Name: 化学品生产肺炎克雷伯菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解利用Klebsiella pneumoniae从竹水解液生产2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸和木糖酸的微生物发酵方法。该研究评估了竹生物质作为可再生原料在生物化工领域的应用潜力。

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本工作得到国家自然科学基金（项目编号：21576279、20906076）和韩国生物技术研究与开发局研究启动计划（KGM2211531）的支持。

1. 竹子水解物的制备
<ol>
	<li>在250 mL的烧瓶中，将5 g竹粉加入40 mL NaOH溶液中，以获得10% (g/g)的终浓度。使用一系列浓度从0.05 M到0.50 M、以0.05 M为增量的NaOH溶液。
	<ol>
		<li>将混合物在水浴中于60 °C或100 °C孵育60分钟，或在高压灭菌器中于121 °C孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后，将混合物在室温下静置4小时，然后去除上清液。加入100 mL新鲜水并混匀。
	<ol>
		<li>重复洗涤5–6次，直至上清液pH达到6.8。将所得固体用于下一步酶解反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行水解时，用98% H2SO4将上述混合物50 mL调节至pH 5.0，然后加入0.5 mL浓度为200滤纸活性单位（FPU）/mL的纤维素酶。 
	注：纤维素酶与竹粉的最终比例应为每1 g竹粉加入20 FPU纤维素酶。</li>
	<li>将混合物在摇床中于50 °C孵育36小时。 
	注：水解后，混合物中仍会残留部分固体。</li>
	<li>以7,690 × g离心5分钟，获得澄清的水解液。</li>
	<li>使用配备示差折光检测器和光电二极管阵列检测器的高效液相色谱系统定量葡萄糖、木糖及其他化学成分。采用HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm），以5 mM H2SO4溶液为流动相，流速为0.8 mL/min12。</li>
	<li>为制备大量水解液，将2 kg竹粉与18 L 0.25 M NaOH在30 L不锈钢罐中混合。
	<ol>
		<li>将罐体置于高压灭菌器中于121 °C孵育60分钟。孵育后，在60 L塑料罐中用40 L水洗涤混合物，重复洗涤5次。</li>
		<li>用水将洗涤后的竹粉总体积调至20 L，并用98% H2SO4将混合物pH调节至5.0。</li>
		<li>在配备机械搅拌器的改良振荡水浴中进行酶解，以确保混合物充分分散。加入200 mL浓度为200 FPU/mL的纤维素酶，在50 °C孵育36小时。</li>
		<li>水解完成后，以4,700 × g离心10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 野生型 K. pneumoniae 生产 2,3-丁二醇
<ol>
	<li>使用 3 L 竹子水解物作为培养基制备的溶剂。</li>
	<li>制备含有 4 g/L 玉米浆、2 g/L (NH4)2SO4、6 g/L K2HPO4、3 g/L KH2PO4 和 0.2 g/L MgSO4 的发酵培养基。使用 2.5 M NaOH 将培养基 pH 调至中性。将 3 L 经高压灭菌的发酵培养基加入 5-L 生物反应器中用于发酵。</li>
	<li>使用保存于 -80 °C 低温冰箱中的 K. pneumoniae 菌种。</li>
	<li>对于种子培养，将含有 50 mL LB（Luria-Bertani）培养基的 250 mL 三角瓶在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。LB 培养基组成为：10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和 10 g/L NaCl。 
	注：种子培养物的菌体密度应达到 OD 2（600 nm 处的光密度值）。</li>
	<li>将一管 50 mL 种子培养物接种至生物反应器中。维持培养体系 pH 为 6.0，温度为 37 °C。通气速率为 2 L/min，搅拌速率为 250 rpm，以形成微氧环境。</li>
	<li>在发酵过程中每 2 小时取样 5 mL，采用高效液相色谱法分析样品，以测定发酵液中各化学物质的浓度4。
	<ol>
		<li>使用 MFCS/DA 系统在线监测生物反应器中碱液的添加情况。 
		注：发酵过程中会产生有机酸，需添加 NaOH 以维持培养体系 pH 稳定。所添加碱液的体积可反映产酸量。当碱液添加量曲线趋于平缓时，表明发酵过程结束，原因可能是碳源耗尽或细胞死亡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）budC 突变株生产 R-乙偶姻
<ol>
	<li>制备用于乙偶姻生产的培养基，其中包含 4 g/L 玉米浆粉、2 g/L (NH4)2SO4、3 g/L 乙酸钠、0.4 g/L KCl 和 0.1 g/L MgSO4。</li>
	<li>使用 K. pneumoniae-ΔbudC 进行 R-乙偶姻的生产。重复步骤 2.4–2.5。 
	注意：budC 编码 2,3-丁二醇脱氢酶。K. pneumoniae-ΔbudC 缺失 2,3-丁二醇脱氢酶活性，因而生成 R-乙偶姻而非 2,3-丁二醇。</li>
	<li>将培养体系维持在 pH 6.0 和 37 °C 条件下。通气速率为 4 L/min，搅拌速率为 450 rpm，保持好氧条件。 
	注意：该过程的供氧量高于 2,3-丁二醇生产所需。</li>
	<li>按照步骤 2.6 对样品进行检测。</li>
</ol>
4. 2-酮基葡糖酸的生产方法 budA 突变体 K. pneumoniae
<ol>
	<li>生产2-酮基葡萄糖酸时，使用与生产R-乙偶姻相同的培养基。</li>
	<li>使用K. pneumoniae-ΔbudA菌株进行2-酮基葡萄糖酸的生产。重复步骤2.4–2.5。 
	注意：budA编码α-乙酰乳酸脱羧酶。K. pneumoniae-ΔbudA缺失α-乙酰乳酸脱羧酶活性，能够以葡萄糖为底物生成2-酮基葡萄糖酸。 
	注意：2-酮基葡萄糖酸的合成是一个依赖酸性条件的过程。目前已建立两阶段发酵法用于2-酮基葡萄糖酸的生产10；在第一阶段，将种子培养物接种至生物反应器中。</li>
	<li>将培养物维持在pH 7.0、37 °C条件下。通气速率为4 L/min，搅拌速率为500 rpm。 
	注意：在此条件下，细胞生长迅速（菌体密度约4小时内可达OD 7）。随后发酵进入第二阶段，培养物pH自然下降至5.0。此过程中不额外添加酸，培养体系中产生的有机酸可自然导致pH下降。在酸性条件下，细胞生长停止，但2-酮基葡萄糖酸持续合成并在发酵液中积累。</li>
	<li>按照步骤2.6的方法对样品进行检测，以竹子水解液作为碳源。 
	注意：培养基中的葡萄糖被转化为2-酮基葡萄糖酸，木糖则被转化为木糖酸。因此，最终获得的是2-酮基葡萄糖酸与木糖酸的混合物。</li>
</ol>

<ol><li>Zeng, A. P., Biebl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+chemicals+from+biotechnology%3A+the+case+of+1%2C+3-propanediol+production+and+the+new+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).</li>
<li>Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dihydroxyacetone+kinases+I+and+II+in+the+dha+regulon+of+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae.</a> J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).</li>
<li>Celińska, E., Grajek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+production+of+2%2C3-butanediol-current+state+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects.</a> Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).</li>
<li>Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+2%2C+3-butanediol+stereoisomer+formation+in+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).</li>
<li>Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+recombinase+assisted+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).</li>
<li>Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategy+to+improve+efficiency+for+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RecBCD+in+Klebsiella+pneumoniae+by+Gam+and+its+effect+on+the+efficiency+of+gene+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Basic+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement.</a> J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-acetoin+accumulation+and+dissimilation+in+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).</li>
<li>Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae+CGMCC+1.6366%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+fermentation+for+2-ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconic+acid+production+by+gad+mutant+of+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae.</a> World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+xylonic+acid+by+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).</li>
<li>Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie801542g">Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production.</a> Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).</li>
<li>Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F0-387-30746-X_8">The Prokaryotes</a>. , Springer. 159-196 (2006).</li>
<li>Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11274-008-9665-y">Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions.</a> World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).</li>
<li>Hong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0961953415000963">Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4.</a> Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).</li>
<li>Pienkos, P. T., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s10570-009-9309-x">Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates.</a> Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

K. pneumoniae 属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的克雷伯氏菌属（Klebsiella）。K. pneumoniae 广泛分布于土壤、植物和水等自然环境中14。本研究中所用的野生型 K. pneumoniae 菌株分离自土壤，用于1,3-丙二醇的生产15。K. pneumoniae 及其突变株在不同条件下可产生多种化学品。
K. pneumoniae 的培养 pH 值和通气补充是影响其化学产物生成的关键因素。野生型 K. pneumoniae 在 pH 6 条件下主要产生 2,3-丁二醇作为代谢产物。然而，当培养 pH 值降至 5 或更低时，主要代谢产物转变为 2-酮基葡糖酸9。增加通气量会减少 2,3-丁二醇的合成，同时促进 R-乙偶姻的合成<sup...

肺炎克雷伯菌 是一种在有氧和无氧条件下均能良好生长的细菌。 K. pneumoniae 是一种重要的工业微生物，用于生产多种化学品。1,3-丙二醇是一种有价值的化学品，主要用作合成对苯二甲酸三亚甲酯的单体。对苯二甲酸三亚甲酯是一种可生物降解的聚酯，其性能优于1,2-丙二醇、丁二醇或乙二醇11,3-丙二醇由 K. pneumoniae 以甘油为底物在限氧条件下22,3-丁二醇及其衍生物可应用于塑料、溶剂生产、合成橡胶领域，并具有作为生物燃料使用的潜力3以葡萄糖为底物时，2,3-丁二醇是野生型菌株的主要代谢产物42,3-丁二醇由丙酮酸合成。首先，两分子丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，该反应由α-乙酰乳酸合酶催化；随后，α-乙酰乳酸在α-乙酰乳酸脱羧酶作用下转化为乙偶姻。 R乙偶姻可在丁二醇脱氢酶的催化下进一步还原为2,3-丁二醇。一种适用于 K. pneumoniae 已被探索，并已构建了许多突变体5,6,7. A budC 突变株失去了2,3-丁二醇脱氢酶活性，在培养液中积累高水平的乙偶姻。乙偶姻用作食品风味增强剂8。当 budA，该基因编码α-乙酰乳酸脱羧酶，当其发生突变时，2-酮基葡萄糖酸会在发酵液中积累。2-酮基葡萄糖酸可用于合成赤藓酸（异抗坏血酸），后者是食品工业中使用的一种抗氧化剂92-酮基葡萄糖酸是葡萄糖氧化途径中的中间产物；该途径位于周质空间，葡萄糖在此被氧化为葡萄糖酸，随后进一步氧化为2-酮基葡萄糖酸。在周质空间中生成的葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸可被转运至细胞质中进行进一步代谢。2-酮基葡萄糖酸的积累依赖于酸性条件，较高的通气量有利于2-酮基葡萄糖酸的生成10葡萄糖酸脱氢酶，由 gad, 催化葡萄糖酸转化为2-酮基古龙酸。 钆 突变体 K. pneumoniae 产生大量葡萄糖酸而非2-酮基葡萄糖酸，且该过程依赖于酸性条件。葡萄糖酸是一种大宗有机酸，可用作添加剂以改善水泥性能11葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸。木糖也是葡萄糖脱氢酶的合适底物。当以木糖作为底物时， K. pneumoniae 生成木糖酸12.
利用生物质作为原料进行化学品生产是生物技术领域的研究热点13。生物质的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。然而，这些大分子化合物无法被大多数微生物（包括K. pneumoniae）直接代谢。生物质中的纤维素和半纤维素必须先水解为葡萄糖和木糖，才能被微生物利用。木质纤维素中木质素的存在形成了一道保护屏障，阻碍酶对生物质的水解。因此，在微生物利用生物质的过程中，通常需要进行预处理，以去除木质素和半纤维素，并降低纤维素的结晶度。目前已开发出多种预处理方法，其中酸法、碱法、氨法和蒸汽预处理较为常见。
竹子在热带和亚热带地区资源丰富，是一种重要的生物质资源。本文介绍了竹子水解物的制备以及利用竹子水解物进行化学品生产的方法

<table><tbody><tr><td>高压灭菌器</td><td>SANYO</td><td>3780</td><td></td></tr><tr><td>生物反应器</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>Bostat Aplus</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>IKA</td><td>RW 20</td><td></td></tr><tr><td>水浴摇床</td><td>Zhicheng</td><td>ZWY-110X50</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>Shimadzu Corp</td><td>20AVP</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hitachi</td><td>CR22G III</td><td></td></tr><tr><td>竹粉</td><td>购自中国浙江省</td><td></td><td>目数，50</td></tr><tr><td>纤维素酶</td><td>山东优泰生物化学有限公司，中国山东</td><td></td><td>200 PFU/mL</td></tr></tbody></table>

化学品的生产 肺炎克雷伯菌 使用竹类水解物作为原料

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

竹子是一种重要的生物质资源，竹水解物可被Klebsiella pneumoniae用作化学品生产的原料。本实验中，竹粉经NaOH预处理后洗涤至中性pH。向预处理后的竹粉中加入纤维素酶，生成含有30 g/L葡萄糖和15 g/L木糖的水解液，并以此作为碳源配制化学品生产的培养基。在微氧条件下培养时，野生型K. pneumoniae产生了12.7 g/L的2,3-丁二醇。在有氧条件下，K. pneumoniae的budC突变株产生了13.0 g/L的R-乙偶姻。K. pneumoniae的budA突变株在两阶段、pH控制且高通气的发酵过程中，生成了25.5 g/L的2-酮基葡糖酸和13.6 g/L的木糖酸的混合物。发酵的第一阶段维持培养体系为中性pH；细胞生长完成后，进入第二阶段，此时允许培养体系变为酸性。

在本实验方案中，竹材采用碱法进行预处理。最佳孵育参数——温度121 °C和0.25 M NaOH——由图1和图2确定。对预处理后的竹材进行酶水解，并测定水解液中葡萄糖和木糖的浓度。较高的温度有利于糖的生成，因此选择121 °C作为最佳温度。在0.05–0.25 M范围内，随着NaOH浓度的增加，水解液中产生的葡萄糖和木糖浓度也随之增加。进一步提高NaOH浓度对糖的生成无促进作用。因此，选择0.25 M NaOH作为最佳浓度。
<img alt="不同温度下葡萄糖和木糖浓度；柱状图；发酵分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：预处理温度对竹材水解液中葡萄糖和木糖浓度的影响。...

竹粉经NaOH预处理后进行酶水解。将竹粉水解产物作为底物，用于肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）生产2,3-丁二醇、R-乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸和木糖酸。

竹子是一种重要的生物质资源，竹水解物可被肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）用作化学品生产的原料。本文中，竹粉被……

本实验的总体目标是观察肺炎克雷伯菌利用竹子水解物作为原料生产化学品2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸和木糖酸的过程。首先，在250毫升锥形瓶中使用一系列氢氧化钠溶液，将5克竹粉加入40毫升氢氧化钠溶液中，配制成10%的溶液。将溶液置于水浴中，在60摄氏度或100摄氏度下孵育60分钟，或在121摄氏度下高压灭菌60分钟。孵育结束后，将混合物离心5分钟，弃去上清液，加入100毫升新鲜水并混匀。重复洗涤5至6次，直至上清液pH达到6.8。随后进行酶解反应，使用98%硫酸将每份溶液50毫升调节至pH 5.0。然后每毫升纤维素酶加入0.5毫升、滤纸酶活性（FPU）为200的酶液。纤维素酶与竹子的最终比例应为每克竹子20 FPU。将混合物在50摄氏度下振荡孵育36小时。水解后，混合物中仍会残留部分固体。为获得澄清的水解液，将溶液在7,690 ×g条件下离心5分钟。若需制备大量水解液，可参照上述类似步骤进行，但将250毫升锥形瓶替换为30升不锈钢罐、60升塑料罐以及配备机械搅拌器的改良振荡水浴装置。根据文本方案配制发酵培养基后，通过将克氏肺炎杆菌（K-pneumoniae）细胞接种至平板上进行过夜培养，制备种子培养物，随后将该培养物转移至含有50毫升LB培养基的250毫升锥形瓶中。将培养物在37摄氏度、200 RPM条件下培养过夜。分别使用野生型、bud C突变株和bud A突变株用于2,3-丁二醇、乙偶姻和2-酮基葡糖酸的生产。将50毫升种子培养物接种至生物反应器中。分别在 pH 6.0 和 pH 7.0 条件下，于 37 摄氏度培养以生成乙偶姻和 2,3-丁二醇。在生成 2-酮基葡糖酸时，前 4 小时维持培养物 pH 为 7.0，随后切换至 pH 5.0。在生成 2,3-丁二醇时，将培养物维持在微好氧环境中，以每分钟 2 升的速率补充空气，并保持 250 RPM 的转速。进行乙偶姻生产时，将培养物维持在有氧环境中，以每分钟4升的通气量和450转/分钟的转速进行补气。进行2-酮基葡萄糖酸生产时，维持高有氧条件，通气量和搅拌速度分别为每分钟4升和500转/分钟。最后，在发酵过程中每两小时收集5毫升样品，并采用高压液相色谱法分析样品，以确定发酵液中的化学物质浓度。通过本视频展示的方案，较高的温度以及0.25至0.40摩尔浓度的氢氧化钠有利于从竹子中生成水解产物。在摇瓶规模的酶解过程中，每升产生了约20克葡萄糖和10克木糖；在大体积水解产物制备中，每升获得了30克葡萄糖和15克木糖。如图所示，在微好氧条件下，由克氏肺炎杆菌（K-pneumoniae）生成了2,3-丁二醇。该过程分为两个阶段：在第一阶段，细胞利用葡萄糖生成每升7.6克的2,3-丁二醇；在第二阶段，细胞利用培养基中的木糖，额外生成每升5.1克的2,3-丁二醇。在有氧条件下，由肺炎克雷伯菌（K. pneumo

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

化学品生产<em&gt;肺炎克雷伯菌</em使用竹水合物作为原料

来源：Augimeri, R. V. 等，利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯响应的工具。J. Vis. Exp.

利用乙烯释放化合物研究细菌对乙烯的响应

从受石油污染的土壤中分离出一株Pseudomonas aeruginosa细菌，将其接种于含有氮源和过量食用油作为碳源的培养基中开始培养。该菌株可合成聚羟基烷酸酯（PHA），这是一种可用于生产生物塑料的长链聚合物。在振荡条件下孵育，以促进通气并促进细菌生长。最初，培养基提供碳源和氮源，以支持细菌增殖并产生高生物量。在细胞大量生长后，培养基中的氮耗尽会停止细胞进一步分裂，并将多余的碳源转向聚羟基脂肪酸酯（PHA）的生物合成。细菌分泌脂肪酶，将油分解为脂肪酸，这些脂肪酸被细胞内酶代谢为聚羟基脂肪酸酯（PHA）前体。PHA 合成酶将这些前体聚合为 PHA。PHA...

在富碳培养基中Pseudomonas aeruginosa合成聚羟基烷酸酯

来源：Wei, D., 等，利用竹水解物为底物通过Klebsiella pneumoniae生产化学品。J. Vis. Exp. (2017)本视频展示了在微氧和弱酸性条件下，通过在基于水解物的培养基中培养 Klebsiella...

克雷伯氏肺炎菌对竹材水解物的微好氧发酵

可收集并处理工业废弃物，以分析微生物的生长情况。木质纤维素提取技术可提供用于分析特定生物降解能力的组分。气相色谱-质谱联用技术可用于鉴定在制浆废料上培养的微生物的发酵产物。这些方法可用于确定微生物降解制浆废料的代谢能力。...

促进微生物在造纸厂废液流中生长的方法及培养微生物降解潜力的表征

本文介绍了共固定化全细胞生物催化剂以实现辅因子再生并提高其可重复利用性的实验方案，以L-木酮糖的生产为例。通过偶联两种表达功能互补酶的Escherichia...

海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

描述并演示了适应性进化和分离技术，以获得能够快速消耗酶解未经脱毒的水解物中混合的己糖和戊糖，并积累超过40 g/L乙醇的Scheffersomyces stipitis菌株NRRL...

用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

本文所述方案通过使用2-氯乙基膦酸（CEPA）便捷地研究细菌对乙烯的响应。乙烯的产生 原位 通过CEPA在水性细菌培养基中的分解，避免了对纯乙烯气体的需求。...

利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯反应的工具

我们提出了一种从可再生的非食用木质纤维素生物质中合成C5糖（木糖和阿拉伯糖）的方案（即，黄麻）在存在布朗斯特酸性离子液体的情况下ø布朗斯特酸性离子液体（BAILs）作为水相催化剂。与传统的无机酸催化剂（H2SO4 和...

一种用于分析黄麻生物质中戊聚糖并利用酸性离子液体将其转化为单糖的新方法

空气污染影响着所有生物的生活质量。本文介绍了利用微藻生物技术处理沼气（同步去除二氧化碳和硫化氢）并生产生物甲烷的方法，通过半工业规模的开放式高效藻类池进行处理，并随后分析处理效率、pH、溶解氧以及微藻生长情况。...

利用微藻-细菌系统在半工业规模高效藻类池中进行沼气提纯

本方案介绍了一种将食物废弃物转化为可生物降解的聚羟基脂肪酸酯（PHA）生物塑料的可扩展方法。该方法利用受控的厌氧消化进行食物废弃物预处理，采用嗜盐微生物发酵合成PHA，并通过无化学试剂的下游工艺实现PHA的回收。...

从食物废弃物中可持续生产生物塑料的可扩展逐步方法

了解利用Klebsiella pneumoniae从竹水解液生产2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸和木糖酸的微生物发酵方法。该研究评估了竹生物质作为可再生原料在生物化工领域的应用潜力。

化学品的生产肺炎克雷伯菌使用竹类水解物作为原料

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