使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

本实验方案的主要目标是设计并合成能够检测大肠杆菌 O157:H7 等细菌污染物的双模态纳米传感器。通过两步法对氧化铁纳米颗粒进行功能化，从而合成磁性荧光纳米传感器。第一步，将靶向抗体偶联到纳米颗粒表面。

然后将荧光染料载入其编码中。这些模式的结合使得在低浓度和高浓度溶液中均能快速且灵敏地检测细菌污染物。当存在少量细菌时，由于偶联抗体的靶向作用，纳米传感器会聚集到细菌周围。

这种成群行为会改变纳米传感器磁性核心与周围水合质子之间的相互作用，从而实现对磁弛豫值变化的灵敏检测。随着溶液中细菌污染物浓度的增加，成群行为减少，磁学检测模式对污染程度的定量能力也随之降低。然而，随着细菌浓度的增加，生物纳米传感器的荧光信号也随之增强。

正是由于这一原因，磁性与荧光检测模式的结合显得尤为重要。这种联用技术使得在数分钟内即可检测到低至一个大肠杆菌 O157:H7 菌落形成单位。磁性-荧光纳米传感器合成的第一步是制备含有亚铁盐和铁盐的氯化铁溶液。

铁将为纳米传感器提供一个磁性核心，使其能够适用于磁弛豫检测平台。所需的其他溶液包括聚丙烯酸和氢氧化铵。将盐酸加入铁盐溶液中，然后在涡旋条件下将该溶液加入氢氧化铵溶液中。

最后加入聚丙烯酸溶液，所得混合物继续涡旋震荡一小时，同时反应持续进行。将所得溶液离心，以沉淀较大分子并分离出粒径小于100纳米的纳米颗粒。随后对溶液进行透析，过夜纯化。

下一步是将靶向抗体与新合成的铁酸纳米颗粒的聚丙烯酸编码进行偶联。所需材料包括 MES 缓冲液、EDC、NHS 以及选定的抗体。首先将 EDC 加入纳米颗粒溶液中，随后加入 NHS，最后加入抗体。

随后将混合物置于台式混合器上继续反应三小时。使用磁性柱对溶液进行纯化。磁化柱可捕获纳米颗粒，仅允许游离的抗体通过。

随后用 PBS 缓冲液洗涤柱子，收集偶联的纳米传感器。然后，纳米颗粒即可用于添加荧光染料，从而提供检测所用的第二种关键模态。我们纳米传感器最关键的特性之一是磁性和荧光模态的结合，这一点在多个方面都具有重要意义。

首先，多种检测模式的结合可实现相互验证，从而显著降低假阳性和假阴性的风险，这是当前各类诊断平台面临的主要难题之一。其次，多种模式的联合应用极大地拓宽了我们对细菌污染进行检测和定量的范围。纳米传感器制备的最后一步是将荧光染料封装于纳米颗粒的编码结构中。

通过在涡旋振荡的同时向溶液中加入染料，并留出足够时间使染料扩散进入纳米传感器的编码区域，即可实现此步骤。功能化完成的纳米传感器随后进行最后一次透析以达到纯化目的。为表征纳米传感器，使用泽塔电位仪和荧光酶标仪分别记录其粒径和荧光发射信号。

将少量纳米传感器样品加入比色皿的水溶液中，并置于粒径分析仪中以测定其尺寸。进行荧光分析时，将纳米传感器样品置于96孔板中，随后插入荧光酶标仪进行检测。理想的纳米传感器直径约为70纳米，荧光发射波长为575纳米。

除了纳米传感器的合成外，还需要培养细菌，以在实验室中提供细菌靶标。使用细菌的甘油菌种在营养肉汤中制备菌液，随后将该溶液进行孵育。

初始培养期结束后，进行系列稀释以获得较宽范围的细菌浓度。取每种浓度的100 µL接种至营养琼脂平板，然后培养24小时。培养结束后，对每块平板上的菌落进行计数，以确定每毫升稀释菌液的菌落形成单位（CFU）数量。

现在细菌标准溶液已经制备完成，可以与制备好的纳米传感器联合使用。这种特定血清型细菌的一个重要特征是，与其他血清型不同：如果感染了其他血清型的细菌，通常需要大量的菌落形成单位才能引发感染；但对于这种大肠杆菌，仅需10到100个菌落形成单位（CFUs）就足以引起感染。

我们的技术具有高度灵敏性，即使存在单个菌落的细菌污染也不会遗漏。为了在磁弛豫仪中进行读数前的溶液制备，首先将 300 微升 PBS 移液至一个 Eppendorf 管中，然后加入细菌储备液样本，接着加入纳米传感器。

然后将溶液转移至玻璃管中，并在管口覆盖一层封口膜以防止蒸发。将该玻璃管放入较大的核磁共振管中，随后插入磁弛豫仪中。如图所示，使用不含细菌、仅含纳米传感器和磷酸盐缓冲液（PBS）的空白溶液进行基线T2值测定。

然后将含有不同浓度细菌的溶液插入磁弛豫仪中进行分析，T2 值的变化是由纳米传感器与细菌之间的结合所引起的。如图所示，使用该方法可在数分钟内检测到低至一个细菌菌落形成单位（CFU）的存在。然而，随着细菌浓度的增加，磁弛豫信号的定量性降低，因此结合荧光透射数据对于实现准确的细菌定量至关重要。

在采集荧光数据之前，必须首先对样品进行离心。将溶液从玻璃管转移至离心管中，然后进行离心。此步骤可将细菌及其结合的纳米传感器与溶液中游离的纳米传感器分离开来。

弃去上清液，将细菌沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。最后可通过荧光发射分析样品。发射强度将与溶液中残留的纳米传感器数量成正比，因而也与存在的细菌数量成正比。

可以看出，随着细菌浓度的增加，荧光信号也随之增强，且灵敏度也进一步提高。因此，磁性与荧光两种模式的结合，使得在细菌污染的早期和晚期发育阶段均能实现检测与定量。除了可在PBS等简单溶液中检测细菌外，这些纳米传感器还能够在更复杂的介质中发挥作用，例如湖水或牛奶。

此外，这些纳米传感器已在存在非靶向细菌和热灭活靶向细菌的情况下测试了其特异性。如图所示，由于偶联抗体的特异性，磁荧光纳米传感器对非靶向或无活性细菌几乎没有反应。这表明它们在其他菌种存在的情况下仍能有效检测特定细菌。

最后，还需要强调的是，这些纳米传感器也可以很容易地被定制用于检测其他病原体。你可以在实验室中合成或配制我们所研发的这类纳米传感器，整个过程仅需一个月左右。你可以在一个月内完成制备，而这一月的成果足以支持长达十年的应用。