胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化果蝇

本实验的总体目标是分析黑腹果蝇晚期胚胎的运动神经元投射模式。这种方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题，例如运动轴突导向和神经下库形成。该技术的主要优点是它提供了发育中胚胎运动轴突的精确可视化，从而可以可靠地分析轴突寻路并靶向条件缺陷。

设置鸡蛋收集板一天后，将收集板更换为含有少许新鲜酵母糊的新板。在新鲜盘子上放置三个小时后，将果蝇转移到新的食品瓶中。并将蛋板在 25 摄氏度下孵育过夜。

早上，向板中加入 1.8 毫升 PBT 溶液。并用棉签去除胚胎。然后，使用 1 毫升移液器将胚胎和溶液转移到微量离心管中。

一旦胚胎沉降到底部，吸出尽可能多的溶液。然后用每次冲洗一毫升 PBT 冲洗胚胎两次。要使胚胎脱核，请用 1 毫升 50% 漂白剂代替最后一次冲洗，并在室温下摇动试管 3 分钟。

要去除漂白剂，请用 PBT 冲洗胚胎 3 次。然后，用半毫升 100% 庚烷和半毫升 4% 多聚甲醛代替最后一次冲洗。现在，轻轻摇动胚胎孵育 15 分钟。

孵育后，去除底层溶液层并加回 500 μL 100% 甲醇。现在，用力摇动试管 30 秒，使胚胎脱枝。然后，去除覆盖的溶液，加入 500 微升 100% 甲醇，再摇动试管 10 秒钟。

摇动试管后，轻敲它以帮助胚胎沉淀并尽可能多地去除溶液。接下来，用 100% 甲醇短暂冲洗胚胎。然后，立即用 PBT 冲洗胚胎 3 次。

现在，将胚胎重悬于一毫升新鲜 PBT 中。并将胚胎在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，以便为 LacZ 染色做好准备。胚胎孵育时，准备 1 毫升等分试样的 X-gal 染色液。

在 65 摄氏度的水浴中加热等分试样，直到它变得浑浊。然后将其转移到 37 摄氏度的加热块中。胚胎加热 15 分钟后，取出 PBT 溶液，并用 1 毫升等分试样的染色溶液代替。

然后加入 20 微升 X-gal 底物。将试管在 37 摄氏度下孵育约 2 到 4 小时，轻轻摇动，直到形成蓝色沉淀。然后，去除染色溶液并用室温 PBT 冲洗胚胎 3 次。

冲洗后，使用针探针或镊子在解剖显微镜下对胚胎进行手工分类。使用 1 毫升移液器将感兴趣的染色胚胎收集到半毫米的微量离心管中。接下来，用 0.4 毫升 PBT 洗涤选定的胚胎。

然后，用 0.3 毫升封闭液替换 PBT，让胚胎在轻轻搅拌下孵育 15 分钟。15 分钟后，加入 75 μL 一抗并继续孵育过夜。第二天早上，用 PBT 清洗胚胎约两小时，大约每 30 分钟更换一次洗涤液。

洗涤后，加入 0.3 毫升含有二抗的封闭液，并在室温下轻轻摇动试管孵育过夜。第二天早上，用 PBT 清洗胚胎约三个小时。在洗涤期间至少更换 PBT 五次。

洗涤后，将胚胎重悬于 0.3 毫升 dab 溶液中，并加入 2 微升 3% 过氧化氢。然后，在室温下轻轻摇动避光孵育，直到产生足够的沉淀。这通常需要 30 到 60 分钟。

然后，用 PBT 冲洗胚胎四次，并将其重悬于 0.2 毫升的安装溶液中。现在，让胚胎在 4 摄氏度的黑暗中平衡。要切片胚胎，请将它们放在载玻片上。

首先将它们移入一滴甘油腹侧朝上。接下来，在解剖显微镜下，切掉前部和体长的 1/4 并去除最后部的区域，该区域没有运动轴突。现在，使用针状探针将制剂从甘油中移出，背面朝上，并将其水平放置在视野中。

下一步需要一个细钨针，该针已插入针式探针的中空区域，然后在末端弯曲。使用钨针在胚胎的后端做一个小切口，然后继续切下背中线。确保在解剖过程中钨针的尖端不接触载玻片的表面，因为针很容易弯曲到玻璃上。

然后，用探针将制备物放回甘油滴中，并将其背面朝上放置。在那里，通过沿腹侧方向展开每个体壁，将肠道与体壁分离。两个体壁应该分开。

现在使用探针，小心地将体壁瓣移动到载玻片上。在载玻片上，使用钨针横向推动内脏器官，将其取出。为了稳定钨针并防止其损坏，请保持空心针的探针，并在纵钨针时将钨针支撑在载玻片的表面。

现在，将制剂装在 8 μL 封片溶液中，安装在新的载玻片上。附上盖玻片并用普通指甲油密封边缘。然后，使用 DIC 光学元件以高分辨率捕获图像。

使用所描述的方法，用 Fas2 抗体对 16 期胚胎进行染色，并制备用于运动神经元和腹部半节段 A3 和 A4 的可视化。正常情况下，至少有 7 个运动神经元延伸并束化它们的轴突以形成 ISNb 神经分支。在该制剂中也可以识别出许多周围的神经束。当节段间神经束到达肌肉 6 和 7 的选择点时，两个轴突选择性地使肌肉 6 和 7 脱束并为其提供能量。

当束向背侧延伸时，其他选择点也会发生同样的情况。然后，在最后一个选择点，两个轴突为肌肉 12 提供能量。相比之下，在 Sema-1a 突变胚胎中，相同的轴突在其选择点无法脱束。

这并不意外，因为众所周知，Sema-1 爱琴海产物有助于在神经发育过程中在运动轴突和目标肌肉之间形成连接。因此，所描述的方法可用于分析突变表型。看完这个视频，你应该对如何对所需的突变胚胎进行分类，如何对运动神经元的轴突投射模式进行免疫染色，以及如何解剖固定的胚胎进行平面准备有了很好的了解。