Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

该方案对 3D 人类 iPSC 无血清胚状体的总体目标是提供一个近似人类早期皮层发育的体外系统，可用于药物发现。这种方法可以帮助回答干细胞领域的关键问题，例如，神经元如何从 iPSC 衍生，在 3D 组织中形成功能网络。这项技术的主要优点是，它允许我们从包含患病个体遗传学的人体组织中对培养皿中皮层发育的各个方面进行建模，因此该系统用作基于细胞的药物筛选平台，该平台具有可扩展性，可用于研究许多不同的神经生物学疾病。

虽然这种方法可以提供对神经生物学或神经发育障碍的见解，但它也可以应用于其他系统，例如那些专注于神经免疫功能或神经信息模型的系统。对于此协议，从建立胎儿细胞开始。为了建立这种培养物，将 600， 000 个胎儿细胞接种到六孔板的每个孔中，每孔 300 毫升培养基。

将胎儿细胞培养 48 小时后，更换培养基。在准备干细胞的同时，将板孵育一小时。在 37 摄氏度的水浴中解冻干细胞。

解冻后，将细胞转移至 15 mL 锥形管中，并在试管中加入逐滴添加培养基至 5 mL。接下来，轻轻离心细胞 4 分钟，吸出上清液，然后将沉淀轻轻重悬于 1 毫升含 ROCK 抑制剂的干细胞培养基中。定量细胞密度后，将 300， 000 个干细胞接种到饲养层细胞上。

然后生长和扩增培养物，扩增后定期选择健康细胞并冷冻细胞作为备份。在标准平板上培养干细胞集落，直到它们达到 50% 至 70% 汇合。然后，使用温和的酶处理并用 1 毫升移液器吸头轻轻研磨，以收集用于神经前体细胞分化的 hiPSC。

轻轻离心悬浮液，吸出上清液，然后将沉淀重悬于 5 mL 人 iPSC 培养基中。然后，将细胞悬液转移至 0.1% 明胶包被的 5 cm 细胞培养皿中，并在平板上孵育 1 小时。一小时后，将非贴壁细胞转移到 15 mL 离心管中。

然后用 3 毫升培养基轻轻冲洗板并将其转移到同一管中。接下来，通过温和离心重复重悬步骤，然后测定细胞密度并将细胞以每孔 9， 000 个细胞的速度接种到 96 孔、低粘附力 V 底板中。现在，旋转板 3 分钟并开始培养细胞。

在接下来的 14 天内，每隔一天用新鲜的差异化培养基更换半份培养基。细胞培养两周后，准备 6 个孔板，其中包含 40 微米细胞培养小室和 1 毫升 DM1 培养基。在加入培养的细胞之前，将这些板孵育至少 4 小时。

接下来，使用 200 微升广口移液器吸头，收集价值约 20 微升培养基的两周龄细胞聚集体。将 4 到 6 个聚集体转移到每个插件上，使用最少的溶液，去除多余的部分。在此步骤中，重要的是要用手快速、稳定地工作，同时从 SFEB 周围去除介质，您可能会看到 SFEB 由于表面张力而在溶液中移动。

在移除介质后，可以重新定位它们。将所有聚集体加载到插入片段上后，将培养基更换为 1 mL DM2，并继续每隔一天培养细胞。用新鲜培养基替换四分之三的培养基。

培养 14 天后，开始向培养物中加入 DM3 培养基。继续培养 16 天以培养 SFEBs。现在使用 200 微升广口移液器吸头轻轻地将 SFEB 从插件上分离。

将 SFEB 转移到 12 孔板中，每孔加载 4 到 8 个。然后，将它们染色为文本协议中的轮廓。要制备 12 孔板和 8 块板，请先用无菌水洗涤 3 次。

然后，使用 75% 乙醇洗涤一次，然后用 100% 乙醇再洗涤一次。然后，将板子在 50 摄氏度下倒置烘烤 4 到 5 小时，以完成灭菌过程。烘烤后，向每个孔中加入 500 微升 0.2% PEI 溶液，让板在室温下静置一小时。

然后，吸出 PEI 并用无菌蒸馏水洗涤孔四次，并风干过夜。第二天，在 L15 培养基中制备新鲜的层压剂，并向每个孔的中心添加 10 μL。然后，将蒸馏水加入周围的储液槽中以防止蒸发，并将板在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

确保将层压板光束到电极中心，注意不要超过接地电极的空间，如果超过这个空间，神经元会在接地电极上生长，导致噪声伪影并影响录音的保真度。现在，将一个准备好的 SFEB 添加到每个孔中，用大口径移液器轻轻吸力。然后，向每个孔中加入 200 μL DM2 并将板培养过夜。

稍后，要记录神经活动，请将板放入读板器中。将其预热至 37 摄氏度。然后，使用该软件记录每个孔 10 分钟的活动。

SFEB 是使用所描述的方法生长的，产生的组织具有形态学特征，类似于早期发育的皮质脑室下区，充满了广泛的 Tuj1 阳性神经元以及神经祖细胞。在身体的外层和内层观察到许多发育中的皮质玫瑰花结。身体的外缘类似于包含有丝分裂后神经元的发育皮质板，这得到了 Brn2 表达的支持，Brn2 是神经祖细胞和最腹侧化的外皮层的标志物。

外层还包含 Reelin 阳性细胞，这些细胞可能是临时的 gratzel 细胞或其祖细胞。这些小体还表达了与混合 codal 和 medial ganglionic immenants 起源一致的标志物。基于煮熟的 TF2 和 Nkx2.1 标记物的表达。

培养的 SFEBs 在 CalR 和 CalB 阳性神经元间产生。以及 VGLUT 阳性兴奋性神经元和 Tbr1 阳性谷氨酸能神经祖细胞。与其他报告一致，来自体内的细胞中有 61% 为 VGLUT 阳性，43% 为 Tbr1 阳性。

从身体制成的 MEM 记录可以长时间拍摄，记录显示皮层网络水平爆发的发展。看完这个视频，你应该对如何从人类 iPSC 中培养 SFEBs，用 NSFEB 表征惩罚性发育的皮质玫瑰花结的神经内容有一个很好的了解。并对成熟的 SFEB 进行神经生理学测定。

一般来说，刚接触这种方法的个体可能会很困难，因为需要时间和实践来开发必要的科学领域，以便 iPSC 的行为和 iPSC 到达培养中的神经元。应每天监测培养的细胞。在此程序之后，可以进行其他方法，如钙成像，以回答其他问题，例如，药物治疗可能对皮质网络振荡产生什么影响。