中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

本实验的总体目标是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模收集果蝇胚胎，并制备可用于后续蛋白质组学应用（如亲和纯化质谱分析）的蛋白质提取物。该方法有助于回答细胞信号传导和发育生物学领域中的关键科学问题。

例如，特定蛋白质及其相互作用如何在生物体发育过程中实现细胞间通讯。该技术的主要优势在于，它是一种简便且成本低廉的方法，可用于制备黑腹果蝇（Drosophila）胚胎裂解液，所得裂解液可进一步应用于蛋白质亲和纯化等下游实验。

传统上，研究人员在大型种群培养笼中收集果蝇胚胎。但我们提出了一种用户友好的方法，可在中等大小的培养笼中收集胚胎，该方法可在任何实验室中轻松建立。根据文本方案，准备好5升容器并裁剪25厘米×25厘米的尼龙网后，将网覆盖在容器上，并用盖子压紧。

确保网纱绷紧且盖子没有倾斜。此时，笼子已准备好用于饲养果蝇。在准备好1升的塑料罐和18厘米×18厘米的尼龙网纱后，将网纱覆盖在罐口顶部边缘，然后拧紧盖子以固定。

确保网罩绷紧且瓶盖无倾斜。扩增携带目标类型蛋白的转基因果蝇品系，并每两天转移一次瓶子，直至每个果蝇品系积累25至30瓶。

以类似方式扩增对照菌种。接着，将苹果汁平板恢复至室温。然后用戴手套的手指，将少量湿润的酵母糊涂抹在平板中央。

在15厘米的培养皿上制作一个约六厘米的圆圈，在10厘米的培养皿上制作一个四厘米的圆圈。将果蝇麻醉后，转移到已准备好的笼子中，使网面朝下，然后用含苹果汁的培养皿盖住笼子。

让果蝇苏醒。然后将笼子翻转，在室温下孵育果蝇两到三天。每天更换两次培养板：将笼子倒置，用手将培养板固定在笼子上，然后从培养板上撕下胶带。

轻轻敲击整个培养瓶的瓶壁，迅速将旧培养板更换为新板，注意避免果蝇逃逸。让果蝇在新鲜的苹果汁培养板上产卵过夜，或根据实验需求设定其他时长。次日早晨，标记并称重用于收集胚胎的网状容器。

每种果蝇品系各准备一份。在50毫升离心管中，将40毫升水加入10毫升5倍浓缩的裂解缓冲液中，使用预先配制的试剂配制1倍裂解缓冲液。加入50微升1摩尔DTT，使其终浓度为1毫摩尔。

充分混匀，并将溶液分装至两个50毫升离心管中。向其中一根离心管中加入一片蛋白酶抑制剂。将该离心管置于4°C旋转仪上孵育30分钟。

在药片溶解的同时，开始收集胚胎：在饲养笼的苹果汁培养基平板上标记所用果蝇品系的基因型，并更换新的平板。加入足量的水以完全浸没每块苹果汁培养基平板。

然后用柔软的画笔轻轻将胚胎从培养皿上移下。将胚胎倒入事先称重并标记好的筛网容器中，沥去多余的水分。接着将筛网在纸巾上轻轻按压片刻，以去除多余的水分。

为了去除胚胎的卵膜，先用50%的次氯酸钠溶液填充六厘米培养皿至一半。然后准备两个较大的培养皿并加入水。将装有胚胎的筛网容器浸入50%次氯酸钠溶液中90秒。

孵育期间轻轻敲击筛网数次，使胚胎悬浮于漂白液中。孵育结束后，用水冲洗两个培养皿中的筛网容器，每皿约10秒。然后使用去离子水（18.2 MΩ·cm）的洗瓶彻底冲洗筛网容器，包括侧面和外部。

彻底清洗后应检测不到漂白剂气味。将网状容器在纸巾上吸干。然后称量装有胚胎的网状容器重量，并减去空容器的重量。

记录胚胎的最终重量。为制备胚胎提取物，向Dounce玻璃匀浆器中加入1毫升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，并置于冰上。然后将胚胎从筛网容器转移至匀浆器中。

用一毫升裂解缓冲液将残留的胚胎从滤网上冲洗下来。将胚胎和缓冲液加入匀浆器中的样品中。然后让胚胎沉降到匀浆器底部，小心吸除上清液。

接下来，向匀浆器中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，每克胚胎使用5至6毫升裂解缓冲液。然后插入一个松配合的研杵，进行4到6次研磨以匀浆胚胎。在最初的几次研磨中，阻力会较大。

尽量以连续动作移动研杵，避免溶液溅出。然后换用贴合度较好的研杵，用8到10次研磨 strokes 充分匀浆胚胎。

将匀浆物在冰上孵育20分钟。然后将匀浆物转移至微量离心管中，在4°C条件下以13,000 × g离心15分钟。

在避免触及最上层脂质层中的沉淀物的情况下，将上清液转移至冰上预冷的新微量离心管中。重复离心后，使用1毫升枪头小心收集上清液，并将其转移至预冷的10毫升注射器中，注射器前端连接有0.45微米滤器。

将全部溶液推入预置冰上的、已标记的 2 毫升微量离心管中。用液氮速冻样品，并在 -80 °C 下保存。或者立即用于蛋白质纯化实验。

根据本视频中描述的实验方案，利用 arm-odillo 启动子调控，从普遍表达 EGFP-ERK 蛋白的果蝇胚胎中制备裂解液。通过针对总 ERK 蛋白的 Western 印迹法检测内源性 ERK 和转基因 EGFP-ERK 的表达水平，二者分别在 42 千道尔顿和 69 千道尔顿处出现条带。在黄色白眼对照品系中仅检测到一条对应于无标签内源性 ERK 的条带，证实了从胚胎中成功提取了 ERK 和 EGFP-ERK。

为了检测提取方案是否适用于后续的标签蛋白纯化，使用GFP琼脂糖磁珠对黄体白眼及arm-EGFP-ERK果蝇的提取物进行了亲和纯化。将样品在梯度SDS-PAGE凝胶上电泳后进行银染，结果显示诱饵蛋白EGFP-ERK成功被纯化。除EGFP-ERK外，实验组泳道中还出现了一些对照样品中未观察到的额外条带，提示纯化过程中富集到了潜在的ERK相互作用蛋白。

一旦掌握，胚胎收集和提取步骤大约可在两小时内完成。进行该操作时，重要的是要记住在冰上进行提取步骤，并使用蛋白酶抑制剂以尽量减少蛋白质降解。

观看本视频后，您应能充分了解如何建立中等规模的黑腹果蝇群体培养笼，以及如何从果蝇胚胎中制备全细胞蛋白提取物。