用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

本方法学的总体目标是制备具有不同孔径的宏观多孔水凝胶，用于细胞培养应用。该方法可帮助解答三维细胞培养领域中的关键问题，例如新型水凝胶材料用于三维细胞培养的原理可行性。该方法学的主要优势在于，它提供了一系列技术手段，可用于优化和调整新型材料，以满足不同类型细胞的需求。

首先，将一毫克 RGD 肽或等效的细胞黏附肽溶于 100 微升无菌水中，配制成 10 毫克/毫升的溶液。接着，取一个 96 孔板，移除其底部，并用可剥离的塑料膜替代。在 96 孔板中加入 100 微升 BSA 储存液和 100 微升 THPC 储存液，混合均匀，得到 200 微升水凝胶。

通过移液枪上下吹打至少五次以充分混合各组分，确保聚合后形成均匀的水凝胶。将96孔板置于室温下约10分钟，直至所有水凝胶完全聚合。聚合完成后，从孔板底部小心且缓慢地揭去封口膜。

使用小尖头将水凝胶从96孔板中推出，并将其转移至含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）的1.5毫升离心管中。将水凝胶置于4摄氏度的磷酸盐缓冲盐水中保存，可保存数月。如需冷冻干燥水凝胶，首先在1.5毫升离心管中加入500微升无菌去离子水，并取下管盖。

使用镊子将水凝胶转移至1.5毫升反应管中。用至少三层封口膜紧密包裹每个1.5毫升离心管。使用针头在膜上刺出小孔，以使管内气体能够释放。

为确保水和水凝胶完全冻结，将小瓶转移至液氮中持续五分钟。从液氮中取出后，立即转移至冷冻干燥机中，以防止材料解冻。作为替代的冷冻步骤，可将小瓶置于零下20摄氏度环境中过夜，以缓慢冻结水凝胶。

从零下20摄氏度取出后，立即将小瓶转移至冷冻干燥机中，以防止材料解冻。24小时后，待水凝胶内部及周围的水分完全蒸发，通过将材料从冷冻干燥机中取出使其解冻。对于颗粒沥滤，按之前方法混合水凝胶的各组分。

混合后，立即加入氯化钠直至达到饱和。持续加盐直至溶液中出现作为白色沉淀的盐晶体。通过在使用前研磨盐晶体，可以改变孔径大小。

将96孔板转移至摇床，振荡直至聚合完成。约10分钟后，按前述方法从板中取出水凝胶。将水凝胶置于旋转器上的无菌水中，在室温下孵育至少24小时，以从水凝胶模板中完全洗脱盐分。

将水凝胶在4°C的PBS中保存，可存放数月。为实现温和形成，按所述方法制备水凝胶，然后用镊子从溶液中取出一块水凝胶。

用高吸水性纸巾吸去多余的水分，并将其放置在干冰块上。将水凝胶冷冻30秒，然后小心地从干冰块上取下。注意不要损坏水凝胶。

使用刮刀小心地将其从凝胶块上刮下。将水凝胶转移至1.5毫升离心管中，并在37摄氏度下干燥过夜。根据文本方案中的描述，配制罗丹明B储备液及其系列稀释液。

将水凝胶从保存溶液中取出，转移至含有1毫升浓度为0.01毫克/毫升的罗丹明B溶液的1.5毫升离心管中。在室温下用罗丹明B溶液避光染色过夜。次日，将用于成像的水凝胶转移至10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，洗涤至少3小时。

使用刀片从水凝胶上切取小片，然后将水凝胶转移至八孔载玻片上，并用 PBS 覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜，在 514 纳米波长下观察水凝胶。

使用0.45微米滤器对所有储备液进行无菌过滤。开始制备水凝胶，并在水凝胶聚合前加入细胞黏附肽。混合各组分后，立即用移液器将混合物加入八孔显微镜载玻片中，直至完全覆盖底部。

将细胞转移至预热的无菌DMEM细胞培养基中，该培养基需添加胎牛血清、青霉素-链霉素和非必需氨基酸溶液。使用Neubauer计数板对细胞进行计数后，小心地将200微升所需数量的细胞滴加到水凝胶表面。用盖子盖住八孔显微镜载玻片，并将其转移至培养箱中。

细胞贴壁至少四小时后，用 200 微升无菌细胞培养用 PBS 洗涤细胞两次。接着，在室温下用 200 微升 3.7% 甲醛固定细胞 10 分钟，并用 PBS 再次洗涤两次。用 200 微升 0.1% Triton X 处理细胞 5 分钟以进行透化，随后再用 PBS 洗涤两次。

用甲醇储存液与 PBS 配制甲苯胺红染色液，即将 5 微升甲醇储存液与 195 微升 PBS 混合，加入细胞中，室温避光染色 20 分钟，随后用 PBS 洗涤两次。使用共聚焦显微镜在 514 纳米波长下观察细胞黏附特性。

按照文本方案中所述分析水凝胶的性质。如图所示，聚合并染色后的水凝胶无明显结构特征。在不同温度下冷冻干燥水凝胶后，水凝胶内部孔隙的平均尺寸可扩大至60微米。

盐析法可形成孔径约为10微米的均匀网络结构。通过在使用前研磨盐晶体，可进一步调节孔径大小。在干冰块上采用梯度冷冻法，可形成直径约20微米、长度达数百微米的通道结构。

在未用细胞黏附基团进行功能化之前，细胞无法黏附于水凝胶表面，并呈现圆形形态。只有在材料上引入细胞黏附肽后，细胞才能找到局灶性黏附位点，从而实现细胞在材料上的牢固黏附。这对于新型材料在三维细胞培养应用中的使用至关重要。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用简单方法调控水凝胶的结构。该方法适用于大多数新型水凝胶体系，可用于研究其在细胞培养中的应用，并根据预期用途优化水凝胶的结构。