至总体积为5毫升。随后，将细胞在4分钟内轻柔离心，吸除上清液，并将沉淀物在含有ROCK抑制剂的1毫升干细胞培养基中轻柔重悬。在测定细胞密度后，将300,000个干细胞接种至饲养细胞层上。随后培养并扩增细胞，定期挑选状态良好的细胞，并在扩增后冻存细胞以备备份。将干细胞克隆在标准培养板上培养，直至其融合度达到50%至70%。然后，采用温和的酶处理方法，并用1 mL移液器枪头轻轻吹打，以收获hiPSCs用于神经前体细胞的分化。轻轻离心悬浮液，吸除上清液，并将沉淀重悬于5 mL人iPSC培养基中。然后，将细胞悬浮液转移至经0.1%明胶包被的5 cm细胞培养皿中，孵育1小时。1小时后，将未贴壁的细胞转移至15 mL离心管中。然后用 3 毫升培养基轻轻冲洗培养板，并将其转移至同一离心管中。接着，通过轻柔离心重复重悬步骤，随后测定细胞密度，并将细胞以每孔 9,000 个细胞的密度接种至 96 孔低吸附 V 型底培养板中。现在，将培养板离心 3 分钟，然后开始培养细胞。在接下来的14天内，每隔一天用新鲜的分化培养基一更换一半的培养液。培养细胞两周后，准备六孔板，每孔中放入40微米的细胞培养小室，并加入1毫升DM1培养基。在接种培养的细胞之前，先将六孔板孵育至少4小时。接下来，使用200微升宽口移液枪头，收集约含20微升培养基的两周龄细胞聚集体。将4至6个聚集体转移至每个插入膜上，尽量减少溶液量，并去除多余的培养基。在此步骤中，需快速且稳定地操作；当去除SFEBs周围的培养基时，由于表面张力的作用，可能会观察到SFEBs在溶液中移动。移除培养基后可以重新调整其位置。待所有类器官接种到插入式培养小室后，更换为1毫升DM2培养基，并每隔一天继续培养细胞，每次更换四分之三的新鲜培养基。培养14天后，开始向培养物中添加DM3培养基。继续培养16天以生长SFEBs。现在使用200微升宽口吸头轻轻将SFEBs从插入物上分离。将SFEBs转移至12孔板中，每孔接种4到8个。然后按照文本方案中所述进行染色。在准备12孔板和8孔板时，应先用无菌水洗涤三次。然后，先用75%乙醇洗涤一次，再用100%乙醇洗涤一次。接着，将培养板倒置，在50摄氏度下烘烤四到五小时，以完成灭菌过程。烘烤后，向每孔中加入500 µL的0.2% PEI溶液，并在室温下静置一小时。然后，吸除PEI溶液，用无菌蒸馏水洗涤各孔四次，并在空气中过夜晾干。次日，用L15培养基配制新鲜的层粘连蛋白溶液，每孔中心加入10 µL。随后，在周围储液槽中加入蒸馏水以防止蒸发，并将培养板在37°C孵育1小时。确保将神经组织块置于电极中心位置，注意不要超出接地电极的范围；若超出该范围，神经元将生长至接地电极上，导致噪声伪迹并影响记录的保真度。随后，使用宽口移液管通过轻柔抽吸的方式将一个预先制备好的SFEB加入每个孔中。然后，向每孔加入200 µL的DM2培养基，并将培养板过夜培养。随后，为了记录神经活动，将培养板放入酶标仪中，预热至 37 摄氏度，然后使用软件记录每个孔 10 分钟的活动数据。SFEB采用所述方法培养，所得组织具有类似早期发育皮质下室带的形态学特征，富含大量Tuj1阳性神经元以及神经前体细胞。在类体的外层和内层均观察到众多正在发育的皮质玫瑰花环结构。类体的外缘类似于正在发育的皮质板，含有终末分裂后的神经元，这一特征由Brn2的表达所支持，Brn2是神经前体细胞及最腹侧外层皮质的标志物。外层还含有Reelin阳性细胞，这些细胞可能是偶然的gratzel细胞或其前体细胞。这些细胞还表达了与混合的尾侧和内侧神经节隆起来源一致的标志物，该结论基于cooked TF2和Nkx2.1标志物的表达。培养的SFEBs可生成CalR和CalB双阳性的中间神经元，以及VGLUT阳性的兴奋性神经元和Tbr1阳性的谷氨酸能神经前体细胞。与其他报道一致，来自类脑体的细胞中，61%为VGLUT阳性，43%为Tbr1阳性。从脑类器官体部记录的MEM信号可长时间获取，记录结果展示了皮层网络水平簇状放电活动的发展过程。观看本视频后，您应能够充分理解如何从人iPSCs培养SFEBs，利用NSFEBs对惩罚性发育中的皮层玫瑰花结结构进行神经胚层内容表征，并对成熟中的SFEBs进行神经生理学检测。通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为需要一定的时间和实践才能掌握诱导性多能干细胞（iPSCs）的培养特性以及iPSC向神经元分化的相关技术。培养的细胞应每天进行观察和监测。在完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法（如钙成像）来回答更多科学问题，例如药物处理对皮层神经网络振荡可能产生的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

开发HiPSC衍生的无血清胚胎体用于使用生理相关测定的3-D干细胞培养物的询问

视频生物信息学是对从显微视频中提取的生物时空数据进行自动化处理、分析、理解及数据挖掘的技术。本文旨在展示一种利用视频生物信息学方法测量人类胚胎干细胞集落生长的方法。...

人类胚胎干细胞集落生长的视频生物信息学分析

本研究详细阐述了用于培养和诱导多能干细胞分化的三维纤维蛋白支架的制备方法。此类支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞行为的影响，也可进行改造以包含药物递送系统。...

用于干细胞培养应用的3D纤维蛋白支架的制备

该视频介绍了使用不同无血清分化培养基（DM）从神经前体细胞培养无血清拟胚体（SFEBs）的操作步骤。DM-2 有助于神经元的成熟和有序排列，从而形成 SFEBs，而 DM-3...

无血清胚胎体的建立与维持

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本实验方案介绍了一种制备具有不同刚度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶的方法，该水凝胶可选择性地接枝或不接枝寡肽，用于研究生物材料刚度对干细胞分化与增殖的影响。通过调节交联时间来控制水凝胶的刚度。...

无饲养层条件下于不同硬度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶上培养人多能干细胞

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

可将细胞外基质配体图案化修饰到聚丙烯酰胺水凝胶上，从而在柔性的基底上实现人胚胎干细胞在限定区域内的克隆培养。该方法可与牵引力显微镜技术及生物化学检测相结合，用于研究组织几何形态、细胞自身产生的力学力与细胞命运决定之间的相互作用。...

在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

类器官已成为疾病建模的重要工具。在类器官生成过程中，细胞外基质（ECM） 可引导细胞命运，使用与天然组织相似的系统能够提高模型的准确性。本研究比较了人诱导多能干细胞来源的肠类器官在动物源性细胞外基质与无异源成分水凝胶中的生成情况。...

用于人干细胞维持与肠道类器官生成的基底膜基质比较研究

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。...

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

学习利用hiPSC构建无血清胚胎体三维培养系统，模拟人类早期皮层发育过程。该方法为药物筛选和神经生物学研究提供了可扩展的细胞平台。

开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

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