通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

这些方法的总体目标是实现对小干扰RNA介导的基因沉默效率的预测，并以时空可控的方式调控目标蛋白的表达水平。该方法可阐明结构与功能之间的关系，以及响应刺激的递送载体。更好地调控结合与释放过程，将有助于开发可转化的平台和药物发现，以及再生医学技术。

该技术的主要优势在于，基于简单的siRNA释放实验和动力学建模，能够对基因表达的变化进行控制和预测。尽管这些方法采用了新型的光响应性聚合物，但这一系列实验方案可轻松适用于测试多种其他刺激响应系统。首先，通过将siRNA加入pH为6的20微摩尔HEPES溶液中，制备浓度为32微克每毫升的siRNA溶液。

然后，通过将溶解的 mPEG-b-polyAPN BMA 聚合物加入 pH 为 6 的 20 毫摩尔 HEPES 溶液中，制备聚合物溶液。为达到每毫升 220 微克的浓度，该浓度将产生 4 的 N/P 比值，即聚合物上的胺基数量是 siRNA 上磷酸基团数量的 4 倍。接下来，在涡旋仪上轻轻混合的同时，将聚合物溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中。

加入聚合物后继续涡旋30秒。然后将样品在室温下避光孵育30分钟。在涡旋仪上轻轻混匀的同时，将STS溶液逐滴加入各纳米载体溶液中。

加入SDS后继续涡旋30秒。将样品在3,000 G下离心5秒，然后将样品在室温下避光孵育30分钟。校准并设置带有365纳米滤光片的紫外激光器，使其强度为200瓦特每平方米。

接下来，将一个橡胶垫片打孔，然后将该橡胶垫片放置在已清洗并干燥的载玻片上。用移液器将纳米载体SDS溶液滴加到橡胶垫片孔洞内的载玻片表面。将过量的溶液加载到载玻片上，注意避免与橡胶垫片接触。

将第二片载玻片置于滑动垫圈上方。为避免产生气泡，先将载玻片一端轻轻放下，再缓慢放下另一端。在玻璃腔室两侧各夹上一个长尾夹，以固定密闭。

使用带有365纳米滤光片的紫外激光，以200瓦特每平方米的强度照射样品所需的时间。取下文件夹夹子并打开腔室。接着，用移液器将25微升经照射的纳米载体SDS样品加入微型离心管中。

在室温下避光孵育溶液30分钟。向每种纳米载体SDS样品25微升中加入5微升上样缓冲液。在室温下避光孵育样品10分钟。

然后，将每种纳米载体 SDS 样品各 30 微升加入 2% 琼脂糖凝胶中，凝胶预先用溴化乙锭染色。在黑暗条件下以 100 伏电压电泳运行 30 分钟。使用配备溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像。

保存凝胶图像文件，并按照文本方案中所述进行条带强度定量分析。取下双面粘性垫片上的纸片，暴露粘性表面，将垫片贴附到玻璃盖玻片上。

将纳米载体SDS溶液用移液器滴加到盖玻片上。然后，将一块预先清洗过的载玻片置于盖玻片上方，使粘附垫片上的孔洞对准样品中心。轻压载玻片，确保载玻片与盖玻片紧密贴合并形成密封。

使用共聚焦显微镜配备40倍水浸、消色差物镜（数值孔径为1.2）进行FCS测量。针对每个样本，使用适当的激发激光通道，采集至少30次测量数据，每次持续10秒。随后，将FCS获得的siRNA释放数据输入动力学模型，以预测基因沉默响应，具体操作详见文本方案。

为进行体外 siRNA 递送，首先向六孔板的每个孔中加入 2 毫升细胞悬液。将细胞置于培养箱中孵育 24 小时，使其贴壁并恢复。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，加入 1.5 毫升无血清且不含抗生素的转染培养基，以准备进行转染。

随后，向每个孔中加入 25 微升含有 30 皮摩尔 siRNA 的纳米载体溶液。轻轻吹打培养基混匀。将细胞放入培养箱中孵育 3 小时。

移除转染培养基，用 PBS 洗涤每个孔。然后，每孔加入 1 毫升添加补充物的生长培养基，将细胞放入培养箱中恢复 30 分钟。为准备对细胞进行光刺激处理，移除添加补充物的生长培养基。

然后，向每个孔中加入一毫升转染培养基。按照文本方案中所述校准紫外激光器后，将细胞置于设定为37摄氏度的加热板上。取下六孔板的盖子。

使用波长为365纳米、强度为200瓦特每平方米的紫外激光，从培养板上方对细胞照射所需时间。移除转染介质，加入2毫升添加了补剂的生长培养基。将细胞置于培养箱中，直至进行后续分析。

为了制备一种能够完全阻挡365纳米光并最大限度减少反射的光掩模，首先将所需形状切割、冲孔或加工到光掩模上。将光掩模粘附在六孔板底部，使图案居中对准含有细胞的孔，且防反射面朝向板面。设置两个相距约25米的铁架台，并在每个铁架台上安装一个平台，使两个平台处于相同高度。

将细胞板置于两个支架之间，使其底部平台支撑细胞板。使用波长为365纳米滤光片的紫外激光，以200瓦特/平方米的强度从样品下方照射细胞，持续所需时间。移除转导介质，加入2毫升添加补充物的生长培养基。

然后，将细胞置于培养箱中孵育至少24小时以恢复。按照之前所述方法，使用荧光显微镜对细胞进行成像。此处展示的是基因沉默动力学的简单动力学建模示例。

该模型用于预测光诱导siRNA释放后，mRNA、蛋白质和siRNA浓度随时间变化的情况。不同光照剂量下释放的siRNA相对量被作为初始siRNA浓度输入动力学模型。模型预测得到的蛋白表达水平与通过Western印迹实验测定的表达水平相符。

为了进行可视化观察，将表达GFP的细胞用靶向GFP的siRNA处理，并在照射前于培养板上放置环形光掩膜，以形成圆形图案。被光掩膜保护而未受光照的细胞，其荧光强度与未经siRNA和光照处理的对照样本无明显差异。然而，圆形图案内的几乎所有细胞均未表现出GFP表达，表明siRNA有效释放并实现了基因沉默。

此外，利用光作为触发手段可实现基因表达的调控，并在细胞尺度上进行控制。总之，该方法能够快速确定辐照条件，以实现siRNA释放的时空控制，并可预先预测基因沉默效果。采用本方案将有助于阐明调控纳米载体稳定性和功效的结构-功能关系。

该技术可能在再生医学中具有应用前景，可实现对基因表达的时间-空间控制。这些制剂也适用于治疗局部疾病，例如皮肤癌以及皮肤病。