便于操作的体系结构基于蛋白质的凝胶中为单元格文化应用程序
2017年8月4日
不同的方法来操作基于蛋白质的凝胶中的三维结构对材料性能在这里评价。大孔网络一种细胞粘附肽，羧基化，它们在细胞培养的可行性评估使用两种不同的模型细胞株。
该方法的总体目标是为细胞培养应用创建具有不同孔径的大孔水凝胶。该方法可以帮助回答 3D 细胞培养领域的关键问题，例如新型水凝胶材料用于 3D 细胞培养应用的主要可行性。这种方法的主要优点是它提供了一系列技术来优化和调整新型材料以适应不同类型细胞的要求。
首先，在 100 μL 无菌水中稀释 1 毫克 RGD 肽或等效的细胞粘附肽，以获得每毫升 10 毫克的溶液。接下来，取下 96 孔板的底部，并用去除保鲜膜替换。在 96 孔板中混合 100 微升 BSA 储备溶液和 100 微升 THPC 储备溶液，以获得 200 微升水凝胶。
通过上下吹打至少五次来混合组分，以保证聚合后水凝胶的均匀性。将 96 孔板在室温下放置约 10 分钟，直到所有水凝胶都正确聚合。聚合后，小心地慢慢地从板底部取下保鲜膜。
用小刺将水凝胶从 96 孔板中压出，然后将它们转移到具有无菌 PBS pH 7.4 的 1.5 毫升试管中。将水凝胶储存在 4 摄氏度的磷酸盐缓冲盐水中长达数月。要冷冻干燥水凝胶，首先用 500 微升无菌去离子水填充 1.5 毫升试管，然后取下盖子。
使用镊子将水凝胶转移到 1.5 毫升反应管中。用石蜡膜将 1.5 mL 试管紧紧包裹，每个样品瓶至少使用三层。用针头在薄膜上刺穿小孔，使气体从管中释放出来。
为保证水和水凝胶完全冻结，请将样品瓶转移到液氮溶液中 5 分钟。从液氮中取出后，立即将样品瓶转移到冷冻干燥机中，以防止材料解冻。作为另一种冷冻步骤，将样品瓶保持在零下 20 摄氏度过夜，以缓慢冷冻水凝胶。
从零下 20 摄氏度中取出后，立即将样品瓶转移到冷冻干燥机中，以防止材料解冻。24 小时后，水凝胶内部和周围的水分完全蒸发后，将材料从冷冻干燥机中取出，使其解冻。对于颗粒浸出，像以前一样混合水凝胶的组分。
混合后，立即加入氯化钠直至饱和。加盐，直到在溶液中可以看到盐结晶为白色沉淀。孔径可以通过在使用前研磨盐晶体来改变。
将 96 孔板转移到摇床上并摇动直至发生聚合。大约 10 分钟后，像以前一样从板中取出水凝胶。在旋转器上，在室温下用无菌水孵育水凝胶至少 24 小时，以洗脱水凝胶模板中的所有盐。
将水凝胶在 4 摄氏度的 PBS 中储存长达数月。为了温和地形成，请按照说明制备水凝胶。然后用钳子从溶液中取出水凝胶。
用高吸水性纸去除多余的水，然后将其放在一块干冰上。将水凝胶冷冻 30 秒，然后小心地将其从块中取出。不要损坏水凝胶。
小心地用抹刀将其从块上刮下来。将水凝胶转移到 1.5 毫升的试管中，并在 37 摄氏度下干燥过夜。按照文本方案中的说明准备罗丹明 B 储备溶液以及连续稀释液。
从储存的溶液中取出水凝胶，并将其转移到 1.5 毫升试管中，每毫升加入 1 毫升 0.01 毫克的罗丹明 B 溶液。在室温下将水凝胶在罗丹明 B 溶液中染色过夜。第二天，将要观察的水凝胶转移到 10 毫升 PBS 中并洗涤至少三个小时。
用刀片从水凝胶上切出小片。然后将水凝胶转移到 8 孔显微镜载玻片上，并用 PBS 覆盖。使用共聚焦激光扫描显微镜，在 514 纳米的波长下观察水凝胶。
用 0.45 微米过滤器无菌过滤所有储备液。开始制备水凝胶，并在水凝胶聚合之前加入细胞粘附肽。混合组分后，立即将混合物移液到八孔显微镜载玻片中，直到底部完全覆盖。
将细胞转移到预热的无菌 DMEM 细胞培养基中，培养基中补充有胎牛血清、青霉素链霉素和非必需氨基酸溶液。使用 Neubauer 计数室计数细胞后，小心地将 200 微升所需数量的细胞移液到水凝胶表面。用盖子盖住八孔显微镜载玻片，并将其转移到培养箱中。
细胞贴壁至少 4 小时后，用 200 μL 无菌细胞培养 PBS 洗涤细胞两次。接下来，在室温下用 200 微升 3.7% 甲醛固定细胞 10 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。用 200 μL 0.1% Triton X 透化细胞 5 分钟，然后用 PBS 再洗涤两次。
通过将 5 微升甲醇原液与 195 微升 PBS 混合并在室温下将其添加到细胞中，用甲苯胺罗丹明对细胞进行染色。在黑暗中对细胞染色 20 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。使用 514 纳米共聚焦显微镜研究细胞粘附特性。
如文本协议中所述分析水凝胶特性。如图所示，聚合和染色的水凝胶没有独特的结构。在不同温度下冷冻干燥水凝胶后，水凝胶内孔的平均尺寸可以扩展到 60 微米。
盐浸出会产生孔径约为 10 微米的均匀网络。使用前可以通过研磨盐晶体来进一步调整大小。在一块干冰上使用梯度冻结方法会导致形成直径约为 20 微米、长度为数百微米的通道。
在用细胞粘附部分功能化之前，细胞不能粘附在水凝胶表面并呈现圆形形态。只有在为材料提供细胞粘附肽后，细胞才会找到粘附焦点，从而使细胞能够正确粘附在材料上。这对于在 3D 细胞培养应用中使用新型材料至关重要。
观看此视频后，您应该对如何使用简单的方法作水凝胶的结构有很好的了解。该方法可应用于大多数新型水凝胶系统，以了解在细胞培养中的用途，并根据预期用途优化水凝胶的结构。
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概述
本研究评估了操纵蛋白质基水凝胶三维结构的多种方法，重点关注其材料特性及其在细胞培养中的适用性。水凝胶被功能化为细胞粘附肽，并通过不同的模型细胞系进行测试。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 细胞培养
- 水凝胶工程
背景
- 三维细胞培养对于模拟体内环境至关重要。
- 水凝胶可以为细胞生长提供支持性基质。
- 细胞粘附肽增强细胞附着和增殖。
- 大孔结构可以影响营养和废物交换。
研究目的
- 创建具有不同孔径的大孔水凝胶以用于细胞培养。
- 评估新型水凝胶材料在3D细胞培养应用中的可行性。
- 优化水凝胶属性以适应不同细胞类型。
所用方法
- 在无菌水中稀释RGD肽以创建细胞粘附溶液。
- 修改96孔板以用于水凝胶制备。
- 混合BSA和THPC原液以形成水凝胶。
- 用模型细胞系评估水凝胶性能。
主要结果
- 成功创建了具有可调性质的大孔水凝胶。
- 水凝胶显示与细胞培养的兼容性。
- 细胞粘附肽改善了细胞附着。
- 不同的孔径影响了细胞行为和生长。
结论
- 该方法为水凝胶开发提供了一种多功能的方法。
- 优化的水凝胶可以为特定细胞类型定制。
- 本研究为3D细胞培养技术的进步做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein-based hydrogels with tunable macroporous architectures enable systematic evaluation of 3D cell culture conditions, supporting target validation through physiologically relevant microenvironments. Adjustable pore sizes and channel formation allow de-risking of lead candidates by modeling nutrient diffusion and cellular response variability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by bridging reductionist assays with tissue-like complexity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in 3D contexts that better reflect in vivo tissue architecture and cell-ECM interactions.
- Operational Value: Provides a tunable platform to assess target engagement across varying microenvironmental conditions, reducing false positives from 2D systems.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking hydrogel architecture to cellular phenotypes, improving target confidence before lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantifiable hydrogel substrates with defined pore sizes (10–70 µm radius) for standardized compound screening.
- Operational Value: Enables assay scalability through simple salt-leaching and gradient-freezing methods compatible with 96-well formats.
- Assay Readiness: Produces stable, cell-adhesive (RGD-functionalized) hydrogels suitable for long-term culture and imaging via confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical testing by maintaining consistent hydrogel properties across workflow stages.
- Disease-Relevant Modeling: Allows evaluation of cell lines (e.g., A549, MCF7) in engineered microenvironments that mimic stromal barriers and interstitial flow.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables porosity-dependent screening to identify compounds effective under diffusion-limited conditions, improving clinical translatability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, offering a tunable extracellular matrix mimic for iterative design-test cycles.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how matrix porosity influences signaling, proliferation, and drug response in cancer models.
- Screening: Delivers pore-size-graded hydrogels enabling dose-response analysis under varied mass transport conditions.
- Analytics: Provides confocal-readable, Rhodamine B-stained architectures for quantitative pore characterization and correlation with functional outcomes.
- Translational Research: Supports biomarker-aligned studies by maintaining hydrogel integrity during prolonged culture and fixation steps.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular hydrogel platform adaptable to multiple cell types and pore specifications without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in 3D cell responses to pharmacological perturbations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hydrogel fabrication, storage (4°C in PBS), and visualization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds effective in diffusion-limited, tissue-like microenvironments.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of leads based on performance across hydrogel architectures with varying pore sizes and channels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel formulation, peptide functionalization, and confocal microscopy for structural analysis.
- Depends on access to freeze-dryers, liquid nitrogen or -20°C storage, and shakers for salt leaching and hydrogel maturation.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel preparation steps to ensure batch-to-batch consistency in pore size and swelling behavior.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to other protein-based systems beyond BSA, particularly regarding gelation kinetics and peptide compatibility.
- Practical limitations include mechanical fragility of macroporous hydrogels, necessitating careful handling during transfer and imaging steps.
