Name: 在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径爪蟾胚胎发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解光遗传学方法在爪蟾胚胎发育中可逆调控丝裂原活化蛋白激酶信号通路的实验技术。该方法利用蓝光精确控制MAPK活性，为研究细胞分化和胚胎发育中的信号动力学提供高时空分辨率的工具。

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本工作由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC）和美国国立卫生研究院（NIGMS R01GM111816）资助。

动物实验遵循伊利诺伊大学动物护理与使用委员会（IACUC）和伊利诺伊大学动物资源部（DAR）制定的指南进行。
1. 在 BHK21 哺乳动物细胞培养中通过光遗传学诱导蛋白质定位
注意：步骤 1.1–1.3 提供了一种组装用于高倍物镜成像的细胞培养腔室的方法（例如， 63倍或100倍），这些物镜通常工作距离较短。此类物镜需要使用薄玻璃盖玻片（例如， #1.5, 170 µm 厚度）作为成像基底。或者，也可使用玻璃底细胞培养皿/载玻片，此时可省略步骤1.1–1.3。
<ol>
	<li>清洗玻璃盖玻片
	<ol>
		<li>将30片玻璃盖玻片放入盖玻片架中。</li>
		<li>在600 mL塑料烧杯中加入20 g洗涤剂和400 mL温自来水。将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至洗涤剂完全溶解。用纸巾去除泡沫。</li>
		<li>使用一个100 mm × 15 mm培养皿的底部作为隔离搅拌子的垫片，并作为盖玻片架的支撑面。为在清洗过程中保持足够的液体流动，在培养皿底部打3–4个排水孔。</li>
		<li>为打排水孔，加热电烙铁并在通风橱中烧穿塑料。 
		警告：切勿用手直接接触加热的电烙铁。</li>
		<li>将盖玻片架置于培养皿上并放入烧杯中。在室温下搅拌2小时至过夜。</li>
		<li>在1,000 mL烧杯中用500 mL去离子水清洗三次。洗涤剂溶液可重复使用。</li>
		<li>使用镊子逐个夹取盖玻片，将其浸入190度（95%）乙醇中1分钟。</li>
		<li>在无菌罩内干燥盖玻片。将盖玻片储存于无菌塑料容器中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备聚-L-赖氨酸（PLL）包被的盖玻片
	<ol>
		<li>通过将1.24 g硼酸和1.9 g四硼酸钠溶解于400 mL水中，配制0.1 M硼酸盐缓冲液。用10 M NaOH调节pH至8.5。</li>
		<li>将PLL溶解于硼酸盐缓冲液中，终浓度为1 mg/mL。将PLL溶液分装至50 mL无菌离心管中。</li>
		<li>向一个10 cm组织培养皿中加入50 mL PLL包被溶液。将培养皿放入37 °C培养箱中预热PLL溶液。</li>
		<li>在无菌罩内打开盖玻片容器（步骤1.1.8）。</li>
		<li>将清洗后的盖玻片逐个浸入预热的PLL溶液中。避免产生气泡，以确保所有表面均被浸润。</li>
		<li>将带有盖玻片的培养皿置于37 °C CO2培养箱中过夜。取出每一片盖玻片，放入无菌盖玻片架中。在无菌罩内，用1,000 mL烧杯中的高压灭菌超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）清洗三次。</li>
		<li>在无菌罩内将盖玻片架中的盖玻片干燥。将盖玻片储存于无菌塑料容器中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装聚二甲基硅氧烷（PDMS）细胞培养腔室
	<ol>
		<li>在塑料容器中称取40 g PDMS基体，加入4 g固化剂，使PDMS与固化剂的质量比为10:1。用移液器吸头搅拌2分钟，使PDMS与固化剂混合均匀。也可使用离心混合器。</li>
		<li>使用直径为4英寸的烧杯作为模板，用铝箔制作一个支撑架。将铝箔支架放入15 cm培养皿中，并将一片4英寸硅片置于铝箔支架内。</li>
		<li>将混合好的PDMS溶液倒入支架中。用细玻璃棒轻轻触碰硅片边缘，去除硅片下方困住的气泡。</li>
		<li>将15 cm培养皿放入真空室中对PDMS溶液脱气。持续脱气约20分钟，直至无气泡产生。同时，将对流烘箱预热至65 °C。</li>
		<li>小心将15 cm培养皿放入烘箱中。孵育2小时。</li>
		<li>从烘箱中取出培养皿。用玻璃棒轻轻触碰PDMS边缘，确认是否完全交联。若未完全固化，则继续孵育，直至PDMS呈固态且不粘手。</li>
		<li>从培养皿上取下铝箔，并从硅片上小心剥离。从边缘开始，小心地将固化的PDMS从硅片上剥离。 
		警告：避免施加过大外力，以免损坏硅片。</li>
		<li>用剃刀将PDMS裁剪成20 mm × 30 mm的矩形，以适配24 mm × 40 mm的盖玻片。</li>
		<li>使用凿形刀片从每片PDMS中心切出一个10 mm × 20 mm的矩形开口。</li>
		<li>使用步骤1.1中所述的洗涤剂方案清洗PDMS腔室。</li>
		<li>在洁净罩内干燥PDMS腔室。将干燥的腔室放入用铝箔覆盖的可高压灭菌容器中。</li>
		<li>使用重力高压灭菌法（121 °C，15 psi）灭菌30分钟，并将容器在室温下储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BHK21细胞培养与转染
	<ol>
		<li>通过将445 mL DMEM与50 mL FBS及5 mL 100×青霉素-链霉素-谷氨酰胺（10,000 U/mL青霉素、10 mg/mL链霉素和29.2 mg/mL L-谷氨酰胺）混合，配制500 mL BHK21细胞培养基。确保FBS的终浓度为10%。</li>
		<li>分装10 mL不含HEPES的CO2-非依赖性培养基，用于活细胞成像。 
		注：CO2-非依赖性培养基可在无CO2培养箱条件下支持细胞生长，适用于大气环境下的细胞成像。详见材料清单。除BHK21细胞系外，其他类型的哺乳动物细胞也应可获得类似结果。</li>
		<li>在无菌罩内，将一个经高压灭菌的无菌PDMS腔室（步骤1.3）放置于无菌PLL包被的盖玻片（步骤1.2）上，组装成细胞培养装置。</li>
		<li>将每个装置放入无菌60 mm培养皿中。</li>
		<li>使用0.5 mL 0.25%胰蛋白酶从12孔组织培养板的一个孔中消化细胞。用血细胞计数板测定细胞密度。在腔室内加入200 µL细胞培养基，接种20,000个BHK21细胞（约10,000个细胞/cm2）。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒制备DNA质粒（参见材料清单）。 
		注：CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX的设计与功能如图1A-1B所示。</li>
		<li>细胞接种后24小时，根据制造商说明书，用50–100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX质粒转染细胞。</li>
		<li>转染后3小时，更换为200 µL新鲜培养基（步骤1.4.1），并将培养物置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育过夜，使细胞恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光活细胞成像
	<ol>
		<li>开启计算机、光源、显微镜和相机。本方案其余步骤使用共聚焦荧光显微镜（配备100×油浸物镜）。 
		注：也可使用倒置落射荧光显微镜。</li>
		<li>将细胞培养基更换为200 µL CO2-非依赖性培养基。</li>
		<li>在将细胞置于显微镜前，设置数据采集方案。使用488 nm激发的FITC通道进行光遗传学刺激。使用561 nm激发的TRITC通道定位转染细胞，并追踪mCherry标记蛋白的细胞定位。</li>
		<li>将FITC和TRITC通道的增益分别设为120和200。像素驻留时间为2.2 µs，图像尺寸为512 × 512像素。</li>
		<li>将功率计靠近物镜窗口，测量488 nm光的功率。总功率为2 µW（焦点处约10,000 W/cm2）即可诱导CIBN-CRY2PHR结合。</li>
		<li>设置时间戳采集，间隔5秒，总采集时间为2分钟。</li>
		<li>在物镜窗口上涂抹适当的折射率匹配介质（浸油）。使用相差模式对盖玻片表面的细胞进行聚焦。</li>
		<li>通过移动显微镜载物台，在561 nm光下定位转染细胞。 
		警告：此步骤避免使用蓝光，以免激活光敏蛋白之间的结合。</li>
		<li>定位到转染细胞后，开始数据采集。 
		注：成功转染的细胞应在FITC（来自2CIBN-GFP-CaaX）和TRITC（来自CRY2-mCherry-Raf1）通道中均显示荧光（图1C-D）。</li>
		<li>在FITC和TRITC通道中记录一系列带时间戳的图像（图1D）。</li>
		<li>为探究CRY2-CIBN蛋白复合物的自发解离，单独使用Txred通道记录另一组时间戳，持续20分钟，间隔30秒。</li>
		<li>保存带时间戳的图像用于数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>使用可从图像中提取强度值的图像分析软件打开图像40。</li>
		<li>选择两个代表性图像帧：一个为蓝光照射前，另一个为蓝光照射后。</li>
		<li>画一条穿过背景、细胞膜和细胞质的直线。沿此线投影强度值。保存数值并作图，以比较光照前后的差异（图1D）。</li>
		<li>为分析蛋白结合动力学，在细胞膜、细胞质和背景中各选择一个代表性感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>获取图像序列中细胞膜（IPM）、细胞质（ICYT）和背景（IBKD）的平均强度。</li>
		<li>使用以下公式计算每张图像的膜/胞质强度比： 
		<img alt="比值计算公式，荧光强度测量示意图。" src="/files/ftp_upload/55823/55823eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"></li>
		<li>绘制比值随时间变化曲线，并确定CRY2-CIBN的结合或解离动力学（图1E-F）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在CO2培养箱中构建用于长期光刺激的LED阵列
注意：实验装置的整体示意图见图 2A。
<ol>
	<li>通过将12个蓝色LED插入两个面包板并连接限流电阻来制作LED阵列。 
	注意：使用30 V电源时，可将四个LED串联连接，并通过限流电阻调节其亮度。</li>
	<li>将面包板放入铝盒中。 
	注意：铝盒的高度应为2英寸。该高度最适合照射12孔组织培养板，因为发散光斑的尺寸与单个孔的尺寸相同。</li>
	<li>使用两根金属导线连接电源。确保当光照箱置于CO2培养箱内时，导线长度足够。</li>
	<li>使用透明的光扩散板作为光照箱的盖子（图2C）。</li>
	<li>在不同电压输入范围内校准每个LED的输出功率。进行24小时PC12细胞分化实验时，使用0.2 mW/cm2的光强；进行活体Xenopus胚胎或外植体实验时，使用5 mW/cm2的光强。</li>
</ol>
3. PC12 细胞分化的光遗传学诱导
<ol>
	<li>细胞培养与转染
	<ol>
		<li>通过将407.5 mL F12K培养基与75 mL马血清、12.5 mL FBS以及5 mL 100×青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合，配制500 mL大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞培养用培养基（马血清和FBS的终浓度分别为15%和2.5%）。通过将1体积完全培养基与99体积F12K培养基混合，制备低血清培养基。</li>
		<li>以每孔300,000个细胞或75,000个细胞/cm2的密度将PC12细胞接种于12孔板中。</li>
		<li>在细胞接种后24小时转染细胞（类似于步骤1.4.7），每孔使用1.2 µg DNA。将细胞置于含5% CO2的37 °C培养箱中，在完全培养基中过夜恢复。转染后16小时检测转染效率。 
		注意：转染效率应达到30–50%，以确保有足够的细胞数量。</li>
		<li>转染后24小时，更换为低血清培养基。每孔12孔板加入1 mL培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光诱导PC12细胞分化
	<ol>
		<li>将LED阵列置于CO2培养箱内，并通过一对导线连接至电源。将LED光强设定为0.2 mW/cm2。将含有已转染PC12细胞的12孔板（步骤3.1.3）放置于LED阵列的窗口上方。在含5% CO2的37 °C培养箱中，对细胞持续光照24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光活细胞成像
	<ol>
		<li>按照步骤1.5.1–1.5.4进行显微镜和样品的准备工作。</li>
		<li>设置单次快照数据采集模式。GFP和Txred通道的曝光时间均设为200 ms。</li>
		<li>在GFP和Txred通道中分别采集转染细胞的图像。每种条件下记录约200个细胞。保存图像文件以供数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>计算分化细胞数占转染细胞总数的百分比。</li>
		<li>使用图像分析软件中的任意细胞计数模块进行细胞计数。</li>
		<li>手动计数分化细胞。 
		注意：分化细胞定义为至少有一根神经突明显长于细胞本体的细胞（图3A-3B）。</li>
		<li>对未分化细胞重复步骤3.4.3。</li>
		<li>使用以下公式计算分化率： 
		<img alt="静态平衡公式，比率 = 分化细胞数 / 总数，公式示意图。" src="/files/ftp_upload/55823/55823eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在Xenopus胚胎中通过光遗传学控制激酶活性
<ol>
	<li>缓冲液的制备
	<ol>
		<li>制备 1 L 的 1x 马克改良林格液（MMR）：100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl₂，1 mM CaCl₂，5 mM HEPES，pH 用 NaOH 调至 7.8，用去离子水定容。分装后于室温保存。2，2 mM CaCl2，5 mM HEPES；pH 7.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mRNA的制备
	<ol>
		<li>消化 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 质粒 DNA（2 µg）与 1 µL ApaI（50单位）的 37 °C 2小时。</li>
		<li>沉淀线性化DNA于 60 µL 100% 乙醇。在室温下以 12,000 × g 离心 5 分钟，使 DNA 沉淀。小心移除上清液，并用乙醇再次洗涤沉淀。 60 µL 70%乙醇。在室温下以12,000 × g离心5分钟。小心去除上清液，并将DNA沉淀重悬于 6 µL 无RNase的H2O.</li>
		<li>执行 体外 通过孵育进行转录 1 µg 线性化DNA的 2 µL 提供的SP6 RNA聚合酶、核糖核苷酸混合物（10 mM ATP、CTP和UTP；2 mM GTP；以及8 mM帽子类似物）和 20 µL 室温下用无核酸酶水孵育1小时。</li>
		<li>通过DNase I消化去除DNA模板 37 °C 至少15分钟，并使用硅胶膜离心柱纯化合成的RNA。</li>
		<li>终止反应，并通过加入以下成分沉淀 RNA 30 µL 无核酸酶水 30 µL LiCl 沉淀溶液中。充分混匀，于 -30 分钟。20 °C.</li>
		<li>离心 4 °C 在12,000 × g离心15分钟以沉淀RNA。</li>
		<li>小心吸除上清液。用 1 mL 70% 乙醇洗涤 RNA 一次，然后重悬于 40 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>加载 40 µL RNA在离心柱中的操作。离心 4 °C 在12,000 × g条件下离心1分钟，以去除未掺入的核苷酸和帽结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获 非洲爪蟾 胚胎
	<ol>
		<li>遵循 Sive 所述的方案 等41 以获得 非洲爪蟾 胚胎</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mRNA显微注射
	<ol>
		<li>使用毛细管拉制仪拉制玻璃毛细管以制备显微注射针。设置拉制程序参数为：加热值 = 355，拉力 = 80，速度 = 50，时间 = 100。</li>
		<li>用3%半胱氨酸（用0.2x MMR稀释）处理胚胎以去除胶状包被。</li>
		<li>将胚胎转移至含3%多蔗糖和0.5× MMR的溶液中用于显微注射。向每个胚胎中注射500 pg至1 ng的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA。 
		注意：注射剂量高于1 ng会导致MAPK信号通路在无蓝光条件下被激活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激酶活性的光遗传学刺激
	<ol>
		<li>将显微注射后的胚胎在室温下培养于3% polysucrose、0.5x MMR溶液中，直至发育至中 gastrula 阶段（阶段12）。随后，将胚胎转移至0.2x MMR溶液中继续培养。</li>
		<li>将胚胎或外植体转移至12孔板中。将12孔板置于自制LED阵列（步骤2.5）上，进行蓝光（475 nm）处理。</li>
		<li>将一面镜子放置在12孔板顶部，以确保胚胎或外植体完全暴露于蓝光照射下。</li>
		<li>将蓝光功率调节至 5 mW/cm²2. 
		注意：蓝光处理可在任意期望的时间进行，处理液可选用3%多蔗糖溶液、0.5× MMR溶液或0.2× MMR溶液。</li>
		<li>在任意所需时间收获胚胎，用于组织学、蛋白质印迹或基因表达分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在搭建光源箱时，应测量单个LED的功率。根据以往经验，由于制造差异，不同LED之间的输出功率可能存在差异。应选择输出功率相互之间差异在10%以内的LED组合。可根据不同类型的细胞培养容器，调整LED数量、限流电阻和输入功率。例如， 6孔或24孔板）。以0.2 mW/cm²的功率进行24小时光照。2 不会引起可检测到的光毒性44如果使用较高功率，可考虑采用间歇性光照以减少热量产生和光毒性。本方案中介绍的光遗传学系统在间歇性光照刺激下可诱导PC12细胞 neurite 出芽，其效果与连续光照刺激相当，前提是相邻两次光照之间的暗期间隔小于45分钟。44由于蛋白质结合与解离动力学存在内在差异，不同蛋白质对之间的光脉冲间隔时间需进行针对性优化。在无蓝光照射条件下，细胞质Raf1的过表达不会引起PC12细胞分化。通过控制每个胚胎中注射的mRNA量，在黑暗条件下未观察到明显的胚胎表型。
尽管低功率蓝光足以刺激CRY2与CIBN融合蛋白的结合，但蓝光穿透深度较差，...

生长因子参与多种细胞功能，包括增殖、分化、迁移和凋亡，在许多生物学过程中发挥关键作用，如胚胎发育、衰老以及精神状态的调节1,2,3,4,5。许多生长因子通过复杂的细胞内信号级联进行信号传导。这些信号事件通常以精确调控的方式通过可逆的蛋白质磷酸化来实现6,7。因此，理解负责蛋白质磷酸化的蛋白激酶的信号转导结果具有根本性的重要意义。
不同的生长因子通过相当相似的细胞内信号通路发挥作用，尽管它们能够刺激不同的细胞反应8,9。受体酪氨酸激酶常见的细胞内信号分子包括Ras、Raf、细胞外信号调节激酶（ERK）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK激酶（MEK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Akt以及磷脂酶Cγ（PLCγ）10,11。越来越多的证据表明，信号通路的多样性和特异性依赖于信号活性在空间和时间上的调控12。例如，在大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）中，表皮生长因子（EGF）刺激可导致细胞增殖，并短暂激活ERK通路9；而神经生长因子（NGF）刺激引发细胞分化，则以持续方式激活ERK通路9,13。在培养的大鼠海马神经元中，脑源性神经营养因子（BDNF）介导的短暂信号促进初级神经突生长，而持续信号则导致神经突分支增加14。在早期胚胎发育过程中，磷酸化的ERK活性在时间上呈现动态变化，并广泛分布于整个胚胎中6。最近一项在非洲爪蟾（Xenopus）早期胚胎发生过程中的遗传筛选研究表明，ERK和Akt信号级联反应——两条主要的生长因子下游通路——表现出阶段特异性的激活模式7。因此，要理解激酶信号传导的结果，就需要具备足够分辨率、可用于探测激酶活性时空特征的工具。
传统的实验方法在研究发育过程中信号转导的动态特性时，往往缺乏理想的空间和时间分辨率。例如，药理学方法利用小分子化学物质或生物分子来激活或抑制细胞和组织中的信号转导。由于这些小分子具有扩散性，难以将其作用限制在特定的目标区域15。遗传学方法（例如，转基因技术、Cre-Lox 系统或诱变）通常会导致目标基因表达或蛋白质活性的不可逆激活或抑制16,17,18。Tet-On/Tet-Off 系统19虽然在基因转录的时间控制方面有所改进，但因其依赖四环素的扩散，仍缺乏严格的空间控制。近年来，化学诱导蛋白二聚化20和光控释放技术21,22,23,24显著提升了对信号网络的时间控制能力。然而，由于被封闭化学物质本身的扩散特性，空间控制仍然具有挑战性。
近年来新兴的光遗传学方法利用光来控制蛋白质-蛋白质相互作用，能够以高时空精度和可逆性调控信号通路。在光遗传学首次成功用于控制神经元放电活动后不久25,26,27，其应用已扩展至调控其他细胞过程，如基因转录、翻译、细胞迁移、分化和凋亡28,29,30,31,32,33,34。最近开发了一种利用光可激活蛋白对拟南芥（Arabidopsis thaliana）隐花色素2（cryptochrome 2, CRY2）蛋白及其相互作用蛋白CIBN（cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix蛋白的N端结构域）的策略，用于在哺乳动物细胞和非洲爪蟾（Xenopus）胚胎中控制Raf1激酶活性35。CRY2在蓝光照射下与CIBN结合，而在黑暗条件下CRY2/CIBN蛋白复合物会自发解离34。蓝光激发CRY2的辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD），导致CRY2发生构象变化，进而与CIBN结合。通过对FAD结合口袋进行突变，可获得组成性活性（W374A）和黄素缺陷型（D387A）的CRY2突变体：CRY2W374A突变体可在无光条件下与CIBN结合，而CRY2D387A突变体在蓝光照射下无法与CIBN结合36,37。本实验方案所描述的光遗传系统利用野生型CRY2和CIBN，在活细胞中诱导蛋白转位介导的Raf1激活。已知Raf1向细胞膜募集可增强其活性38。在该系统中，串联的CIBN模块被锚定在质膜上，而CRY2-mCherry融合于Raf1的N端35。在无蓝光照射时，CRY2-mCherry-Raf1停留在细胞质中，Raf1处于非活性状态；蓝光照射诱导CRY2与CIBN结合，从而将Raf1招募至质膜，使其被激活。Raf1的激活进一步启动Raf/MEK/ERK信号级联反应。CRY2和CIBN融合蛋白均由一个双顺反子遗传系统编码。该策略可推广用于控制其他可通过蛋白转位激活的激酶，例如Akt39。本文提供了在哺乳动物细胞培养体系和多细胞生物中实施该光遗传策略的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>玻璃盖玻片&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 230</td><td>活细胞成像用底物</td></tr><tr><td>盖玻片架&amp;nbsp;</td><td>Newcomer Supply</td><td>6817B</td><td>盖玻片固定架</td></tr><tr><td>去垢剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16 000 104</td><td>用于清洗盖玻片</td></tr><tr><td>硼酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td>用于配制PLL缓冲液</td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71996-250G</td><td>用于制备&amp;nbsp; PLL缓冲液</td></tr><tr><td>塑料烧杯</td><td>Nalgene</td><td>1201-1000</td><td>用于清洗盖玻片</td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5KG</td><td>调节pH值</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274-500MG</td><td>用于包被盖玻片</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>750024</td><td>用于DNA制备</td></tr><tr><td>盖玻片镊子</td><td>Ted Pella</td><td>5645</td><td>盖玻片操作</td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Thermofisher</td><td>12565321</td><td>细胞培养皿</td></tr><tr><td>无菌离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>12-565-271</td><td>缓冲液储存</td></tr><tr><td>转染试剂</td><td>ThermoFisher</td><td>R0534</td><td>转染</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;无血清培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>18045088</td><td>用于活细胞成像</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>埃尔斯沃思粘合剂</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>制作细胞培养小室</td></tr><tr><td>质粒大量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12965</td><td>质粒制备</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965-084</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>F12K 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21127022</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>马血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16050122</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12303C-500 mL</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td>细胞培养基成分</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.25%），酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15050065&amp;nbsp;</td><td>用于哺乳动物细胞解离</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>用于DNA制备</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>用于胚胎缓冲液</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.02839.0025</td><td>卵母细胞准备</td></tr><tr><td>ApaI</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1414</td><td>质粒线性化</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2222</td><td>去除反应中的DNA模板 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 转录实验</td></tr><tr><td>折射率匹配材料（浸油）</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-20LN</td><td>为匹配样品基底与物镜的折射率</td></tr><tr><td>蓝光LED</td><td>Adafruit</td><td>301</td><td>光遗传学刺激光源</td></tr><tr><td>电阻器套件</td><td>亚马逊</td><td>EPC-103</td><td>限流电阻器</td></tr><tr><td>铝盒</td><td>BUD Industries</td><td>AC-401</td><td>光源箱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>面包板</td><td>Jekewin</td><td>837654333686</td><td>用于制作LED阵列</td></tr><tr><td>连接导线</td><td>Electronix Express</td><td>27WK22SLD25</td><td>用于制作LED阵列</td></tr><tr><td>继电器模块</td><td>Jbtek</td><td>SRD-05VDC-SL-C</td><td>用于间歇性光照控制</td></tr><tr><td>直流电源&amp;nbsp;</td><td>经颅磁刺激</td><td>直流电源-LW-(PS-305D)</td><td>LED电源</td></tr><tr><td>硅&amp;nbsp;功率&amp;nbsp;头部</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td>用于光强度测量</td></tr><tr><td>功率计</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D&amp;nbsp;</td><td>用于光强度测量</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMI8</td><td>用于活细胞成像</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1300 系列 A2</td><td>用于哺乳动物细胞操作</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Isotemp</td><td>用于哺乳动物细胞培养</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>用于胚胎显微操作</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td>用于胚胎显微注射</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P87</td><td>针头拉拔器</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM1340</td><td>对于 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 转录。该试剂盒包含无核酸酶水、SP6 RNA&amp;nbsp; 聚合酶、核糖核苷酸混合物、帽类似物、氯化锂沉淀溶液和离心柱&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNA纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于纯化合成RNA的硅胶膜旋转柱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>对流烘箱</td><td>MTI 公司</td><td>&amp;nbsp;EQ-DHG-9015</td><td>PDMS 固化</td></tr><tr><td>离心混合器和聚四氟乙烯容器</td><td>THINKY</td><td>AR310</td><td>用于混合PDMS</td></tr><tr><td>硅片</td><td>UniversityWafer</td><td>452</td><td>制作PDMS的基础材料&amp;nbsp; 设备</td></tr><tr><td>刀片</td><td>技术边缘</td><td>01-801</td><td>用于切割PDMS</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>用于注射针头的制备。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

光介导的细胞分化及xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

激酶活性对于多种细胞功能至关重要，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。在早期胚胎发育过程中，激酶活性在整个胚胎中呈现高度动态且广泛分布的特征。目前通常采用药理学和遗传学方法来研究激酶活性。然而，这些策略难以实现优异的空间和时间分辨率。此外，在活细胞和多细胞生物体中以可逆方式调控激酶活性尚不可行。这一局限性仍是深入定量理解发育与分化过程中激酶活性的主要瓶颈。本研究介绍了一种光遗传学策略，利用包含光可激活蛋白拟南芥（Arabidopsis thaliana）隐花色素2（CRY2）和隐花色素相互作用碱性-螺旋-环-螺旋蛋白N端结构域（CIBN）的双顺反子系统，通过光介导的蛋白质转位在活细胞中实现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的可逆激活。该方法可应用于哺乳动物细胞培养体系以及活体脊椎动物胚胎。该双顺反子系统具有普适性，可用于调控其他具有类似激活机制的激酶活性，并适用于其他模式系统。

光可激活蛋白对的比率表达：图1A展示了基于猪捷申病毒-1的2A（P2A）肽（在哺乳动物细胞系中具有最高的核糖体跳跃效率）构建的双顺反子光遗传学载体 CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（简称为 CRY2-2A-2CIBN）的设计42。在先前的研究中已确定，CIBN-GFP-CaaX : CRY2-mCherry-Raf1 的最佳比例为 2:135。该构型可实现 CRY2-mCherry-Raf1 在细胞膜上的充分募集与激活（图1B）。单独转染 CRY2-2A-2CIBN 的细胞在 GFP 和 Txred 荧光通道中均表现出明显的荧光信号，无论是在落射照明下（图1C）还是共聚焦显微镜下（图1D）。蓝光...

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

激酶活性对于多种细胞功能至关重要，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。在早期……

本实验的总体目标是利用光在完整细胞和非洲爪蟾胚胎中控制丝裂原活化蛋白激酶信号通路。该方法有助于解答细胞生物学和发育生物学中的关键问题，例如激酶活性的时间调控如何影响细胞分化过程中的自我决定以及胚胎发育过程。该技术的主要优势在于，可在完整细胞及多细胞生物体（如正在发育的胚胎）中可逆地调控丝裂原活化蛋白激酶的活性。该方法可用于研究非洲爪蟾胚胎发育过程中的信号传导动力学，也可应用于其他模式系统，如索科特拉岛生物、斑马鱼或小鼠。今天，我实验室的一名研究生Vishnu Krishnamurthy将演示该实验操作流程。以及我实验室的一名博士后研究员Aurora Turgeon，将演示涉及非洲爪蟾胚胎的全部操作步骤。首先，将一个经高压灭菌的无菌PDMS腔室置于60 mm培养皿中经多聚赖氨酸（PLL）包被的无菌盖玻片上，以组装细胞培养装置。接着，使用0.5 mL的0.25%胰蛋白酶将pHK21细胞从6孔组织培养板的一个孔中消化下来。使用血细胞计数板计数细胞密度后，将20,000个细胞接种至培养腔中，加入200 µL细胞培养基。细胞铺板24小时后，按照制造商说明书，使用50至100 ng的CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG of PCaA X质粒转染细胞。转染3小时后，更换为200 µL新鲜培养基，并将细胞置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜，使其恢复。第二天，首先将细胞培养基更换为 200 微升的二氧化碳独立培养基，然后开始光遗传学诱导和成像。设置数据采集程序：选择 488 纳米激发的 FITC 通道用于光遗传学刺激，选择 561 纳米激发的 CRITC 通道以追踪 mCherry 标记蛋白的细胞定位。将功率计放置在物镜窗口附近，测量蓝光的功率。总功率为2微瓦即可诱导CIBN与CRY2-PHR结合。设置时间戳采集，时间间隔为5秒。总采集时间为两分钟。在物镜窗口涂抹适当的折射率匹配介质。将细胞培养腔室置于显微镜载物台上，使用明场模式并通过目镜对盖玻片表面的细胞进行聚焦。接下来，移动显微镜载物台，在绿色光下定位一个转染的细胞。在FITC和CITC通道中记录一系列带有时间戳的图像。基础样本图像显示CIBNGPCAAX定位于质膜上。这是在蓝光刺激前 CRY2 mCherry raf1 的一个快照，而此图像显示的是在十次蓝光脉冲刺激后 CRY2 mCherry raf1 的一个快照。通过将蓝色LED灯插入两个面包板并连接限流电阻来制作LED阵列。将面包板放入铝盒中。插入两根金属导线，将电路板连接到电源。当将光源箱放置在二氧化碳培养箱内时，确保导线长度足够。然后放置一个透明的光扩散板，作为光源箱的盖子。最后，在一系列电压输入条件下校准每个LED的输出功率。在进行24小时PC12细胞分化实验时，使用0.2毫瓦每平方厘米的功率。将LED阵列置于37摄氏度、补充5%二氧化碳的培养箱中。使用金属导线将其连接到电源，并将LED的功率设置为每平方厘米0.2毫瓦。将含有转染PC12细胞的12孔板放置在LED阵列的窗口上。调整板的位置，使每个孔均被完全照亮。持续光照24小时。为成像已分化的细胞，设置单次快照数据采集，GFP和TexasRed通道的曝光时间均设为200毫秒。在GFP和TexasRed通道中拍摄转染细胞的图像，并将文件保存用于数据分析。首先，使用毛细管拉制仪拉制玻璃毛细管，制备用于RNA显微注射的针头。用含3%半胱氨酸的0.2 XMMR溶液处理胚胎15分钟，以去除其胶状包被。将胚胎转移至3% polysucrose和0.5×MMR溶液中用于显微注射。准确向每个胚胎注射500皮克至1纳克的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA。然后将显微注射后的胚胎在室温下置于显微注射溶液中培养。当胚胎发育至中囊胚期时，将其转移至0.2x MMR溶液中，并继续培养至所需的发育阶段。随后将12孔板置于自制的LED阵列上进行蓝光处理。在12孔板上方放置一面镜子，以确保胚胎得到充分的蓝光照射。在蓝光照射所需时间后，收集胚胎用于组织学、蛋白质印迹或基因表达分析。此图像显示了PC12细胞在0.2毫瓦/平方厘米的蓝光刺激24小时后，转染CRY2-2A-2CIBN的多通道快照。可观察到GFP和mCherry报告基因信号。圆形标记已分化的细胞，方形标记未分化的细胞。此处的细胞处理方式与前一张图像中的细胞相同，但未使用蓝光刺激。未观察到分化现象。这些细胞在转染组成型活性 raf1（raf1 GFPCaaX）后显示出代表性结果。圆形和矩形分别标记已分化和未分化的细胞。该直方图显示了转染 CA-Raf1、共转染 CRY2 mCherry raf1 与 CIBN GFP Caax 以及单独转染 CRY2A 2CIBN 的 PC12 细胞的分化比例。只有暴露于蓝光的细胞显示出显著的分化。该图像显示了未注射mRNA且未经光照处理的正常非洲爪蟾胚胎的形态。该图像显示了注射了CRY2 2A2CIBN mRNA并接受蓝光刺激的胚胎。通过蓝光照射注射了CRY2 2A2CIBN的胚胎，激活raf1可诱导头部区域形成异位的尾状结构。采用此方法后，还可进一步解答其他问题，例如有丝分裂原活化蛋白激酶通路在特定发育阶段的激活如何调控基因表达。这种光遗传学方法可推广应用于调控具有类似激活机制的其他信号通路。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径<em&gt;爪蟾</em&gt;胚胎发育

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