通过从光响应聚合物纳米载体的siRNA释放的时空控制预测基因沉默

这些方法的总体目标是无法预测小干扰 RNA 介导的基因沉默效率，并促进以时空方式控制所得的蛋白质表达水平。这种方法可以阐明结构功能关系并刺激响应性递送载体。更好地控制结合与释放，可以解锁可转化平台和药物发现，以及再生医学技术。

该技术的主要优点是可以在碱基上控制和预测基因表达的变化，作为简单的 siRNA 释放测定和动力学建模。尽管这些方法采用了新型光响应聚合物，但这组分析可以很容易地适应测试各种其他刺激响应系统。首先，将 siRNA 添加到 pH 值为 6 的 20 微摩尔 HEPES 溶液中，制备 32 μg/mL 的 siRNA 溶液。

然后，通过将溶解的 mPEG 嵌段 polyAPN BMA 聚合物添加到 pH 值为 6 的 20 毫摩尔 HEPES 溶液中来制备聚合物溶液。要达到 220 μg/mL 的浓度，该浓度将导致 N 与 P 比率为 4，这意味着聚合物上的胺基数量是 siRNA 上磷酸基团的四倍。接下来，将聚合物溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中，同时在涡旋机上轻轻混合。

添加聚合物后继续涡旋 30 秒。然后，将样品在室温下避光孵育 30 分钟。将 STS 溶液逐滴添加到每个纳米载体溶液中，同时在涡旋机上轻轻混合。

SDS 版后继续涡旋 30 秒。将样品以 3， 000 Gs 离心 5 秒钟，然后在室温下避光孵育样品 30 分钟。校准带有 365 纳米滤光片的紫外激光器并将其设置为每平方米 200 瓦的强度。

接下来，在橡胶垫圈上切一个孔，将橡胶垫圈放在清洗和干燥的载玻片上。将纳米载体 SDS 溶液移液到橡胶垫圈孔内的载玻片上。将过量的溶液加载到载玻片上，同时避免与橡胶垫圈接触。

将第二个载玻片放在载玻片垫片的顶部。为避免产生气泡，请先将载玻片的一端放下，然后慢慢放下另一端。将活页夹连接到玻璃室的每一侧以使其紧固。

使用带有 365 纳米滤光片的紫外激光器以每平方米 200 瓦的强度照射样品所需的时间长度。取下活页夹并打开腔室。接下来，将 25 微升辐照的纳米载体 SDS 样品移液到微量离心管上。

将溶液在室温下避光孵育 30 分钟。将 5 微升上样缓冲液添加到 25 微升每个纳米载体 SDS 样品中。将样品在室温下避光孵育 10 分钟。

然后，将 30 μL 每个纳米载体 SDS 样品加载到 2% 琼脂糖凝胶中，用溴化乙锭预染。在 100 伏特的黑暗中运行凝胶 30 分钟。使用带有溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像。

保存凝胶图像文件并继续按照文本协议中的说明进行弯曲强度定量。从双面胶粘剂垫片上取下纸片，露出胶粘剂表面。将垫片安装到玻璃盖玻片上。

将纳米载体 SDS 溶液移液到盖玻片上。然后，将预清洗的载玻片放在盖玻片的顶部，上面有粘合剂垫片上的孔，以样品为中心。推动载玻片，确保载玻片和盖玻片连接良好并形成密封。

使用具有 40 倍水浸式全色差物镜的共聚焦显微镜，数值孔径为 1.2 进行 FCS 测量。使用适当的激发激光通道，每个样品至少收集 30 次测量，每次 10 秒。然后，将来自 FCS 的 siRNA 释放数据输入动力学模型以预测基因沉默反应，如文本方案中所述。

要制备体外 siRNA 递送，首先向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 细胞悬液。让细胞粘附并在培养箱中恢复 24 小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞后，通过添加 1.5 毫升血清和无抗生素的横流培养基准备它们进行横流。

接下来，加入 25 μL 纳米载体溶液，每孔含有 30 皮摩尔的 siRNA。轻轻上下移液介质以混合。将细胞放入培养箱中 3 小时。

取出横流培养基并用 PBS 洗涤每个孔。然后，加入 1 mL 添加的生长培养基，将细胞放入培养箱中恢复 30 分钟。为了准备细胞以进行光刺激处理，请去除补充的生长培养基。

然后，向每个孔中加入 1 毫升 Transvection 培养基。按照文本协议中的说明校准紫外激光器后，将细胞放在设置为 37 摄氏度的热板上。取下 6 孔板的盖子。

使用带有 365 纳米滤光片的紫外激光器以每平方米 200 瓦的强度照射细胞，从板上方照射所需的时间。去除横流培养基，加入 2 毫升补充的生长培养基。将细胞放入培养箱中，直至进一步分析。

要准备完全阻挡 365 纳米光并最大限度地减少反射的照片蒙版，首先将所需的形状切割、冲孔和/或加工到照片蒙版中。将光掩模粘在六孔板的底部，使图案居中于包含细胞的孔上，抗反射面朝向板。设置两个相距约 25 米的环形支架，并为每个环形支架拆下一个平台，使平台的高度相等。

通过将板放在平台顶部，将细胞板悬挂在两个支架之间。使用带有 365 纳米滤光片的紫外激光器，以每平方米 200 瓦的强度从样品下方照射细胞所需的时间。去除横流培养基，加入 2 毫升补充的生长培养基。

然后，将细胞放入培养箱中恢复至少 24 小时。如前所述，使用荧光显微镜对细胞进行成像。这里显示的是基因沉默动力学的简单动力学建模示例。

运行该模型以预测 mRNA 、 蛋白质和 siRNA 的浓度，作为光诱导 siRNA 释放后时间的函数。将不同剂量的光后释放的 siRNA 的相对量输入为动力学模型中的初始 siRNA 浓度。所得的蛋白质表达水平模型预测与通过 western blotting 获得的实验确定的表达水平一致。

为了可视化，用靶向 siRNA 的 GFP 处理表达 GFP 的细胞，并在照射前将环形光掩模放在板上以产生圆形图案。受光保护的细胞表现出的荧光强度与未用 siRNA 和光处理的对照样品难以区分。然而，环状模式内几乎所有细胞均未表现出 GFP 表达，表明 siRNA 释放和基因敲低效率高。

此外，光的使用是一种触发启用的基因表达，可以在细胞长度尺度上进行控制。总之，该方法能够快速确定辐照条件，以时空控制 siRNA 释放并先验预测基因沉默。采用该协议将有助于阐明控制纳米载体稳定性和功效的结构函数关系。

该技术可能使需要对基因表达进行时空控制的再生医学应用成为可能。这些制剂也非常适合治疗局部疾病，例如皮肤癌以及皮肤病。