在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径爪蟾胚胎发育

本实验的总体目标是利用光控制完整细胞和非洲爪蟾胚胎中的丝裂原活化蛋白激酶信号通路。这种方法可以帮助回答细胞和发育生物学中的关键问题，例如激酶活性的时间调节如何调节细胞分化和胚胎发育过程中的自我决定。该技术的主要优点是丝裂原活化蛋白激酶活性可以在完整细胞和多细胞生物（如发育中的胚胎）中可逆地控制。

这种方法可以深入了解非洲爪蟾胚胎发育过程中的信号动力学。它还可以应用于其他模型系统，例如 socotra、zebrafish 或 mouse。今天，我实验室的研究生 Vishnu Krishnamurthy 将演示该程序。

我实验室的后星 Aurora Turgeon 将演示非洲爪蟾胚胎所涉及的所有程序。首先，通过将一个高压灭菌的无菌 PDMS 室放在 60 mm 培养皿中的无菌 PLL 涂层盖玻片上来组装细胞培养装置。接下来，使用 0.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶从 6 孔组织培养板的一个孔中分离 pHK21 细胞。

用血细胞计数器计数细胞密度后，在 200 微升细胞培养基中接种 20， 000 个细胞。细胞铺板后 24 小时，根据制造商的方案，用 50 至 100 ng 的 CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG 的 PCaA X 质粒转染细胞。转染后 3 小时，将培养基更换为 200 μL 新鲜培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育培养物，让细胞恢复过夜。

第二天，首先用 200 微升不依赖二氧化碳的培养基替换细胞培养基，开始光遗传学诱导和成像。然后设置数据采集协议。选择 488 非强度激发 FITC 通道进行光遗传学刺激，选择 561 纳米激发 CRITC 通道来追踪 mCherry 标记蛋白的细胞定位。

通过将功率计放置在物镜窗口附近来测量蓝光的功率。2 微瓦的总功率足以诱导 CIBN CRY2-PHR 结合。设置间隔为 5 秒的时间戳采集。

总采集时间为 2 分钟。在物镜窗口上应用适当的索引匹配材料。将细胞室放在显微镜载物台上，并使用明场模式使用目镜聚焦在盖玻片表面上的细胞上。

接下来，移动显微镜载物台，在绿光下定位转染的细胞。在 FITC 和 CITC 通道中录制一系列带时间戳的图像。基本样品图像显示 CIBNGPCAAX 定位于质膜上。

这是 CRY2 mCherry raf1 在蓝光模拟前的快照，而这张图片显示了 CRY2 mCherry raf 在 10 个蓝光刺激脉冲后的快照。通过将色调蓝色 LED 插入两个试验板并连接限流电阻器来制作 LED 阵列。将试验板放入铝盒中。

插入两根金属线，将电路板连接到电源。将灯箱放入二氧化碳培养箱时，确保电线的长度足够。然后放置一个透明的光扩散器作为灯箱的盖子。

最后，在一定电压输入范围内校准每个 LED 的功率输出。使用零点 2 毫瓦/平方厘米的功率进行 24 小时 PC12 细胞分化测定。将 LED 阵列放入补充有 5% 二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中。

使用金属线将其连接到电源，并将 LED 的功率设置为零点，每平方厘米 2 毫瓦。将含有转染 PC12 细胞的 12 孔板放在 LED 阵列的窗口上。对齐板，使每个孔都完全照亮。

应用 24 小时的连续光照。要对分化的细胞进行成像，请设置单快照数据采集。对 GFP 和 TexasRed 通道使用 200 毫秒。

在 GFP 和 TexasRed 通道中捕获转染细胞的图像，并保存文件以进行数据分析。通过用毛细管拉拔器拉动玻璃毛细管来制造用于 RNA 显微注射的针头来开始此过程。用 3% 的半胱氨酸稀释 0.2 XMMR 处理胚胎 15 分钟，去除胚胎上的果冻涂层。

将胚胎转移到 3% 聚蔗糖和零点 5 XMMR 溶液中进行显微注射。将 500 pg 准确注射到每个胚胎中 1 ng 的 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA 中。然后在室温下在显微注射溶液中培养显微注射胚胎。

当胚胎达到原肠胃阶段时，将它们转移到 0.2x MMR 溶液中，并继续培养直到所需的发育阶段。然后将 12 孔板放在自制的 LED 阵列上进行蓝光处理。在 12 孔板的顶部放置一面镜子，以确保胚胎的全蓝光照明。

在蓝光下暴露所需时间后，收获胚胎用于组织学、蛋白质印迹或基因表达分析。该图像显示了在零点 2 毫瓦/平方厘米的蓝光刺激 24 小时后，用 CRY2-2A-2CIBN 转染的 PC12 细胞的多通道快照。可以看到 GFP 和 mCherry 报告基因。

圆圈标记分化细胞，正方形标记未分化细胞。这里的细胞处理方式与前一张图像中的细胞相同，只是没有使用蓝光刺激。未见鉴别。

这些细胞在转染 raf1 GFPCaaX（一种具有组成型活性的 raf1）后显示出代表性结果。圆形和矩形分别标记分化和未分化的细胞。该直方图显示了转染 CA-Raf1、共转染 CRY2 mCherry raf1 和 CIBN GFP Caax 以及单独转染 CRY2A 2CIBN 的 PC12 细胞的分化率。

只有暴露于蓝光的细胞显示出显著的分化。该图像显示了未注射 MRNA 和光处理的正常非洲爪蟾胚胎的形态。这张图片显示了注射 CRY2 2A2CIBN MRNA 并受到蓝光刺激的胚胎。

通过用蓝光处理 CRY2 2A2CIBN 注射的胚胎来激活 raf1，在头部区域诱导异位尾状结构。按照此程序，可以回答其他问题，例如丝裂原活化蛋白激酶通路的阶段特异性激活如何调节基因表达。这种光遗传学方法可以推广到控制具有相似激活机制的其他信号通路。