利用磁荧光纳米进行食源性致病菌筛选: 快速检测大肠杆菌O157:H7
September 17th, 2017
本协议的总体目标是通过磁性松弛和荧光发射方式的结合, 合成功能性纳米, 用于便携式、cost-effective 和快速检测特定靶向致病菌。
该协议的主要目标是设计和合成能够检测细菌污染物（如大肠杆菌 O157：H7）的双模态纳米传感器。磁荧光纳米传感器是通过两步程序对氧化铁纳米颗粒进行功能化而合成的。首先，将靶向抗体偶联到纳米颗粒的表面。
然后将荧光染料加载到其编码中。这些模式的配对可以快速、灵敏地检测低浓度和高浓度溶液中的细菌污染物。在存在少量细菌的情况下，由于偶联抗体的靶向，纳米传感器会聚集在细菌周围。
这种蜂群改变了纳米传感器磁芯与周围水质子的相互作用，从而能够灵敏地检测磁弛豫值的变化。随着溶液中细菌污染物浓度的增加，蜂群减少，磁性模式量化污染的能力降低。然而，随着细菌浓度的增加，生物纳米传感器的荧光呈递也会增加。
正是由于这个原因，磁性和荧光模式的配对很重要。该组合可在几分钟内检测出低至一个大肠杆菌 O157：H7 的菌落形成单位。磁荧光纳米传感器系统的第一步是制备由氯化铁和氯化铁组成的铁盐溶液。
铁将为纳米传感器提供磁芯，使其能够适应磁弛豫平台。所需的其他解决方案是聚丙烯酸和氢氧化铵。将盐酸引入铁盐溶液中，然后在涡旋时将其添加到氢氧化铵溶液中。
最后加入聚丙烯酸溶液，在反应继续的同时，将所得混合物再涡旋一小时。将所得溶液离心以沉淀较大的分子并分离小于 100 纳米的纳米颗粒。然后将溶液透析过夜以进行纯化。
下一步是将靶向抗体与新合成的铁酸纳米颗粒的聚丙烯酸编码偶联。所需的材料包括 MES 缓冲液、EDC、NHS 和选定的抗体。首先将 EDC 添加到纳米颗粒溶液中，然后加入 NHS，最后加入抗体。
然后将混合物放在台式混合器上 3 小时，同时继续反应。使用磁柱纯化溶液。磁化的色谱柱捕获纳米颗粒，仅允许自由漂浮的抗体流出。
然后用 PBS 缓冲液洗涤色谱柱，并收集共轭的纳米传感器。然后，纳米颗粒可以添加荧光染料，从而提供用于检测的第二种关键方式。我们的纳米传感器最关键的特性之一是磁和荧光模式的结合，这很重要，原因有很多。
首先，模式的组合允许每一种模式对另一种进行交叉检查，这大大降低了假阳性和假阴性的风险，这是当今使用的不同诊断平台面临的最大障碍之一。其次，这些模式的组合大大拓宽了我们不仅可以检测而且可以量化细菌污染的范围。制备纳米传感器的最后一步是将荧光染料封装在纳米颗粒的编码中。
这可以通过在涡旋时向溶液中加入染料来实现，然后让染料进一步扩散到纳米传感器的编码中。然后将功能齐全的纳米传感器进行最后一次透析以进行纯化。为了表征纳米传感器，使用 zetasizer 和荧光读板器记录大小和荧光提交。
将纳米传感器的小样品添加到比色皿水溶液中，并置于 zetasizer 中以记录大小。对于荧光分析，将纳米传感器的样品放在 96 孔板上并插入荧光读板器中。理想情况下，纳米传感器的直径约为 70 纳米，荧光呈报为 575 纳米。
除了纳米传感器的合成外，细菌的培养对于在实验室中提供细菌靶标也是必要的。使用细菌的甘油原液在营养液中制备培养物。然后让该溶液孵育。
在初始培养期之后，进行连续稀释以达到较宽的细菌浓度范围。将每种浓度的 100 微升接种到营养螺旋板上，然后孵育 24 小时。孵育后，对每个平板上的菌落进行计数，以确定每个稀释原液的菌落形成单位或每密耳的 CFU 计数。
现在细菌储备溶液已经准备好了，它们能够与制备的纳米传感器结合使用。这种细菌的特定血清型区别于其他血清型的一个重要方面是，假设如果你感染了其他血清型，你需要有很多菌落形成单位才能感染。但是在这种特定的大肠杆菌中，10 到 100 个 CFU 或菌落形成单位就足以让您感染。
我们的技术建立方式使您不会错过任何一个菌落细菌污染。为了制备在磁性松弛计中读取的溶液，首先将 300 微升 PBS 移液到 Eppendorf 管中。然后加入细菌原液样品，然后加入纳米传感器。
然后将溶液转移到玻璃管中，并在顶部放置一块封口膜以防止蒸发。然后将玻璃管放入更大的 NMR 管中，并插入磁性松弛仪中。如图所示，使用不含细菌且仅包含纳米传感器和 PBS 的基线溶液来获得基线 T2 读数。
然后将含有不同浓度细菌的溶液插入磁性松弛计进行分析，T2 值的变化是由纳米传感器和细菌之间的结合引起的。如图所示，使用这种方式可以在几分钟内检测到低至一个细菌 CFU 的存在。然而，随着细菌浓度的增加，MR 读数的量化性降低，这就是为什么使用荧光潜射数据也等同于准确的细菌量化。
在收集荧光数据之前，必须首先对样品进行离心。将溶液从玻璃管转移到 Eppendorf 管中，然后离心。这将细菌和与其结合的纳米传感器与溶液中自由漂浮的纳米传感器分开。
弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 PBS 中。最后，可以通过荧光提交对样品进行分析。发射的强度将与溶液中残留的纳米传感器的数量有关，因此也与存在的细菌数量有关。
可以看出，随着细菌浓度的增加，荧光提交会增强，并且它也变得更加敏感。这就是为什么磁性和荧光模式的配对允许在早期和晚期发育阶段检测和量化细菌污染的原因。除了检测 PBS 等简单溶液中的细菌外，这些纳米传感器还能够在更复杂的介质中发挥作用，例如湖水或牛奶。
此外，这些纳米传感器已在非目标细菌和热灭活目标细菌存在下的特异性测试。如图所示，由于偶联抗体的特异性，磁荧光纳米传感器与非靶向或非活细菌几乎没有反应。这证明了它们在存在其他物种的情况下检测特定细菌的有效性。
最后，同样重要的是要注意，这些纳米传感器也可以很容易地定制以检测其他病原体。您现在可以在一个月内合成或配制我们在实验室所做的这些纳米传感器。你可以在一个月内完成，而一个月的产品可以给你 10 年的应用时间。
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概述
本协议概述了双模式纳米传感器的设计和合成，用于快速检测病原菌，特别是大肠杆菌O157:H7。通过结合磁弛豫和荧光发射，这些纳米传感器为细菌检测提供了便携和经济高效的解决方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米技术
- 微生物学
- 生物医学工程
背景
- 病原菌带来重大的健康风险。
- 现有的检测方法可能缓慢且昂贵。
- 纳米传感器为快速检测提供了一种有前景的替代方案。
- 磁-荧光特性增强了灵敏度和特异性。
研究目的
- 开发能够快速识别细菌污染物的纳米传感器。
- 利用双模式方法提高检测能力。
- 提高各种环境中细菌检测的效率。
使用的方法
- 合成氧化铁纳米粒子。
- 将靶向抗体结合到纳米粒子上。
- 将荧光染料装载到纳米粒子中。
- 测试纳米传感器在不同细菌浓度中的响应。
主要结果
- 纳米传感器能够有效地围绕目标细菌。
- 在低浓度和高浓度下均展示了快速检测能力。
- 显示了便携和经济高效应用的潜力。
- 验证了双模式检测方法。
结论
- 双模式纳米传感器对细菌检测有效。
- 磁-荧光特性提高了检测速度和灵敏度。
- 该方法可应用于各种病原菌。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, specific detection of low-abundance pathogens like E. coli O157:H7 is critical for early intervention in food and water safety workflows. Dual-modal magneto-fluorescent nanosensors enable quantification across contamination stages, supporting risk assessment and go/no-go decisions in raw material screening. Their portability and minimal infrastructure needs allow deployment in decentralized testing environments, reducing reliance on centralized labs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antibody specificity by detecting target pathogen swarming in complex matrices.
- Operational Value: Reduces false positives through magnetic-fluorescent cross-verification, improving assay reliability in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative readouts across wide concentration ranges via complementary magnetic and fluorescent signals.
- Operational Value: Supports high-throughput adaptability due to simple mix-and-read format and stability in diverse media.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal monitoring of pathogen load in preclinical models using non-invasive sampling.
- Operational Value: Facilitates cross-platform consistency by generating comparable magnetic and fluorescence data across sites.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within microbiological hazard assessment workflows, supporting early-stage contamination screening in raw material qualification and environmental monitoring.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and specificity through nanosensor swarming and signal modulation in presence of pathogen.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs enabling threshold-based lot release decisions.
- Analytics: Generates dual-modal data (T2 relaxation shifts and fluorescence intensity) for orthogonal confirmation and dynamic range extension.
- Translational Research: Supports continuity from environmental sampling to preclinical challenge models via consistent detection principle.
- Enterprise Reuse: Platform can be reconfigured for other pathogens by antibody swap, enabling multi-target surveillance programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in contamination status through ratiometric magnetic-fluorescent correlation.
- Operational Value: Standardized, kit-compatible workflow with <1-hour time-to-result and minimal training.
- Strategic Value: Enables proactive risk mitigation in supply chains, reducing batch loss and recall exposure.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of raw materials and environmental monitoring sites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle bioconjugation and fluorescence quantification.
- Needs access to magnetic relaxometer and fluorescence plate reader for dual-modal readout.
- Demands standardization of antibody conjugation efficiency and dye loading consistency across batches.
- Must account for matrix effects in complex fluids like milk or wastewater during assay validation.
- Limited by nanosensor stability over time; requires cold-chain storage and use within defined shelf life.
