可切换的声学与光学分辨率光声显微镜 在体 内 小动物血液血管成像
2017年6月26日
一种可切换的声学分辨率（AR）与光学分辨率（OR）光声显微成像系统（AR-OR-PAM），能够在同一样品上实现浅层组织的高分辨率成像和深层组织的低分辨率成像 体内 被展示。
本实验的总体目标是展示一种可切换的声学与光学分辨率光声显微成像系统，用于活体小动物血液血管系统的成像。光声显微成像是一种快速发展的活体成像模式，结合了光学与超声技术，能够在超越光学穿透深度的同时实现高分辨率成像。本研究展示了一种可切换的声学与光学分辨率光声显微系统，能够在同一活体样本上实现浅层组织的高分辨率成像以及深层组织的低分辨率成像。
演示该实验操作的是来自我实验室的研究员 Mohesh Moothanchery 博士，以及我实验室的博士生 Arunima Sharma。首先，使用二极管泵浦的固态 Nd:YAG 激光器和一个可调谐激光器构建纳秒级可调谐激光系统，可调谐范围为 559 至 576 纳米。将可调谐激光器设置为 570 纳米。
将一个底部带有七厘米聚乙烯成像窗口的亚克力容器安装在光学平台上。将成像平台固定在成像窗口下方的光学支架上。在容器上方，将包含AR-OR-PAM成像系统的光学笼架安装在切换板上，该切换板固定于由计算机控制的三轴电动平移台上。
为了配置AR-PAM系统，使用安装在电机驱动连续旋转平台上的直角棱镜，将光束引导通过可变中性密度滤光片，进入带有25 NA光纤耦合器的多模光纤电缆。将光纤输出端连接至成像系统中的XY平移平台。使光束从输出端起先通过一个距离25毫米的平凸透镜，再通过一个锥形透镜，以形成环形光束。
将环形光束聚焦到光学聚光镜上，该聚光镜围绕一个50兆赫超声换能器，并在换能器输出端安装有声学透镜。接下来，为配置OR-PAM系统，将第一个直角棱镜旋转90度，使激光束依次通过一个光圈、一个可变中性密度滤光片、一个聚光镜以及一个设置在距聚光镜75毫米处的针孔。使用数值孔径为1的单模光纤耦合器和单模光纤，将光束传输至成像系统中的Z轴平移台。
将光束通过安装在光纤输出端50毫米处的消色差双合透镜。利用一个可调节的运动学椭圆反射镜将光束偏转至置于透镜筒内的第二个消色差双合透镜。将光束聚焦于一个直角棱镜上，该棱镜与一个菱形棱镜之间由一层硅油隔开；菱形棱镜上装有声学透镜和一个50兆赫兹的超声换能器，共同构成OR-PAM扫描头。
开始系统校准之前，先用脱气水注满亚克力水箱。然后使用三轴电动平移台将扫描组件移至水箱上方。降低组件，直至两个系统的声学透镜均浸入水中。
打开激光器。将超声换能器连接到两个25分贝的固定增益放大器上。将AR-PAM扫描头置于成像窗口上方。
将包裹有黑色电工胶带的玻璃载玻片放置在成像台上，并升高成像台，使载玻片与成像窗口接触。调节锥形透镜，直至载玻片产生的光声信号幅度达到最大值，表明光学透镜与声学透镜已共焦。然后手动切换至OR-PAM系统。
调节消色差双合透镜，直至光学透镜与声学透镜共焦，以覆盖胶带的载玻片产生的光声信号幅度达到最大为准。为测定每个系统的横向分辨率，首先在盖玻片上放置1毫升稀释的100纳米金纳米颗粒水溶液。将载玻片置于成像载物台上。
升高载物台，直至纳米颗粒溶液接触成像窗口。将激光器和扫描头切换至光声显微成像（AR-PAM）系统。设置仪器软件以进行AR-PAM扫描，并执行一次光栅扫描。
对OR-PAM系统重复此过程。然后取出载玻片，并用酒精棉片清洁成像窗口。将从所获图像中确定的点扩散函数拟合为高斯曲线。
半高全宽是相应扫描系统的横向分辨率。接下来，为了确定在组织中的最大成像深度，首先将包裹有黑色胶带的锋利金属板以较小的角度插入鸡组织的一小部分中。将组织置于水箱内扫描头下方。
为每个系统获取一张单次B扫描图像。测量在组织表面下方黑胶带不再清晰可辨的深度。成像前，确保聚乙烯成像窗口和动物成像平台均清洁无污。
然后，在麻醉后取一只25克重、四周大的雌性小鼠用于成像操作。使用脱毛膏去除小鼠耳部表面的毛发。在小鼠眼睛上涂抹无菌眼膏，以防止眼睛干燥并阻挡散射的激光束。
将小鼠放置在成像台上，使用载板固定耳朵以便成像。用脉搏血氧仪夹住小鼠的尾巴或腿部，监测其生理状况。在待成像的耳朵上涂抹超声耦合剂。
缓慢抬高成像平台，使耳朵轻柔地接触聚乙烯成像窗口。对小鼠耳部进行AR-PAM和OR-PAM光栅扫描成像，并在整个过程中监测小鼠的生理状态。成像结束后，让小鼠完全恢复。
本研究利用可切换的AR-OR-PAM系统对小鼠的血液血管系统进行了活体成像。在AR-PAM图像中，直径大于45 µm的血管清晰可见；而通过OR-PAM成像，则可分辨出宽度约为5 µm的单个毛细血管。
联合的AR-OR-PAM系统具有约四微米的横向分辨率，OR-PAM的成像深度为0.4毫米，而AR-PAM具有约45微米的横向分辨率和7.8毫米的成像深度。可切换的联合AR-OR-PAM系统允许在不同成像系统之间进行成像时无需移动样本。
该系统可用于临床前成像。主要的临床前应用包括雄性生殖、肿瘤微环境、微循环、药物反应、脑功能、生物标志物以及基因活性的成像。
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概述
本文展示了一种可切换声学分辨率（AR）和光学分辨率（OR）的光声显微成像系统（AR-OR-PAM），用于小动物血液血管系统的活体成像。该系统能够在同一样本中实现浅层组织的高分辨率成像以及深层组织的较低分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 光声显微镜
- 活体成像
- 小动物研究
背景
- 光声显微成像结合了光学和超声技术。
- 该技术提供的成像深度超过了单独使用光学方法所能达到的范围。
- 这一技术在生物医学成像领域正迅速发展。
- 理解血管系统对于多种生物学研究至关重要。
研究目的
- 展示一种具有可切换分辨率的新型成像系统。
- 提升小动物模型的成像能力。
- 促进活体中血管的更佳可视化。
使用的方法
- 构建纳秒级可调谐激光系统。
- 采用二极管泵浦的固态Nd:YAG激光器。
- 实现波长范围为559至576纳米的双可调谐激光器。
- 将双可调谐激光器设定为570纳米以获得最佳成像效果。
主要结果
- AR-OR-PAM 系统成功实现了浅层组织的高分辨率成像。
- 对深层组织也有效实现了较低分辨率的成像。
- 该系统在对同一样本进行成像时表现出良好的多模态适应性。
- 实验结果表明该技术在活体应用方面具有显著潜力。
结论
- 可切换的AR-OR-PAM系统代表了光声显微技术的重要进步。
- 该技术可增强对小动物血液血管系统的研究。
- 未来应用可能涵盖更广泛的生物医学研究与诊断领域。
常见问题
行业相关性概述
可切换的声学和光学分辨率光声显微镜使生物制药研究人员能够在不同深度尺度上研究血管表型，而无需转移样品，从而支持在临床前模型中进行机制性风险评估。该系统提供定量的血管参数指标，可提高在小型动物研究中靶点验证的可信度以及检测的可重复性。通过将功能读数与疾病相关系统中的结构变化相联系，该技术能力提升了早期发现阶段的预测价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过可视化血液血管系统在干扰下的变化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过对同一动物进行纵向、无创的血管表型监测，支持生物学风险的降低。
- 预测可信度：提供与药物反应或疾病进展相关的深度分辨血管读数，有助于项目组合的筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：通过建立血管成像的基线参数，为下游工作流程准备经过验证的生物系统。
- 定量输出：提供可重复、高分辨率的血管参数，支持在筛选级联中对化合物进行可靠评估。
- 平台复用：可在不同模型间进行可扩展、可切换的成像，无需重新配置，支持检测标准化。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：在临床前模型中成像微循环和肿瘤微环境，与转化生物标志物策略相一致。
- 临床前连续性：通过提供跨深度一致的血管表型分析，连接发现研究与临床前验证。
- 风险调整型推进：通过量化血管正常化或破坏作为机制性终点指标，为决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法可融入从假设验证到先导物识别直至临床前验证的完整发现流程，提供支持生物学风险降低和机制解析的血管成像。
- 发现生物学：通过可视化遗传或药物调控对血管反应的影响，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的定量输出结果，用于评估化合物在与疾病相关的系统中对血管系统的作用。
- 分析：提供横向分辨率和深度分辨的血管测量数据，帮助研究团队比较不同条件并追踪表型变化。
- 转化研究：通过在与人类疾病相关的模型中成像血管生成、灌注及血管完整性，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：作为可在多个项目中重复使用的成像能力，减少对多个专用系统的需求。
运营与企业影响
- 科学价值：通过深度分辨的纵向成像，减少血管表型中的机制性模糊，从而提高预测可信度。
- 操作价值：在同一平台上实现可切换的分辨率，提升标准化与可重复性，最大限度降低不同系统间的变异性。
- 战略价值：提供定量的血管终点指标，降低后期生物学风险，支持更优的“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过反映靶点结合或通路调节的血管生物标志物，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 可靠操作需要具备光声成像、激光安全和小动物操作方面的专业知识。
- 依赖可调谐激光系统、超声换能器和精密平移台，以实现双分辨率切换。
- 需要跨团队对成像协议、深度校准和血管分割进行标准化，以确保数据解读的一致性。
- 在不同模型系统间应用时需考虑适应性问题，包括组织的声学特性以及慢性成像中窗口材料的兼容性。
- 实际限制包括分辨率与穿透深度之间的权衡，需针对目标成像尺度重新配置系统。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Acoustic-resolution and Optical-resolution Photoacoustic Microscopy (AR-OR-PAM) System Setup
9:23
Conclusion
8:54
Results: In Vivo Blood Vasculature Imaging with AR-OR-PAM
4:07
AR-OR-PAM System Alignment
5:36
Quantification of Lateral Resolution and Imaging Depth
7:23
In Vivo Imaging of a Mouse Ear
