Name: 通过从光响应聚合物纳米载体的siRNA释放的时空控制预测基因沉默 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 了解利用光响应嵌段共聚物实现基因沉默时空控制的方法。通过siRNA释放实验和动力学建模预测基因表达变化，为药物发现和再生医学提供可控平台。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所通过资助号为 P20GM103541 的机构发展奖（IDeA）以及资助号为 P20GM10344615 的项目提供的资金支持。本文所述内容并不代表 NIH 的观点。我们还感谢特拉华生物技术研究所（DBI）和特拉华州经济发展办公室（DEDO）通过生物科学先进技术中心（Bioscience CAT）奖项（编号：12A00448）提供的资金支持。

1. siRNA 纳米载体的制备
<ol>
	<li>分别配制等体积的 siRNA 和 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液，用 pH 6.0 的 20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸 (HEPES) 缓冲液稀释。
	<ol>
		<li>将 siRNA 加入 20 mM HEPES 溶液中，使其终浓度为 32 µg/mL。 
		注：本实验所用 siRNA 为非靶向性通用阴性对照序列；但也可根据需要设计为针对任何目的基因的 siRNA。</li>
		<li>将 mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物溶解于 20 mM HEPES 溶液中。加入适量 mPEG-b-P(APNBMA)，配制成 220 µg/mL 的溶液，使 N/P 比值（N 代表 mPEG-b-P(APNBMA) 上的胺基，P 代表 siRNA 上的磷酸基团）为 4。 
		注：mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物的合成方法已在其他文献中报道30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在涡旋振荡器上轻轻混匀的同时，将 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中。加完聚合物后继续涡旋振荡 30 秒。将样品置于室温避光条件下孵育 30 分钟。</li>
</ol>
2. 使用凝胶电泳检测 siRNA 释放
<ol>
	<li>根据步骤1.1-1.2制备纳米载体，并按所需样本数量相应扩大试剂体积。</li>
	<li>将纳米载体与十二烷基硫酸钠（SDS）混合。
	<ol>
		<li>配制1 mg/mL的SDS水溶液。分装所需量的SDS溶液，使所得溶液中S/P比值（S，SDS上的硫酸根基团；P，siRNA上的磷酸根基团）为15。 
		注意：如果聚复合物溶液含有 1 µg siRNA的 13 µg 需加入 SDS 以达到 15 的 S/P 比例。</li>
		<li>将SDS溶液逐滴加入每种纳米载体溶液中，同时在涡旋混合器上轻轻混匀。加入SDS后继续涡旋混合30秒。</li>
		<li>将样品在 3,000 x g 条件下离心 5 s。将样品在室温避光孵育 30 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准并设置带有365 nm滤光片的紫外激光器，使其强度为200 W/m²。确保从样品溶液底部所处位置测量光强度。</li>
	<li>将纳米载体/SDS 溶液加入由橡胶垫片隔开的载玻片构成的玻璃腔室中。
	<ol>
		<li>将载玻片在体积比为7:3的乙醇/水溶液中预清洗，然后彻底干燥。在橡胶垫片上切出一个孔（约2 × 3 cm的矩形）。将橡胶垫片置于载玻片上。</li>
		<li>将纳米载体/SDS 溶液用移液器滴加到橡胶垫圈孔洞内的玻片表面。加入过量溶液（20 µL 过量）滴加到玻璃载玻片上，同时避免接触橡胶垫圈。 
		注意：后续步骤中会损失部分液体。</li>
		<li>将第二张载玻片放置在载玻片-垫圈组件上方。为避免产生气泡，先将载玻片一端轻轻放下，再缓慢降低另一端。</li>
		<li>用回形针夹住玻璃室两侧，以保持其闭合状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>照射样品至所需时间（例如，0-60 分钟）使用波长为 365 nm 滤光片的紫外激光，强度为 200 W/m。移除回形夹并打开腔室。</li>
	<li>移液器 25 µL 将辐照后的纳米载体/SDS 样品加入微量离心管中。在室温下避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>制备含有预染的2 wt%琼脂糖凝胶 0.5 µg/mL 根据标准方案，在Tris/Borate/EDTA（TBE）缓冲溶液中使用溴化乙锭31. 配制体积比为3:7的甘油/水上样缓冲液。</li>
	<li>添加 5 µL 上样缓冲液溶液 25 µL 每种纳米载体/SDS 样品。将样品在室温下避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>加载 30 µL 将每种纳米载体/SDS样品加入2%琼脂糖凝胶中。在避光条件下以100 V电压电泳30分钟。使用配备溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统拍摄凝胶图像。保存凝胶图像文件，并进入步骤2.10进行条带强度定量。确保条带强度足够明亮以便清晰观察，但不可过强导致信号饱和。</li>
	<li>使用公开可用的 ImageJ 软件对条带强度进行定量分析32.
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 的 ROI 工具，通过在每条带周围绘制矩形来测定各泳道中游离 siRNA 条带的荧光强度。绘制每条泳道的强度曲线，并通过在强度曲线下方绘制一条水平线，然后点击封闭区域内的轮廓魔棒，对曲线下面积进行积分。</li>
		<li>通过将每个样本的曲线下面积除以siRNA阳性对照（无mPEG-）的曲线下面积，计算各泳道的相对强度b-P(APNBMA) 添加且未添加SDS。报告各样品中siRNA释放的百分比，以归一化的条带强度表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用荧光相关光谱法（FCS）测量siRNA释放
<ol>
	<li>获取在正义链5'端标记有单一荧光染料的siRNA。 
	注意：可购买预先退火且荧光标记位于所需位置的siRNA。荧光染料应具有光稳定性，并在450至750 nm范围内吸收/发射光，以避免紫外光淬灭以及与mPEG-b-P(APNBMA)之间的能量转移。</li>
	<li>根据步骤1.1–1.2使用标记的siRNA制备纳米载体。按所需样本数量同比例调整体积。</li>
	<li>将溶液在SDS中孵育，并根据步骤2.2–2.6进行指定时长的辐照。</li>
	<li>荧光相关光谱（FCS）样品池的制备。
	<ol>
		<li>用7:3（v/v）乙醇/水溶液清洗载玻片，并使用擦拭纸和气流彻底干燥玻璃表面。</li>
		<li>从双面胶粘性垫上移除保护纸，暴露双面胶粘性层，然后将其粘附到盖玻片上。</li>
		<li>用移液器将纳米载体/SDS溶液滴加至盖玻片上粘性垫孔洞中央位置。</li>
		<li>将载玻片置于盖玻片上方，轻压载玻片以确保载玻片与盖玻片紧密结合并形成密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜进行FCS测量33。采用数值孔径为1.2的40倍水浸式复消色差物镜，并使用适当的激发激光通道（488 nm），对每个样品至少采集30次、每次10秒的测量数据34。确保每个样品的激光强度和探测器校准保持一致。
	<ol>
		<li>除实验样品外，还需测量对照样品，包括：不含标记siRNA的空白样品；以及含有标记siRNA但不含mPEG-b-P(APNBMA)的游离siRNA样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用专用于FCS的数据分析软件进行分析。通过确定无纳米载体通过共聚焦检测体积时的稳定计数率，确定各样品的基线计数率29。
	<ol>
		<li>从每个样品的基线计数率中减去空白样品的计数率。将所得值归一化至游离siRNA对照组，以计算游离siRNA的百分比35。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 预测基因沉默的动态建模
<ol>
	<li>使用一组简单的常微分方程，通过数学编程语言创建预测基因沉默的脚本29。 
	注意：脚本可根据要求提供。
	<ol>
		<li>将常微分方程组写为： 
		<img alt="mRNA动态的基因表达方程；数学公式显示DNA与siRNA的相互作用。" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">     (1) 
		<img alt="蛋白质合成速率方程；d(蛋白质)/dt=k_prot[mRNA]-k_p,deg[蛋白质]；生化过程。" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">     (2) 
		<img alt="siRNA降解过程，微分方程，动力学，RNA稳定性分析方法" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3">     (3) 
		注意：对于方程1−3，kmRNA、ksiRNA和kprot分别为mRNA、siRNA和蛋白质生成的速率常数。km,deg、ks,deg和kp,deg分别为mRNA、siRNA和蛋白质降解的速率常数。降解速率常数根据各组分的半衰期计算，而生成速率常数则通过拟合，确保在无siRNA存在时达到mRNA和蛋白质的稳态值。
		<ol>
			<li>通过实验（如参考文献36所述）或文献资料确定目标基因的mRNA和蛋白质的半衰期（参见讨论部分）。同时确定细胞系的倍增时间。将这些值输入相应的降解速率表达式中。</li>
			<li>调节生成速率常数，使得在未引入siRNA的情况下，基因表达水平在归一化值100处保持稳定。具体而言，将[siRNA]设为零，并调整kmRNA、ksiRNA和kprot生成速率常数，直到[mRNA]和[蛋白质]在整个模拟过程中保持在初始归一化值100%的±1%范围内。</li>
			<li>利用先前所述的凝胶电泳和FCS实验中释放的siRNA相对量作为估计值，调整脚本中siRNA的初始相对浓度。具体而言，使[siRNA]与释放的siRNA相对量成正比，其中数值100对应最大释放量29。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞培养与 体外 siRNA 递送
<ol>
	<li>按照供应商提供的方案培养 NIH/3T3 小鼠胚胎成纤维细胞。
	<ol>
		<li>在生长培养基（含10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））中培养细胞。将细胞维持在 37 °C 在含5% CO₂的湿润环境中2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种于6孔组织培养处理板中。
	<ol>
		<li>按照供应商推荐的传代培养程序进行操作。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞用添加补充物的生长培养基稀释至浓度为75,000个细胞/mL。</li>
		<li>向6孔板的每个孔中加入2 mL细胞悬液（75,000个细胞/mL）。将细胞置于培养箱中孵育，贴壁并恢复24 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以准备转染，并加入1.5 mL无血清和抗生素的转染培养基（参见 材料清单) 加入每个孔中。</li>
	<li>根据步骤1.1-1.2配制siRNA纳米载体。加入 25 µL 向每孔加入含30 pmol siRNA的纳米载体溶液。轻轻吹打培养基以混匀。将细胞放入培养箱中孵育3 h。</li>
	<li>吸除转染培养基，用 PBS 洗涤每孔。每孔加入 1 mL 完全培养基，将细胞置于培养箱中孵育 30 分钟以恢复。</li>
	<li>为进行光刺激处理，需先移除添加了补剂的生长培养基，然后向每个孔中加入1 mL转染培养基（不含酚红）。 
	注意：确保转染培养基中不含酚红。</li>
	<li>校准并设置带有365 nm滤光片的紫外激光器，使其强度为200 W/m²。确保从细胞板底部所处位置进行光强测量。</li>
	<li>将细胞置于设定温度的加热板上 37 °C. 移去细胞培养板的盖子。使用配备365 nm滤光片、强度为200 W m⁻²的紫外激光器，从培养板上方对细胞照射所需时间（最长不超过20分钟）。-2.</li>
	<li>吸除转染培养基，加入 2 mL 补充完全的生长培养基。放入培养箱中孵育，待后续分析。例如，qPCR 为 24 小时，Western blotting 为 48 小时。
	<ol>
		<li>使用多种技术（如蛋白质印迹法）检测基因表达水平的变化37 和 qPCR。38 对于具有可见信号的基因（如 GFP），使用荧光显微镜观察29. 
		注意：建议使用这些技术是因为它们操作简便且在基因表达定量方面具有较高的准确性</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 以时空特异性方式调控基因沉默
<ol>
	<li>按照步骤 5.1–5.7 培养、接种并转染细胞。</li>
	<li>制备一种能完全阻挡365 nm光并最大限度减少反射的光掩模。 
	注意：本实验中，使用 10 cm × 10 cm 的铝箔片阻挡光线，使用黑色卡纸减少反光。将铝箔与黑色卡纸粘合在一起，形成一个整体单元。
	<ol>
		<li>使用锋利的刀片和打孔器分别在光掩模上切割或冲压出所需的形状。例如，用锋利的刀片切割出一条直线形图案（约5 cm长），用打孔器打出一个圆形图案（约7 mm直径）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将光掩模用胶粘在6孔板底部，使图案居中对准含细胞孔的下方，并确保带有抗反射面的一侧朝下例如，黑色 construction paper）朝向平板。确保胶水不涂抹在图案边缘附近（约3 mm以内）。</li>
	<li>将两个铁架台放置在相距约25 cm的位置，并在每个铁架台上安装一个平台，使两个平台高度相同。将细胞培养板置于两平台顶部之间并悬空架设，确保培养板水平。</li>
	<li>从样品下方使用配备365 nm滤光片的紫外激光以200 W/m²的强度照射细胞，照射时间根据需要设定（最长可达20分钟）。2.</li>
	<li>移除转染培养基，加入2 mL添加补剂的生长培养基。放入培养箱中孵育至少24小时以恢复细胞状态。按照所述方法使用荧光显微镜对细胞进行成像29.</li>
</ol>

<ol><li>Forbes, D. C., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+small+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of small RNA and DNA.</a> J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).</li>
<li>Bouchie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Companies+in+footrace+to+deliver+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Companies in footrace to deliver RNAi.</a> Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).</li>
<li>Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+Polymeric+Delivery+Systems+Amidst+a+Nucleic+Acid+Therapy+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Lett%22%5BJournal%5D)">Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance.</a> ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).</li>
<li>Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Delivery%3A+From+Lipids+to+Cell-penetrating+Peptides+and+Their+Mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics.</a> Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).</li>
<li>Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+drug+delivery+into+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Building drug delivery into tissue engineering.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).</li>
<li>Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+nanocarriers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery.</a> Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+polymers+and+nanomaterials+for+gene+delivery+and+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications.</a> Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).</li>
<li>Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+copolymer+solution+and+surface+assemblies+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications.</a> Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).</li>
<li>Weber, W., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biomedical+applications+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Emerging biomedical applications of synthetic biology.</a> Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Huschka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Gold+Nanoshell-Mediated+Delivery+and+Laser-Triggered+Release+of+Antisense+Oligonucleotide+and+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA.</a> ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).</li>
<li>Li, H. -J., Wang, H. -X., Sun, C. -Y., Du, J. -Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2014/ra/c3ra44866e#!divAbstract">Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery.</a> R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).</li>
<li>Braun, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Activated+Gene+Silencing+via+Gold+Nanoshell-siRNA+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates.</a> ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li>
<li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).</li>
<li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurements+and+rational+materials+design+for+intracellular+delivery+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides.</a> Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).</li>
<li>Mao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polyethylene+glycol+chain+length+on+the+physicochemical+and+biological+properties+of+poly%28ethylene+imine%29-graft-poly%28ethylene+glycol%29+block+copolymer%2FSiRNA+polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes.</a> Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).</li>
<li>Raab, R. M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+gene+silencing+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dynamics of gene silencing by RNA interference.</a> Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).</li>
<li>Cuccato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+RNA+interference+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling RNA interference in mammalian cells.</a> BMC Systems Biology. 5, 1(2011).</li>
<li>Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+synthetic+gene+delivery+vector+design+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties.</a> Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).</li>
<li>Chen, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+Dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET.</a> Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing+from+live-cell+and+live-animal+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).</li>
<li>Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Mediated+Activation+of+siRNA+Release+in+Diblock+Copolymer+Assemblies+for+Controlled+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing.</a> Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).</li>
<li>Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.6b00336">Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing.</a> ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).</li>
<li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+release%3A+photocleavable+cationic+diblock+copolymers+as+a+potential+platform+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery.</a> Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipid+Raft+Partitioning+of+Fluorescently-tagged+Probes+in+Living+Cells+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+%28FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS).</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Plasma+Membranes+of+Primary+Lymphocytes+Measured+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J Vis Exp. (120), e54756(2017).</li>
<li>Buyens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+disassembly+of+siRNA+polyplexes+in+serum+is+crucial+for+predicting+their+biological+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy.</a> J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).</li>
<li>Eden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+Half-Life+Dynamics+in+Living+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells.</a> Science. 331 (6018), 764-768 (2011).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad.+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Fluorescence+Monitoring+of+Rapid+Cycle+DNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification.</a> Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).</li>
<li>Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing-sequence-dependent+nucleic+acid+complexation+and+gene+transfer+efficiency+by+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine.</a> Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).</li>
<li>Liu, Y. M., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28glycoamidoamine%29s+for+gene+delivery%3A+Stability+of+polyplexes+and+efficacy+with+cardiomyoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells.</a> Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tuning+of+siRNA+dose+response+by+combining+mixed+polymer+nanocarriers+with+simple+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling.</a> Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该方法中有几个步骤尤为关键。在制备纳米载体时，组分添加顺序和混合速度是影响其效能的两个重要参数39。本方案要求将阳离子组分 mPEG-b-P(APNBMA) 在涡旋振荡条件下逐滴加入阴离子组分 siRNA 中。根据总体积的不同，该混合过程通常持续 3–6 秒。为检测纳米载体是否成功形成，可采用动态光散射等技术测定其粒径分布。当 N/P 比值为 4 时，mPEG-b-P(APNBMA)/siRNA 纳米载体的平均直径约为 140 nm，多分散系数约为 0.228。此外，可通过调节 N/P 比值获得不同尺寸和稳定性的聚合物复合物。本研究中选择 N/P 比值为 4，因为这是能够实现溴化乙锭染色完全阻滞和消除的最低比值。
该方法中的另一个关键参数是在siRNA释放实验中向纳米载体溶液中添加SDS。SDS是一种阴离子表面活性剂，用于更好地模拟含有高浓度脂质膜和多阴离子的细胞内环境29,<sup...

小干扰RNA（siRNAs）通过一种催化性RNA干扰通路介导转录后基因沉默，该通路具有高度特异性、高效性，并可针对几乎任何目的基因进行定制。1这些有前景的特性已推动siRNA疗法进入针对多种疾病（包括转移性黑色素瘤和血友病）的人体临床试验阶段。2,3然而，仍然存在显著的递送问题，阻碍了其转化应用4特别是递送载体必须保持稳定，并保护siRNA免受细胞外降解，同时还能将有效载荷释放到细胞质中5此外，许多RNAi应用需要更优的方法来在空间和时间上调控基因沉默6，这将减少siRNA治疗中的副作用7 并推动从用于药物发现的细胞微阵列到各类应用的变革性进展8 用于调控再生支架中的细胞反应9这些挑战凸显了开发新材料和新方法以更好地控制结合的必要性 与 siRNA 纳米载体中的释放
控制siRNA释放并增强时空调控的最有前景的策略之一是使用刺激响应性材料10。例如，已有多种生物材料被设计为可响应氧化还原电位或pH值的变化，或外加磁场、超声、光照等刺激，从而改变其对核酸的结合亲和力11。尽管这些系统中的许多已展现出对核酸活性更精确的控制，但以光作为触发信号尤为有利，因其具有瞬时的时间响应、精确的空间分辨率以及易于调节的特性12。此外，先进的可诱导启动子系统和光遗传学调控系统已证明光敏技术在调控基因表达方面的潜力；然而，这些系统仍面临诸多挑战，包括调控内源基因的能力有限、安全性问题（如免疫原性），以及多组分复合体系递送困难等13,14,15。光响应型siRNA纳米载体恰好能够克服这些缺点，为基因表达的时空调控提供一种更简单且更稳健的策略16,17,18。遗憾的是，目前仍缺乏准确预测蛋白敲降效果的方法。
一个关键挑战在于，对siRNA释放的定量评估十分罕见19,20，即使进行了此类评估，也未将其与siRNA/蛋白质周转动力学的分析相结合。所释放siRNA的量及其持续时间/寿命均是决定基因沉默动力学的重要因素；因此，缺乏此类信息导致了RNAi中剂量-效应关系准确预测的重大脱节21。解决这一挑战将加速纳米载体中结构-功能关系的建立，并为生物材料设计提供更明确的指导22。此外，此类方法将有助于开发更有效的siRNA给药方案。为了理解动态沉默响应，多个研究团队已探索了RNAi的数学模型23,24,25。这些模型成功揭示了siRNA介导的基因表达变化，并识别出限速步骤26。然而，这些模型仅应用于无法实现可控siRNA释放的商用基因递送系统（例如，Lipofectamine和聚乙烯亚胺（PEI）），且模型本身的复杂性严重限制了其应用价值27。这些不足凸显了对新型材料的需求：这类材料需能够实现siRNA释放的精确调控，并结合简化且易于使用的预测性动力学模型。
我们的方法通过整合一种光敏纳米载体平台与联用技术，以定量游离siRNA并模拟RNA干扰动态，从而应对上述所有挑战。特别是，该平台可精确控制siRNA的释放28 通过两种互补的方法进行监测，以准确定量包封的 与 游离siRNA。这些实验的数据被输入一个简单的动力学模型，以预测基因沉默效率 先验的29最后，这种纳米载体的开关特性可被轻易利用，以在细胞尺度上实现对基因表达空间分布的精确控制，从而生成特定的细胞表达模式。因此，该方法提供了一种易于调整的策略，可用于在多种需要时空调控细胞行为的应用中，实现对基因沉默的控制与预测。

<table><tbody><tr><td>siRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td>非靶向通用阴性对照</td></tr><tr><td>mPEG-b-P(APNBMA)</td><td>本实验室合成</td><td>N/A</td><td>光响应性聚合物</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>橡胶垫圈</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T21</td><td>0.5 mL 厚</td></tr><tr><td>紫外激光器&amp;nbsp;</td><td>Excelitas Technologies</td><td>Omnicure S2000</td><td>使用准直透镜和 365 nm 滤光片</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>标记 Dy547 的 siRNA</td><td>GE Healthcare Dharmacon, Inc.</td><td>定制订单</td><td>荧光染料连接于正义链 5&amp;rsquo; 端</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>预清洁玻璃</td></tr><tr><td>Secure-Seal 间隔片</td><td>Life Technologies</td><td>S24735</td><td>双面粘合</td></tr><tr><td>LSM 780&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>ZEN 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>FCS 分析软件</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>编程语言</td></tr><tr><td>NIH/3T3 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td>生长培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Mediatech</td><td>&amp;nbsp;30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td>转染培养基</td></tr></tbody></table>

通过光响应性聚合物纳米载体中sirna的时空控释预测基因沉默效果

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

需要新的材料和方法来更好地控制结合过程 与 用于需要精确调控基因活性的多种应用中核酸的释放。特别是，具有改进的空间和时间控制能力的新型响应性材料将为药物发现和再生医学技术提供可转化的平台。此外，增强对材料中核酸释放的控制能力，将有助于开发简化的预测纳米载体功效的方法 先验的，从而加快递送载体的筛选。本文介绍了一种通过模块化光响应纳米载体系统预测基因沉默效率并实现基因表达时空控制的实验方案。小干扰RNA（siRNA）与mPEG-b-聚(5-(3-(氨基)丙氧基)-2-硝基苄基甲基丙烯酸酯) (mPEG-b-（APNBMA）聚合物形成稳定的纳米载体，可通过光调控实现可调的、开关式siRNA释放。我们提出了两种互补的检测方法，分别采用荧光相关光谱和凝胶电泳，用于精确量化模拟细胞内环境溶液中siRNA的释放情况。这些检测所获得的信息被整合到一个简化的RNA干扰（RNAi）动力学模型中，以预测在不同光刺激条件下基因沉默的动态响应。基于此，优化的照射条件进一步完善了一种用于时空控制基因沉默的新方案。该方法可实现单细胞分辨率的基因表达空间模式调控，且未检测到脱靶效应。综上所述，本方法提供了一种易于使用的策略，用于预测基因表达的动态变化，并在时间和空间上精确调控siRNA活性。这一系列检测方法可便捷地推广应用于测试多种其他刺激响应系统，以应对生物医学研究和临床医学中广泛存在的关键挑战。

纳米载体构建完成后，进行了siRNA释放实验，以确定后续实验中所采用的辐照条件 体外 转染实验中，通过施加不同剂量的光照以确定siRNA的释放百分比。第一项检测采用凝胶电泳法，将游离的siRNA分子与仍与聚合物形成复合物或结合状态的siRNA分子分离开。未经光照处理的纳米载体保持稳定，未释放任何siRNA。随着照射时间的延长，游离siRNA条带的荧光强度逐渐增强。利用图像分析软件对条带强度进行定量分析，结果显示，经过20分钟光照后，约有15%的siRNA被释放。
第二种siRNA释放实验采用FCS（荧光相关光谱）测定溶液中自由扩散的siRNA分子所占的百分比。未暴露于光照的纳米载体样品的基线计数率与空白缓冲液对照样品的计数率相同，表明没有游离siRNA存在。随着照射时间的增加，基线计数率上升。计算得到的游离siRNA百分比与凝胶电泳测得的结果一致。通常，两种技术的估算结果在误差范围内相符（经Student's t检验，p &gt;0....

我们提出了一种新方法，该方法利用光响应性嵌段共聚物实现高效的时间和空间基因沉默控制，且未检测到脱靶效应。此外，通过简单的siRNA释放实验和简化的动力学建模即可预测基因表达的变化。

通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

需要开发新的材料和方法，以更好地控制核酸的结合与释放，满足众多需要精确调控的应用需求。

这些方法的总体目标是实现对小干扰RNA介导的基因沉默效率的预测，并以时空可控的方式调控目标蛋白的表达水平。该方法可阐明结构与功能之间的关系，以及响应刺激的递送载体。更好地调控结合与释放过程，将有助于开发可转化的平台和药物发现，以及再生医学技术。该技术的主要优势在于，基于简单的siRNA释放实验和动力学建模，能够对基因表达的变化进行控制和预测。尽管这些方法采用了新型的光响应性聚合物，但这一系列实验方案可轻松适用于测试多种其他刺激响应系统。首先，通过将siRNA加入pH为6的20微摩尔HEPES溶液中，制备浓度为32微克每毫升的siRNA溶液。然后，通过将溶解的 mPEG-b-polyAPN BMA 聚合物加入 pH 为 6 的 20 毫摩尔 HEPES 溶液中，制备聚合物溶液。为达到每毫升 220 微克的浓度，该浓度将产生 4 的 N/P 比值，即聚合物上的胺基数量是 siRNA 上磷酸基团数量的 4 倍。接下来，在涡旋仪上轻轻混合的同时，将聚合物溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中。加入聚合物后继续涡旋30秒。然后将样品在室温下避光孵育30分钟。在涡旋仪上轻轻混匀的同时，将STS溶液逐滴加入各纳米载体溶液中。加入SDS后继续涡旋30秒。将样品在3,000 G下离心5秒，然后将样品在室温下避光孵育30分钟。校准并设置带有365纳米滤光片的紫外激光器，使其强度为200瓦特每平方米。接下来，将一个橡胶垫片打孔，然后将该橡胶垫片放置在已清洗并干燥的载玻片上。用移液器将纳米载体SDS溶液滴加到橡胶垫片孔洞内的载玻片表面。将过量的溶液加载到载玻片上，注意避免与橡胶垫片接触。将第二片载玻片置于滑动垫圈上方。为避免产生气泡，先将载玻片一端轻轻放下，再缓慢放下另一端。在玻璃腔室两侧各夹上一个长尾夹，以固定密闭。使用带有365纳米滤光片的紫外激光，以200瓦特每平方米的强度照射样品所需的时间。取下文件夹夹子并打开腔室。接着，用移液器将25微升经照射的纳米载体SDS样品加入微型离心管中。在室温下避光孵育溶液30分钟。向每种纳米载体SDS样品25微升中加入5微升上样缓冲液。在室温下避光孵育样品10分钟。然后，将每种纳米载体 SDS 样品各 30 微升加入 2% 琼脂糖凝胶中，凝胶预先用溴化乙锭染色。在黑暗条件下以 100 伏电压电泳运行 30 分钟。使用配备溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像。保存凝胶图像文件，并按照文本方案中所述进行条带强度定量分析。取下双面粘性垫片上的纸片，暴露粘性表面，将垫片贴附到玻璃盖玻片上。将纳米载体SDS溶液用移液器滴加到盖玻片上。然后，将一块预先清洗过的载玻片置于盖玻片上方，使粘附垫片上的孔洞对准样品中心。轻压载玻片，确保载玻片与盖玻片紧密贴合并形成密封。使用共聚焦显微镜配备40倍水浸、消色差物镜（数值孔径为1.2）进行FCS测量。针对每个样本，使用适当的激发激光通道，采集至少30次测量数据，每次持续10秒。随后，将FCS获得的siRNA释放数据输入动力学模型，以预测基因沉默响应，具体操作详见文本方案。为进行体外 siRNA 递送，首先向六孔板的每个孔中加入 2 毫升细胞悬液。将细胞置于培养箱中孵育 24 小时，使其贴壁并恢复。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，加入 1.5 毫升无血清且不含抗生素的转染培养基，以准备进行转染。随后，向每个孔中加入 25 微升含有 30 皮摩尔 siRNA 的纳米载体溶液。轻轻吹打培养基混匀。将细胞放入培养箱中孵育 3 小时。移除转染培养基，用 PBS 洗涤每个孔。然后，每孔加入 1 毫升添加补充物的生长培养基，将细胞放入培养箱中恢复 30 分钟。为准备对细胞进行光刺激处理，移除添加补充物的生长培养基。然后，向每个孔中加入一毫升转染培养基。按照文本方案中所述校准紫外激光器后，将细胞置于设定为37摄氏度的加热板上。取下六孔板的盖子。使用波长为365纳米、强度为200瓦特每平方米的紫外激光，从培养板上方对细胞照射所需时间。移除转染介质，加入2毫升添加了补剂的生长培养基。将细胞置于培养箱中，直至进行后续分析。为了制备一种能够完全阻挡365纳米光并最大限度减少反射的光掩模，首先将所需形状切割、冲孔或加工到光掩模上。将光掩模粘附在六孔板底部，使图案居中对准含有细胞的孔，且防反射面朝向板面。设置两个相距约25米的铁架台，并在每个铁架台上安装一个平台，使两个平台处于相同高度。将细胞板置于两个支架之间，使其底部平台支撑细胞板。使用波长为365纳米滤光片的紫外激光，以200瓦特/平方米的强度从样品下方照射细胞，持续所需时间。移除转导介质，加入2毫升添加补充物的生长培养基。然后，将细胞置于培养箱中孵育至少24小时以恢复。按照之前所述方法，使用荧光显微镜对细胞进行成像。此处展示的是基因沉默动力学的简单动力学建模示例。该模型用于预测光诱导siRNA释放后，mRNA、蛋白质和siRNA浓度随时间变化的情况。不同光照剂量下释放的siRNA相对量被作为初始siRNA浓度输入动力学模型。模型预测得到的蛋白表达水平与通过Western印迹实验测定的表达水平相符。为了进行可视化观察，将表达GFP的细胞用靶向GFP的siRNA处理，并在照射前于培养板上放置环形光掩膜，以形成圆形图案。被光掩膜保护而未受光照的细胞，其荧光强度与未经siRNA和光照处理的对照样本无明显差异。然而，圆形图案内的几乎所有细胞均未表现出GFP表达，表明siRNA有效释放并实现了基因沉默。此外，利用光作为触发手段可实现基因表达的调控，并在细胞尺度上进行控制。总之，该方法能够快速确定辐照条件，以实现siRNA释放的时空控制，并可预先预测基因沉默效果。采用本方案将有助于阐明调控纳米载体稳定性和功效的结构-功能关系。该技术可能在再生医学中具有应用前景，可实现对基因表达的时间-空间控制。这些制剂也适用于治疗局部疾病，例如皮肤癌以及皮肤病。

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科研

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Bioengineering

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通过从光响应聚合物纳米载体的siRNA释放的时空控制预测基因沉默

RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.

基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

本视频展示了利用小干扰RNA（siRNA）在神经干细胞中沉默特定目的基因，并通过适当的分化培养基将其诱导分化为所需细胞类型的方法。该实验流程可用于研究特定基因在神经干细胞分化过程中所发挥的关键作用。...

siRNA介导的神经干细胞基因沉默

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。...

通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

递送仍是小干扰RNA（siRNA）在治疗应用中的主要挑战。本方案采用一种多功能且生物相容的siRNA递送平台，由精氨酸和聚乙烯亚胺接枝的多孔硅微粒组成。...

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壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

在成年斑马鱼器官中实现条件性基因敲除或有效的基因敲低仍然是一个重大挑战。本文报道了一种通过纳米颗粒介导的siRNA进行基因沉默的技术方案，用于成年斑马鱼心脏，从而为研究斑马鱼及其他模式生物的成年器官提供了一种新的功能缺失研究方法。...

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我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内...

聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

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体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

了解利用光响应嵌段共聚物实现基因沉默时空控制的方法。通过siRNA释放实验和动力学建模预测基因表达变化，为药物发现和再生医学提供可控平台。

通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

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