通过光响应性聚合物纳米载体中siRNA的时空控释预测基因沉默效果

这些方法的总体目标是实现对小干扰RNA介导的基因沉默效率的预测，并以时空可控的方式调控目标蛋白的表达水平。该方法可阐明结构与功能之间的关系，以及响应刺激的递送载体的作用机制。更好地控制结合与释放过程，将有助于开发具有转化潜力的技术平台，推动药物发现及再生医学技术的发展。

该技术的主要优势在于，基于简单的siRNA释放实验和动力学建模，能够控制并预测基因表达的变化。尽管这些方法采用了新型的光响应性聚合物，但该系列实验可轻松适用于测试多种其他刺激响应系统。首先，通过将siRNA加入pH为6的20微摩尔HEPES溶液中，配制浓度为32微克/毫升的siRNA溶液。

然后，通过将溶解的mPEG嵌段聚APN BMA聚合物加入pH为6的20毫摩尔HEPES溶液中，制备聚合物溶液。为达到220微克/毫升的浓度，该浓度将产生4的N/P比，即聚合物上的胺基数量是siRNA上磷酸基团数量的4倍。接下来，在涡旋仪上轻轻混合的同时，将聚合物溶液逐滴加入等体积的siRNA溶液中。

加入聚合物后继续涡旋30秒。然后将样品在室温下避光孵育30分钟。在涡旋仪上轻轻混匀的同时，将STS溶液逐滴加入各纳米载体溶液中。

加入SDS后继续涡旋30秒。将样品在3,000 G下离心5秒，然后在室温避光条件下孵育30分钟。校准并设置带有365纳米滤光片的紫外激光器，使其强度为200瓦特每平方米。

接下来，将一个橡胶垫片打孔，然后将该橡胶垫片放置在已清洗并干燥的载玻片上。用移液器将纳米载体SDS溶液滴加到橡胶垫片孔洞内的载玻片表面。将过量的溶液加载到载玻片上，注意避免与橡胶垫片接触。

将第二块载玻片放置在载玻片垫圈上方。为避免产生气泡，先将载玻片的一端放下，然后缓慢降低另一端。在玻璃腔室的每一侧夹上长尾夹，以固定密闭。

使用带有365纳米滤光片、强度为200瓦特每平方米的紫外激光，对样品照射所需的时间。取下文件夹夹具，打开腔室。接着，用移液器将25微升经照射的纳米载体SDS样品转移至微量离心管中。

将溶液在室温下避光孵育30分钟。向每25微升纳米载体SDS样品中加入5微升上样缓冲液。将样品在室温下避光孵育10分钟。

然后，将每种纳米载体SDS样品各30微升加入到预先用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶中。在避光条件下以100伏电压电泳30分钟。使用配备溴化乙锭滤光片的凝胶成像系统对凝胶进行成像。

保存凝胶图像文件，并按照文本方案进行条带强度定量分析。取下双面粘性垫片上的纸片，暴露粘性表面，将垫片贴附到玻璃盖玻片上。

用移液器将纳米载体SDS溶液滴加到盖玻片上。然后，将一块预先清洗过的载玻片置于盖玻片上方，使粘附垫片上的孔洞对准样品中心。轻压载玻片，确保载玻片与盖玻片紧密贴合并形成密封。

使用共聚焦显微镜，配备40倍水浸、消色差物镜，数值孔径为1.2，用于FCS测量。使用适当的激发激光通道，对每个样本至少采集30次、每次10秒的测量数据。然后，将FCS获得的siRNA释放数据输入动力学模型，以预测基因沉默响应，具体步骤详见文本方案。

为准备体外 siRNA 递送，首先向六孔板的每个孔中加入 2 毫升细胞悬液。将细胞置于培养箱中孵育 24 小时，使其贴壁并恢复。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，加入 1.5 毫升无血清且不含抗生素的转染培养基，以准备进行转染。

随后，向每个孔中加入 25 微升含有 30 皮摩尔 siRNA 的纳米载体溶液。轻轻吹打培养基以混匀。将细胞放入培养箱中孵育 3 小时。

移除转染培养基，用 PBS 洗涤每孔。然后加入一毫升含补充物的生长培养基，将细胞放入培养箱中恢复 30 分钟。为准备对细胞进行光刺激处理，移除含补充物的生长培养基。

然后，向每个孔中加入一毫升转导培养基。按照文本方案中所述校准紫外激光器后，将细胞置于设定为37摄氏度的加热板上。移去六孔板的盖子。

使用波长为365纳米滤光片、强度为200瓦特每平方米的紫外激光，从培养板上方对细胞照射所需时间。移除转染介质，加入2毫升添加补充物的生长培养基。将细胞置于培养箱中，直至进行后续分析。

为了制备一种能够完全阻隔365纳米光并最大限度减少反射的光掩模，首先将所需形状切割、冲孔或机械加工到光掩模上。将光掩模粘附在六孔板底部，使图案居中对准含有细胞的孔，且防反射面朝向板面。设置两个相距约25米的铁架台，并在每个铁架台上安装一个平台，使两个平台处于相同高度。

将细胞板置于两个支架之间，使其搁在平台上方。使用带有365纳米滤光片、强度为200瓦特每平方米的紫外激光，从样品下方照射细胞，持续所需时间。移除转导培养基，加入2毫升添加补充物的生长培养基。

然后，将细胞放入培养箱中孵育至少24小时以恢复。按照之前所述方法，使用荧光显微镜对细胞进行成像。此处展示的是基因沉默动力学的简单动力学建模示例。

该模型用于预测光诱导 siRNA 释放后，mRNA、蛋白质和 siRNA 的浓度随时间的变化。不同剂量光照后释放的 siRNA 相对量被作为初始 siRNA 浓度输入动力学模型。模型预测得到的蛋白质表达水平与通过蛋白质印迹实验测定的表达水平一致。

为了进行可视化观察，将表达GFP的细胞用靶向GFP的siRNA处理，并在照射前于培养板上放置环形光掩膜，以形成圆形图案。被遮蔽而免受光照的细胞表现出的荧光强度与未经siRNA和光照处理的对照样品无明显差异。然而，位于圆形图案内的几乎所有细胞均未表现出GFP表达，表明siRNA有效释放并实现了基因沉默。

此外，利用光作为触发手段可实现基因表达的调控，并在细胞尺度上进行控制。总之，该方法能够快速确定辐照条件，以实现对siRNA释放的时空控制，并可预先预测基因沉默效果。采用本方案将有助于阐明调控纳米载体稳定性和功效的结构-功能关系。

该技术可能在需要对基因表达进行时空控制的再生医学应用中发挥作用。这些制剂也适用于皮肤癌以及皮肤病等局部疾病的治疗。