Name: 用于炎症反应的新内皮调节因子的筛选测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学习筛选测定内皮调节因子的方法，用于研究炎症反应中白细胞募集的调控机制。该方法有助于开发针对炎症性疾病的新型治疗策略。

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本工作由西班牙经济与竞争力部（MINECO）和卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）资助（资助号 IERPY 1149/16，授予 A.L.；MPY 1410/09，授予 S. Hortelano）；以及由 MINECO 通过卫生研究基金（FIS）资助（资助号 PI11.0036 和 PI14.0055，授予 S. Hortelano）。S. Herranz 获得了 ISCIII 的 IERPY 1149/16 项目资助。

1. 内皮细胞培养
<ol>
	<li>组织培养处理板
	<ol>
		<li>在37 °C条件下，用2.5 mL凝胶溶液（经高压灭菌的0.1%凝胶溶于蒸馏水中）包被100 mm组织培养板，孵育30分钟；可根据所需孔板规格按比例调整体积。吸除凝胶溶液，并将培养板置于组织培养超净台中自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织培养条件
	<ol>
		<li>将MLEC-04细胞置于生化培养箱中培养（37 °C，95%湿度，5% CO2）。使用完全培养基——杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F-12），添加10%胎牛血清（FBS）以及100单位/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（P/S）进行细胞培养。</li>
		<li>采用标准血球计数板法计数细胞，并将MLEC-04细胞以每10 mL完全培养基接种至经凝胶处理的100 mm培养板中，接种密度为2 - 11 × 104 个细胞/cm2。当细胞达到汇合状态时，按1:3比例传代。
		 
		注：通常在培养2至3天后达到汇合。</li>
		<li>传代时，先用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养板，随后加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶，5 mM EDTA），于37 °C孵育3分钟。</li>
		<li>加入10 mL完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA反应，并收集悬浮细胞。离心细胞悬液（300 × g，5分钟），弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全培养基中，并按适当比例进行传代培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. LPS 处理与介质
<ol>
	<li>将MLEC-04细胞以亚汇合状态接种于完全培养基中，接种至以下孔板规格：7 x 105 细胞/孔，接种于6孔板，2.5 × 105 96孔板中每孔的细胞数</li>
	<li>在细胞培养箱（37 °C，95% 湿度，5% CO₂）中培养 6 小时2)。将细胞换用不完全培养基（DMEM-F12，P/S），置于培养箱中过夜（ON），以实现细胞同步化并降低细胞活性。</li>
	<li>吸除培养基，通过将内皮细胞与待测药物（或不加药物）共同孵育，以评估新型药理学化合物的作用例如 DT10) 用不完全培养基稀释（30 分钟，37 °C）；每孔加入 1.4 mL（6 孔板）或 0.14 mL（96 孔板）。</li>
	<li>通过在培养基中加入LPS（终浓度为100 ng/mL）处理细胞，处理时间根据每项检测的具体要求而定。以PBS作为对照。</li>
</ol>
3. 通过RT-qPCR评估活化内皮细胞的转录谱
<ol>
	<li>将 MLEC-04 细胞以亚汇合密度接种于 6 孔培养板中（7 × 105 个细胞/孔）。在 37 °C、95% 湿度、5% CO2 条件下孵育 6 小时，随后进行血清饥饿处理（过夜孵育）。</li>
	<li>吸除培养基，用含目标药物的不完全培养基处理（或不处理）内皮细胞培养物（37 °C 孵育 30 分钟）；每孔加入 1.4 mL（30 分钟，37 °C）。</li>
	<li>向孵育中的培养基加入 100 ng/mL LPS 以刺激细胞（如步骤 2.3 所述），继续孵育 6 小时。用预冷的 PBS 洗涤两次以终止反应，将培养板置于 -80 °C 保存，直至进行样本处理。</li>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>将培养板解冻，每孔加入 1 mL RNA 提取缓冲液（含 38% 苯酚和 0.8 M 异硫氰酸胍；参见材料表）。室温（RT）振荡 30 分钟，收集匀浆液至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>加入 200 µL 氯仿，轻轻振荡 15 秒。室温孵育 3 分钟后离心（11,600 × g，15 分钟，4 °C）。</li>
		<li>将水相转移至另一 1.5 mL 离心管中。加入 500 µL 异丙醇沉淀 RNA，室温孵育 10 分钟，随后离心（11,600 × g，4 °C）。</li>
		<li>弃去上清液，用 75% 乙醇通过涡旋振荡洗涤沉淀，再离心（7,500 × g，4 °C）。</li>
		<li>将沉淀空气干燥，加入 25 µL 纯 H2O，55 °C 孵育 10 分钟以溶解 RNA。将 RNA 样本保存于 -80 °C，直至进行后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 浓度与纯度检测
	<ol>
		<li>使用分光光度计测定样本在 260 nm 处的吸光度，以定量 RNA 浓度（参见材料表）。</li>
		<li>同时测定 230 nm 和 280 nm 处的吸光度，以评估 RNA 纯度。 
		注：260/280 比值反映蛋白质或苯酚污染，接近 2 的比值可接受；260/230 比值反映 EDTA、碳水化合物或苯酚等污染物，2.0–2.2 之间的数值可接受。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测 RNA 完整性
	<ol>
		<li>取 2 µg 总 RNA 与 RNA 标准品一同在 1.5% 变性琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶成像系统观察结果（参见材料表）。 
		注：28S 与 18S rRNA 条带清晰且锐利，其强度比约为 2:1，表明 RNA 完整；部分降解的 RNA 会呈现弥散条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-qPCR
	<ol>
		<li>按照标准操作流程，以单链 RNA 为模板合成互补 DNA（cDNA）（参见材料表）11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 RT-qPCR 检测基因表达
	<ol>
		<li>为每个样本配制反应体系：将 2 µL cDNA、7 µL 荧光化合物、300 nM 正向引物和 300 nM 反向引物（表 1）混合，终体积为 13 µL，加入 96 孔反应板中（参见材料表）。</li>
		<li>用光学粘性封膜密封反应板，离心（300 × g，1 分钟），然后在实时荧光定量 PCR 系统上运行反应（95 °C 热启动 20 秒，随后进行 40 个循环：95 °C 3 秒，60 °C 30 秒）（参见材料表）。</li>
		<li>采用相对定量法，通过 2-ΔΔCt 比较法分析结果，以内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）或酸性核糖体磷蛋白 P0（36B4）进行标准化12。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术评估内皮细胞活化
<ol>
	<li>按照第2节所述条件处理MLEC-04细胞，并通过流式细胞术评估内皮表面蛋白的变化。</li>
	<li>在LPS刺激6小时后，采用步骤1.2.3中所述的胰蛋白酶-EDTA法消化细胞，并用不完全培养基在4 °C下洗涤。</li>
	<li>使用血球计数板法计数细胞，将10 × 104个细胞接种至U型底96孔板中，离心（300 × g，5分钟），然后通过手腕快速翻转180°（从顶部到底部）并迅速恢复原位的方式弃去上清液。</li>
	<li>向细胞中加入50 µL用不完全培养基稀释的选定抗体（终浓度为10 µg/mL），在4 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>按照步骤4.3所述方法，用不完全培养基洗涤细胞两次，随后加入50 µL相应二抗（与FITC或类似荧光基团偶联，终浓度为10 µg/mL），在4 °C避光条件下孵育30分钟。</li>
	<li>先用不完全培养基洗涤细胞一次，再用PBS洗涤一次。使用1 mL移液器吸头加入300 µL PBS重悬细胞，转移至流式管中。</li>
	<li>在流式细胞仪系统中检测样品（参见材料表）。根据前向散射和侧向散射参数调整细胞群，圈选目标细胞群。以同型对照抗体孵育的细胞作为阴性对照，设定设门范围。结果以阳性细胞百分比或平均荧光强度进行分析8。</li>
</ol>
5. 通过蛋白质印迹法评估内皮细胞活化
<ol>
	<li>在6孔培养板中以亚汇合状态接种内皮细胞（7 x 10⁵ 细胞/孔）5 细胞/孔），并按第2节所述用LPS处理。随后按照以下Western印迹实验方案分析炎症相关蛋白的表达。</li>
	<li>在不同时间点终止LPS刺激，以阐明内皮细胞反应的不同方面：
	<ol>
		<li>确定脂多糖刺激6小时后的炎症蛋白谱型。</li>
		<li>在60分钟内每15分钟测定一次细胞信号传导。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在这两种情况下，用预冷的PBS洗涤两次以终止反应，并将样品在-80 °C保存，直至进行后续样本处理。</li>
	<li>裂解细胞与蛋白质提取
	<ol>
		<li>向每个孔中加入 200 µL 裂解缓冲液（含 1% 非离子型表面活性剂、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、150 mM 氯化钠、30 mM 焦磷酸钠、50 mM 氟化钠、2.1 mM 正钒酸钠，pH 7.6，并添加蛋白酶抑制剂混合物）（见材料表）。</li>
		<li>在 4 °C 下振荡孵育 15 分钟，用移液器吸头刮取孔内样品，并将匀浆收集至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 11,600 x g 离心试管。</li>
		<li>将上清液置于干净的1.5 mL离心管中，于-80 °C保存至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用BCA法（二辛可宁酸法）按照标准操作步骤（参见材料表）测定蛋白质浓度13.</li>
	<li>采用标准的0.1%十二烷基硫酸钠-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，分别分离各样本的30 µg总蛋白裂解液14根据所用抗体的不同，选择在含10 mM β-巯基乙醇（还原条件）或不含β-巯基乙醇（非还原条件）的情况下上样。</li>
	<li>将分离后的蛋白质通过标准程序从聚丙烯酰胺凝胶转移至孔径为0.45 µm的聚偏二氟乙烯（PVDF）转印膜上。</li>
	<li>转移后，用含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）洗涤膜两次，随后在摇床上加入20 mL PBS-T稀释的2%牛血清白蛋白（用于检测磷酸化蛋白）或5%脱脂奶粉（用于总蛋白），封闭非特异性结合位点（90分钟，室温）。</li>
	<li>将所选抗体按推荐浓度加入10 mL适当的封闭缓冲液中稀释，在4 °C条件下振荡孵育过夜（ON）。或者，将膜置于密封塑料袋中，使用5 mL稀释后的抗体进行孵育。</li>
	<li>次日，用过量 PBS-T 缓冲液在室温下洗涤膜三次，每次 15 分钟。</li>
	<li>在适当封闭缓冲液中将与辣根过氧化物酶（HRP）结合的相应二抗按1:10,000比例稀释，取10 mL，在室温下振荡孵育膜30分钟。</li>
	<li>在摇床上用过量 PBS-T 缓冲液洗涤膜三次（每次 15 分钟，室温）。</li>
	<li>将膜与0.1 mL/cm的溶液孵育1分钟2 使用过氧化物酶底物增强型化学发光（ECL）。将沥干的膜置于两张透明塑料片之间，插入包含电荷耦合器件相机（CCD）的化学发光检测系统中。
	<ol>
		<li>使用CCD相机检测信号，并利用其软件通过累积程序记录图像（图像显示每次曝光30秒，共累积15分钟的信号）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ImageJ 软件按照用户指南中描述的方案，通过密度测定法对条带强度进行定量分析15.
	<ol>
		<li>在 ImageJ 软件中打开样本，使用矩形选择工具选中目标条带。</li>
		<li>选择第一条泳道，然后点击“绘制泳道”以获得轮廓图。</li>
		<li>使用直线选择工具界定峰的区域。</li>
		<li>通过点击每个峰的内部来测量每条带的大小。</li>
		<li>以加载蛋白对照（β-actin、tubulin）表示结果 等等。).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 通过黏附实验评估白细胞活化后释放的内皮因子
<ol>
	<li>获取内皮细胞条件培养基。
	<ol>
		<li>按照第2节所述处理MLEC-04细胞，并在LPS（100 ng/mL）刺激24小时后收集培养上清液。</li>
		<li>收集经处理的MLEC-04细胞的条件培养基，离心（600 × g）。将上清液分装至0.5 mL等份，于-80 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>白细胞黏附实验
	<ol>
		<li>用PBS稀释选定的细胞外基质蛋白（胶原蛋白除外，需用0.1 M乙酸稀释），每孔加入50 µL包被96孔板：纤连蛋白（1 - 10 µg/mL）、层粘连蛋白（1 - 10 µg/mL）和I型胶原蛋白（10 - 40 µg/mL）。4 °C过夜孵育。</li>
		<li>弃去包被液，每孔加入150 µL含1%热灭活BSA（100 °C加热1分钟）的PBS，室温封闭90分钟以阻断非特异性结合位点。</li>
		<li>用PBS洗涤孔板两次，每孔加入100 µL先前收集的内皮细胞条件培养基（第6.1节）。 
		注意：孔板现已准备好用于进行黏附实验。</li>
		<li>在生物培养箱（37 °C，95%湿度，5% CO2）中，使用RPMI培养基（含10% FBS和1% P/S）培养小鼠单核-巨噬细胞系J774。 
		注意：J774细胞为悬浮生长。</li>
		<li>将J774细胞收集至15 mL离心管中，离心（300 × g，5分钟）。弃去上清液，用10 mL无血清培养基重悬细胞沉淀。使用Neubauer计数板进行细胞计数。再次离心（300 × g，5分钟），弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞，调整浓度为每50 µL培养基含15 × 104个J774细胞。</li>
		<li>每孔加入50 µL无血清培养基中含有15 × 104个J774细胞，先在4 °C孵育15分钟，随后在CO2细胞培养箱中37 °C孵育1小时。</li>
		<li>轻轻加入温热的PBS洗涤孔板两次，离心（300 × g，5分钟），通过快速手腕翻转（从顶部到底部180°翻转并迅速恢复原位）弃去上清液。每孔加入100 µL PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）固定贴壁细胞，室温孵育10分钟。</li>
		<li>轻柔弃去固定液，用含2%甲醇的PBS在室温下透化细胞2分钟。再次轻柔弃去液体，每孔加入50 µL含0.5%结晶紫的20%甲醇溶液，室温染色90秒。</li>
		<li>用大量流动水冲洗孔板，弃去多余液体后自然晾干。使用连接光学显微镜的数码相机记录贴壁细胞情况。</li>
		<li>每孔加入100 µL含0.1 M柠檬酸钠和50%乙醇的溶液溶解染色，于545 nm波长处测定吸光度。结果以吸光度任意单位或黏附百分比表示，其中以高配体浓度包被孔中达到的细胞黏附为100%参照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过白细胞-内皮细胞共黏附实验检测内皮细胞活化
<ol>
	<li>按照第2节所述方法处理96孔板中的MLEC-04细胞，并用LPS孵育（6小时，37 °C）。</li>
	<li>用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CSFE）荧光标记J774细胞。
	<ol>
		<li>按照6.2.5节步骤用PBS洗涤J774细胞，采用Neubauer计数法进行细胞计数，并将细胞重悬于含0.1% BSA的PBS中，浓度为1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>将细胞与CFSE（终浓度5 µM）在37 °C下孵育20分钟，然后加入5 mL不完全培养基，在4 °C下孵育5分钟。</li>
		<li>按照6.2.5节所述方法用不完全培养基洗涤一次，重悬为15 × 104 个细胞/100 µL，随后进行共粘附实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮细胞处理后，用不完全培养基洗涤孔板三次。向每孔内皮细胞包被的孔中加入CFSE标记的J774细胞（15 × 104 个细胞/100 µL）。先在4 °C孵育10分钟，随后在37 °C孵育60分钟。</li>
	<li>按照6.2.7节所述方法，使用预温的PBS轻柔洗涤各孔，并通过以下两种方法报告J774细胞对内皮层的粘附情况：
	<ol>
		<li>用0.1 M Tris-HCl（pH 8.8）含1% SDS的裂解液（100 µL/孔）裂解细胞，通过荧光测定法检测CFSE-J774信号（激发/发射波长 = 492 nm/517 nm）。结果以荧光强度的任意单位表示，或相对于阳性对照（每孔加入的总细胞信号）计算粘附百分比。</li>
		<li>用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，并在荧光显微镜下观察（激发/发射波长 = 492 nm/517 nm），以评估CFSE-J774细胞与内皮层的粘附情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Tedgui, A., Mallat, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+mechanisms+in+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall.</a> Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).</li>
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<li>Guha, M., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induction+of+gene+expression+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">LPS induction of gene expression in human monocytes.</a> Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该内皮细胞实验方案描述了一种逐步技术，为探索参与调控炎症反应的新型机制奠定了基础。这些方法基于对脂多糖（LPS）刺激下内皮细胞活性的研究，评估炎症反应中白细胞募集的关键步骤，具体包括：内皮细胞释放细胞因子、内皮细胞黏附分子的表达以及白细胞与血管层的黏附。在确立内皮细胞相关参数后，该系统可用于筛选参与调控内皮细胞功能及炎症进程的新型化合物。这些具有调控作用的药物可能在制药领域具有重要应用前景。本系列实验方案的主要目标是建立一个基础框架，通过调整相应的血管活性参数，将此类研究拓展至不同类型的内皮细胞及不同的刺激条件。
通过该筛选选出的药物将成为设计针对炎症性疾病的新型治疗策略的有趣候选药物。一方面，促进内皮细胞反应并有助于白细胞募集的化合物将对免疫缺陷疾病具有良好的应用前景16,17；另一方面，内皮细胞抑制剂则有望成为治疗慢性炎症性疾病的优良疗法10。
由活化的内皮细...

炎症是机体针对病原体的一种有益生物学反应，其主要目的是清除病原体并修复受损组织。在某些情况下，例如慢性感染或自身免疫性疾病中，炎症无法消退，反而出现异常反应，导致白细胞持续浸润，引发持久的免疫反应，从而造成组织损伤、纤维化、功能丧失，最终导致患者残疾，甚至在某些情况下死亡。这些被归类为炎症性疾病的疾病均涉及血管对白细胞渗出的调控1,2。
内皮细胞通过调控白细胞迁移在炎症反应的调节中发挥着基础性作用。当内皮层暴露于LPS等炎症介质时，静息状态的内皮细胞被激活并表达促炎性细胞因子（Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1）， 等。）以及促进循环白细胞向感染部位募集的黏附分子（E-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1）。被释放的细胞因子激活的白细胞随后通过相应的黏附分子配体与血管内皮层发生滚动和相互作用：PSGL-1 与选择素结合，α4β1 整合素与 VCAM-1 结合，αLβ2 整合素与 ICAM-1 结合。最终，白细胞穿越血管壁，向炎症病灶迁移。3.
内皮细胞在调控炎症反应中的关键作用已在基因改造小鼠中得到证实，这些小鼠仅在内皮细胞上表达脂多糖（LPS）受体——Toll样受体4（TLR4）。这类内皮细胞特异性表达TLR4的小鼠能够对LPS介导的炎症产生反应，并检测细菌接种后引发的感染，从而在与野生型小鼠相似的水平上实现感染清除和存活4,5。
对于内皮调节的炎症反应通路，已有假说认为，在白细胞-内皮细胞相互作用的某些阶段进行抑制，将减少白细胞跨内皮迁移，并改善与炎症相关疾病的预后。事实上，已有多种针对内皮细胞活化及白细胞-内皮细胞相互作用的策略被设计用于阻碍免疫细胞的渗出，作为治疗炎症性疾病的方法6,7。
在本报告中，我们描述了一组全面的体外技术，用于充分表征内皮细胞在炎症刺激LPS作用下的活性，及其在白细胞活化和黏附于血管层过程中的作用。本研究中使用的内皮细胞模型为小鼠肺内皮细胞系（MLEC-04），如Hortelano 等8所述。文献已证实，MLEC-04细胞系是研究内皮细胞活化的合适体系9,10。根据研究需求，这些方法可轻松推广至其他内皮细胞或白细胞系统及不同的炎症谱型。一旦确定了所选条件下的内皮细胞参数，该体系即可用于测试新药在所设计实验中的效果，以评估其对血管活化的影响。在此炎症背景下，可将用目标化合物处理的内皮细胞与对照条件下的细胞进行比较，任何观察到的差异均可能提示该药物在炎症发生与发展过程中的预后作用。综上所述，我们提出了一种有效的体系，可用于鉴定作用于内皮细胞的新药物靶点，从而推动针对炎症相关疾病的新型血管特异性治疗策略的设计。

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>RNA提取缓冲液</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>无RN酶纯H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>无RN酶</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 第一链合成试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>RT-PCR试剂</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>qPCR荧光染料</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96孔板</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>qPCR用板</td></tr><tr><td>U型底96孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>流式管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA蛋白定量试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>双辛可宁酸法蛋白定量试剂</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>merck</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>PVDF转印膜，0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>聚山梨酯20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>96%乙醇</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>多功能微孔板读板仪</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>凝胶成像系统</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>StepOnePlus</td><td>qPCR系统</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>流式细胞仪设备</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>化学发光检测系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>E-选择素</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗大鼠IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗 Armenian hamster-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>大鼠IgG同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Armenian hamster IgG同型对照</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-I&amp;kappa;&amp;Beta;-&amp;alpha;</td><td>Cell Signaling</td><td>2859</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>使用稀释比例为 1:10,000</td></tr><tr><td>抗兔HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>使用稀释比例为 1:10,000</td></tr><tr><td>抗大鼠HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-3823</td><td>使用稀释比例为 1:10,000</td></tr></tbody></table>

用于表征炎症反应中新型内皮调节因子的筛选实验

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

内皮层通过调控多种不同功能，在维持机体稳态中起着至关重要的作用。内皮层对炎症反应的调控对于有效抵御有害刺激以及促进受损区域的修复至关重要。当内皮细胞暴露于炎症环境（例如革兰氏阴性菌细胞膜的外层成分脂多糖（LPS））时，会表达可溶性促炎细胞因子（如Ccl5、Cxcl1和Cxcl10），并触发循环白细胞的活化。此外，内皮细胞表面黏附分子E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的表达，可介导活化白细胞与内皮层的相互作用和黏附，并最终促使白细胞迁移至炎症组织。在此情况下，必须对内皮功能进行严密调控，因为白细胞募集过程中过度或不足的活化均可能导致与炎症相关的疾病。由于许多此类疾病目前尚无有效治疗方法，因此亟需探索以血管内皮层为靶点的新型治疗策略。我们提出一系列综合性实验方法，可用于筛选能够调节白细胞功能的新型内皮调控因子。我们采用多种技术（包括实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹（western-blot）、流式细胞术和细胞黏附实验），针对白细胞募集过程中涉及的特定表达靶点（如细胞因子、趋化因子和黏附分子），分析内皮细胞的活化状态。这些方法可用于评估炎症背景下的内皮功能，并适用于高通量筛选实验，以鉴定潜在的新型内皮炎症调控因子，为开发新的治疗策略提供重要依据。

通过RT-qPCR评估LPS诱导的内皮细胞活化
将血清饥饿处理的 MLEC-04 细胞用 100 ng/mL LPS 刺激 6 小时，通过 RT-qPCR 检测内皮细胞基因表达，并将活化标志物的表达水平与静息状态进行比较。如图 1A所示，经 LPS 孵育的 MLEC-04 细胞诱导了在炎症反应过程中参与白细胞募集的特定黏附分子（E-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1）的 mRNA 表达。PECAM-1 被用作内参对照，因其在此实验条件下表达无变化。图 1B展示了通过促炎细胞因子 Ccl5、Cxcl10 和 Cxcl1 的 mRNA 表达升高所反映的 LPS 诱导的内皮细胞活化。这些分子参与循环白细胞的活化过程，包括其向内皮层迁移以及随后向炎症部位的外渗。细胞因子 IL4 在此实验条件下作为内参对照使用。
<p class="jo...

血管内皮细胞严格调控白细胞的募集过程。白细胞渗出异常可导致人类炎症性疾病的发生。因此，寻找内皮细胞活化的新调控因子，对于开发更有效的炎症性疾病治疗策略至关重要。本文介绍了一种系统性的方法学，用于鉴定能够调节炎症过程中白细胞迁移的新型内皮调控因子。

内皮层通过调控多种不同功能，在维持机体稳态中起着至关重要的作用。炎症反应的调控……

本筛选实验的总体目标是表征参与炎症反应调控的新型内皮调节因子，为开发针对炎症性疾病的新型治疗策略提供依据。该方法有助于解答病理学领域的关键问题，例如鉴定能够减轻炎症相关疾病的新型靶向内皮细胞的药物。本内皮细胞实验方案的主要优势在于，其描述了一种检测技术，为探索炎症反应调控中涉及的新机制奠定了基础。本实验方法将由本实验室的博士后研究员 Maria Angeles Higueras 和技术员 Sandra Herranz 演示。首先，在补充有10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（Pen-Strep）的完全DMEM F12培养基中培养MLEC-04细胞。将细胞置于37°C的生物培养箱中培养。

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于炎症反应的新内皮调节因子的筛选测定

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

本文介绍一种新型的高内涵化学诱导炎症检测方法，旨在鉴定具有免疫调节作用的生物活性物质。我们已成功将自动化显微镜技术与自主开发的软件脚本相结合，实现了对炎症反应的自动化定量，以及后续的数据处理、分析、挖掘和存储。...

促进药物发现：斑马鱼中一种自动化的高内涵炎症检测方法

中性粒细胞在感染部位与活化的血管内皮细胞黏附是宿主炎症反应的重要组成部分。本报告所述为一种中性粒细胞结合实验，可用于 体外...

定量 体外 测定中性粒细胞在静息条件下对活化的人原代微血管内皮细胞黏附的实验方法

管腔形成实验是一种快速、可量化的测量方法，用于评估 体外...

内皮细胞管形成实验用于 体外 血管生成研究

可靠的人类血管血液相互作用研究模型尚且缺乏。我们提出一种 体外...

一种新型方法 体外 研究人全血与内皮相互作用的模型

我们描述了一种简单的基于细胞的生物测定法，用于检测、定量和监测血管内皮生长因子配体家族成员的活性。该检测方法利用在因子依赖性细胞系中表达的嵌合受体，对配体介导的受体结合与交联提供半定量或定量评估。...

一种用于评估血管内皮生长因子的简易生物测定法

本论文描述了一种管形成实验，通过在受控环境中利用内皮细胞的管形成能力，来定量评估特定化合物或条件对血管生成的影响。...

内皮细胞管形成实验的优化策略：比较细胞外基质与生长因子减除型细胞外基质

利用三维细胞培养和非抗凝全血评估内皮细胞的抗凝和抗炎特性

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外...

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

本逐步实验方案详细描述了用于评估hiPSC-ECs中炎症反应以及在生理流动条件下分析白细胞黏附的实验设置和数据分析方法。...

用于评估白细胞黏附至人诱导多能干细胞来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）的微流控检测方法

学习筛选测定内皮调节因子的方法，用于研究炎症反应中白细胞募集的调控机制。该方法有助于开发针对炎症性疾病的新型治疗策略。

用于表征炎症反应中新型内皮调节因子的筛选实验

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