Name: 前庭神经鞘瘤研究的统一方法框架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习处理前庭神经鞘瘤样本的原代细胞培养方法，用于肿瘤分泌分析和药物筛选研究。该技术采用最小化操作培养方案，可在体外保持细胞活性，为神经肿瘤学研究提供可靠的实验框架。

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本工作获得了耳聋与其他沟通障碍国家研究所基金R01DC015824（K.M.S.）和T32DC00038（资助J.E.S.和S.D.）、美国国防部基金W81XWH-14-1-0091（K.M.S.）、Bertarelli基金会（K.M.S.）、Nancy Sayles Day基金会（K.M.S.）、Lauer耳鸣研究中心（K.M.S.）以及Barnes基金会（K.M.S.）的支持。

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<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
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<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种用于前庭神经鞘瘤（VS）研究的统一方法学框架，概述了同时处理人类VS样本和听神经瘤（GAN）样本以用于后续研究应用的流程。随着VS研究进入精准医学时代，将同一样本制备成能够回答多种研究问题的形式，将有助于发现针对个体患者的分子、细胞、遗传及蛋白质组学方面的特异性信息。
通过免疫细胞化学方法，利用S100标志物阳性细胞与DAPI核染色阳性细胞的比例，对人施万细胞和前庭神经鞘瘤（VS）培养物的纯度进行了长期评估19。因此，建议在细胞接种后的前两周内进行原代人施万细胞培养实验，因为此期间细胞纯度最高；此后，成纤维细胞样细胞将逐渐占主导地位。尽管前庭神经鞘瘤细胞培养物在培养两周时纯度也达到最高，但VS细胞缺乏接触介导的抑制作用，会在后期持续增殖。此外，对来自同一肿瘤的VS组织（第4节）和VS细胞培养物（第5节）的蛋白质表达进行直接微阵列比较，成功表明VS培养物与其相应原发肿瘤之间具有足够高的生物学相似性19。可通过第4节中制备的蛋白裂解液进行Western blot分析，实现目标蛋...

前庭神经鞘瘤（VS）是桥小脑角区最常见的肿瘤，每10万人中即有1人被诊断出患有此病。尽管该肿瘤不发生转移，但会严重影响患者的生活质量1,2,3,4,5,6。患者通常伴有听力丧失、耳鸣以及耳部胀满感。随着肿瘤的生长，症状逐渐加重，导致平衡障碍、面瘫以及其他脑神经功能受损。由于肿瘤压迫脑干，还可能引发危及生命的并发症7。
前庭神经鞘瘤（VS）的治疗选择主要包括对静止性肿瘤采取观察等待，对生长性肿瘤则采用立体定向放射治疗或手术切除8。在有研究背景的医院中进行此类肿瘤的手术切除，为获取和分析患者手术期间采集的新鲜肿瘤组织提供了机会。其中一种特定的VS手术方式——经迷路切除术，甚至可获得来自内耳的宝贵的人类感觉上皮组织及外淋巴液。
因为前庭神经鞘瘤起源于外周感觉神经（即， 前庭神经），将前庭神经鞘瘤相关观察结果与适当的对照神经（如人耳大神经，GAN）进行比较至关重要。健康的 GAN 常在腮腺切除术或颈部解剖术中被常规切除，可作为研究健康施万细胞生理学的可靠模型。9.
由于目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗或预防散发性前庭神经鞘瘤（VS）的药物，研究人员亟需阐明该疾病的分子机制，以确定潜在的治疗靶点。已发现参与VS发病机制的蛋白质包括merlin、血管内皮生长因子（VEGF）、环氧化酶2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-alpha）、表皮生长因子受体（EGFR）及相关信号分子10,11,12,13,14,15,16,17。
近期进展已拓展并优化了原代人源前庭神经鞘瘤及健康神经组织的采集、处理、培养和后续研究方案18,19然而，大多数现有的实验方案旨在为单一的下游研究应用准备此类组织即， 单独进行细胞培养）。本文介绍了一种统一的方法学框架，可用于对单一人源性前庭神经鞘瘤（VS）或耳蜗神经节（GAN）样本同时进行多种下游应用的处理：细胞类型特异性培养、蛋白质提取、RNA保存、肿瘤分泌物收集以及组织固定。本研究还详细描述了经迷路入路切除VS手术过程中人脑脊液（CSF）和内淋巴液的外科采集与处理步骤，因为这些密切相关的组织可能为VS提供重要的生物标志物来源。最后，本方案提供了原代人VS细胞在培养中进行病毒转导的步骤，作为该组织在基因治疗中应用的一种新途径。

<table><tbody><tr><td>Biocoat 聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白 12 mm #1 德国玻璃盖玻片</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>或使用 Corning 层粘连蛋白（CB-40232）和 Cultrex 聚-L-赖氨酸（3438-100-01）自行制备盖玻片</td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL 离心管，锥底，带刻度，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养皿，60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>来自溶组织梭菌的胶原酶，经无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 孔透明 TC 处理多孔板，无菌</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子，Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，标准尖头，不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定合格，来自 USDA 批准地区，500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>分装至 50 mL 管中，保存于 -20&amp;deg;C 冰箱</td></tr><tr><td>来自牛睾丸的透明质酸酶，I-S 型，冻干粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射式滤器，0.22 &amp;micro;m，聚醚砜，33 mm，无菌</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，试剂级，结晶状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>使用前：根据在线可获取的方案建立标准操作程序</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4，500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>移液器及移液器吸头，5/10/25 mL</td><td>多种品牌</td><td>多种型号</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5/2.0 mL 微量管的塑料匀浆杵</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头，27 G × 1 1/2 英寸</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater（RNA 稳定溶液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>带安全锁的微量离心管，聚丙烯材质，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>生理盐水 - 0.9% 氯化钠注射液，抑菌型，20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Schuknecht 吸引管，24 号</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>适用于手术入路（除常规耳科手术器械外），&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;蓝色手术标记笔</td></tr><tr><td>标本容器，手术室用无菌，4 盎司</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>注射器/针头组合，鲁尔锁头，5 mL，22 G × 1 英寸</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>结核菌素注射器（仅注射器），滑动接头，3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>超声波匀浆仪，4710 系列，CV18 探头</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

前庭神经鞘瘤研究的统一方法学框架

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

前庭神经鞘瘤是桥小脑角区最常见的肿瘤，占所有颅内肿瘤的6%-8%。尽管这些肿瘤可导致高达95%的患者出现感音神经性听力损失，但其听力损失的分子机制仍不明确。本文介绍了我们实验室建立的一系列步骤，旨在促进各种原代人体组织样本的采集与处理，以支持前庭神经鞘瘤研究中的后续科研应用。具体而言，本文描述了一种统一的方法学框架，用于从手术标本中采集、处理和培养施万细胞及神经鞘瘤细胞。该框架还整合了当前研究中被认为必不可少的并行处理步骤：肿瘤和神经分泌物的收集、采集组织中RNA的保存和蛋白质的提取、组织固定以制备切片，以及将原代人源细胞暴露于腺相关病毒，以应用于基因治疗。此外，本文强调经迷路入路手术切除该肿瘤的独特优势，即可同时获取人耳内耳的感觉上皮组织和外淋巴液。文中还提供了提高实验质量的建议，并指出了常见的技术难点。

如第5节所述，在培养条件下的人源性前庭神经鞘瘤（VS）细胞可作为多种下游研究应用中疾病相关过程的有用模型（图1）。第6节中培养的健康施万细胞则提供了直接且具有指导意义的对照。如下所述，依据该统一方法学框架处理的VS和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAN）的大量数据已在先前发表的多篇文章中公开12,13,14,15,27。
首次展示了利用腺相关病毒对原代前庭 Schwann 细胞进行成功转导以实现基因治疗图2）。在培养物...

本实验方案的目的是概述用于前庭神经鞘瘤和施万细胞研究中多种下游应用的人类手术样本的采集与处理流程。

前庭神经鞘瘤是小脑桥脑角区最常见的肿瘤，占所有颅内肿瘤的6-8%。尽管这些……

本实验的总体目标是处理从手术室获取的人源前庭神经鞘瘤样本，用于原代细胞培养及肿瘤分泌物的收集。该方法有助于解答前庭神经鞘瘤研究领域中的关键问题，例如如何最优地接收、保存和处理拟用于多种生物分子检测的人源原代肿瘤样本。该技术的主要优势在于采用了一种最小化干预的培养方法来扩增人源原代前庭神经鞘瘤细胞。该技术的应用前景涉及前庭神经鞘瘤的治疗，因为有潜力的治疗候选药物可直接在培养的细胞上进行测试。首先，将装有新鲜获取的前庭神经鞘瘤或耳大神经样本的标本容器从手术室运输所用的冰上转移至实验室的超净工作台内。使用无菌镊子小心地将标本转移至三个1.5毫升离心管中的第一个，该离心管中已加入1.4毫升的磷酸盐缓冲液（PBS）。每支试管在加入标本后立即盖紧，并轻轻振荡以洗涤。将样本置于干燥的60毫米培养皿中，用镊子清除血管丰富区域的所有坏死组织。使用镊子或手术刀片将样本分割成若干部分，分别用于RNA保存、蛋白质提取、分泌物收集、固定和细胞培养。将用于细胞培养的组织样本转移至新的60毫米培养皿中，培养皿内含五到八毫升冷的补充DMEM/F12培养基。将用于收集分泌物的前庭神经鞘瘤或耳大神经组织放入一个空的1.5毫升离心管中。首先，用移液器将500微升未添加FBS的DMEM培养基分别加入两个1.5毫升离心管中。第一个试管将用于收集肿瘤分泌物，第二个试管将作为配对对照。将其中一个含有DMEM的试管放在已校准的电子天平上。将天平归零，将指定用于分泌物收集的组织样本放入试管中并称重。记录结果，该数值将代表组织本身的重量。在超净工作台内，将试管中 DMEM 的体积调整为每 10 毫克样本 100 微升。将含有组织样本及其配对对照的试管放入培养箱中。孵育至少72小时，以收集具有生物学意义数量的肿瘤或神经分泌物。72小时孵育结束后，使用1毫升移液器从样本中移除含有分泌物的培养基。为避免反复冻融，根据后续实验分析计划，将培养基分装至新的离心管中。将原始组织块、分泌物和对照 DMEM 置于 -80 摄氏度冰箱中保存，直至开始后续应用。开始培养操作时，双手各持一把镊子，将前庭神经鞘瘤组织分离成约 1 立方毫米的组织块。然后用 10 毫升血清移液管吸取培养基和肿瘤组织块，并将所有内容物转移至 15 毫升锥形管中。在25°C下以1000×g离心3分钟。离心期间，在60毫米培养皿中将4.7毫升添加了补充剂的DMEM/F12培养基与250微升胶原酶和50微升透明质酸酶混合，制备消化液。离心结束后，肿瘤组织碎片将在锥形管底部形成团块。小心吸出上清液并弃去。然后向肿瘤组织中加入2毫升新配制的含消化酶的消化液，反复吹打数次以分散组织，随后将其转移至60毫米培养皿中。将培养皿放入培养箱中孵育18小时。次日，将含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基置于37摄氏度水浴中预热。从培养箱中取出含有前庭神经鞘瘤细胞的培养皿，转移至超净台中。使用连接6毫升注射器的22号针头，吸取含有细胞的培养基，转移至新的15毫升锥形离心管中。在37°C条件下，以1000G离心五分钟。在此期间，使用无菌镊子将所需数量的经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片放入24孔培养板中。一个一立方厘米大小的肿瘤可培养24至32个孔，因此对于大多数较小的肿瘤，计划培养8到16孔细胞较为合适。离心后，弃去上清液，并将残留的细胞沉淀重悬于预热的培养基中，使每计划使用的孔中加入一毫升细胞悬液。使用五毫升血清移液管吸取两毫升细胞悬液，向24孔板的每个孔中加入一毫升。继续吸取并接种含有肿瘤细胞的培养基，每次吸取两毫升，从中取出一毫升加入每个计划使用的孔中，直至肿瘤细胞悬液被均等地分配至所有准备好的孔中。将24孔板放入37摄氏度培养箱中过夜。次日观察培养板，若发现孔底部有明显碎片，需小心更换各孔中的培养基为新鲜的添加补充物的DMEM/F12培养基，注意不要扰动贴壁细胞。若无碎片，将培养板继续放回培养箱，并于第5天首次更换培养基，之后每3天更换一次。此明场图像展示了前庭神经鞘瘤细胞在培养中的典型组织模式。这些免疫荧光图像来自原代人前庭神经鞘瘤培养物，在暴露于表达绿色荧光蛋白（GFP）的ink 80后48小时拍摄，绿色信号代表GFP。红色荧光来自鬼笔环肽F-肌动蛋白免疫染色，用于标记细胞骨架，蓝色荧光为DAPI，用于标记细胞核。插图是低倍图像中某一区域的高倍放大图像。在进行此操作时，重要的是要记录下将分泌物样本和培养物样本放入培养箱的时间，以确保后续步骤能够在正确的培养时间后进行。完成此操作后，还可进行其他方法，如病毒转导、固定、免疫荧光、药物处理和RNA提取，以回答更多问题，例如不同病毒在细胞中的表达情况，或药物处理后基因表达的变化。 该技术问世后，为前庭神经鞘瘤研究领域的研究人员探索原代人类细胞在术后患者体内对不同药物的反应方式开辟了道路。

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前庭神经鞘瘤研究的统一方法框架

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使用六自由度运动平台进行三维前庭眼反射测试

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人源前庭神经鞘瘤的原代培养

评估梅尼埃病（MD）患者及健康人中颅神经的形态学变化，例如神经结构的缺失或颅神经的肿胀...

体内 使用磁共振成像对梅尼埃病耳和正常听力耳的人类颅神经进行形态计量分析

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利用单向旋转改善前庭功能障碍患者的前庭系统不对称性

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在7T磁共振断层扫描中测量磁性前庭刺激对眼震、自我运动感知及认知表现的影响

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结肠-26 癌移植小鼠模型在癌症恶病质研究中的应用

学习处理前庭神经鞘瘤样本的原代细胞培养方法，用于肿瘤分泌分析和药物筛选研究。该技术采用最小化操作培养方案，可在体外保持细胞活性，为神经肿瘤学研究提供可靠的实验框架。

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