活细胞中气味受体激活的实时cAMP检测测量方法

本实时高通量环磷酸腺苷（cAMP）检测方法的总体目标是对气味分子与气味受体进行相互筛选，即以气味分子筛选其对应的受体，或以受体筛选可激活它的气味分子。由于小鼠模型适用于研究气味受体的功能，可实现对大量气味受体及其配体的高通量筛选，并可用于特定受体-配体组合的药理学表征，因此本研究采用小鼠系统。该技术的主要优势在于，能够高效且可靠地评估气味分子对受体的激活作用。

使用活细胞的异源气味分子-受体表达系统。首先在相差显微镜下观察 Hana3A 细胞，以确保细胞活性并评估汇合度。随后吸除细胞培养皿中的全部培养基。

通过向培养板中加入10毫升磷酸盐缓冲液，轻轻晃动培养皿，然后吸去PBS，洗涤细胞。接着，向培养板中加入3毫升0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。将胰蛋白酶作用于细胞1分钟，或直至所有细胞悬浮。

通过加入5毫升含10%胎牛血清（FBS）的MEM培养基并反复吹打以分散细胞团块，从而灭活胰蛋白酶。完成细胞计数后，将每96孔板2×10⁶个细胞转移至15毫升离心管中用于转染。重要的是，必须准确计算接种到96孔板的细胞数量，以避免在刺激前出现细胞过度生长或生长不足的情况。

将离心管在200 × g条件下离心5分钟。然后小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。每块96孔板加入6 mL不含抗生素的培养基，轻轻吹打混匀，避免产生气泡，以分散细胞团块。

将悬浮细胞转移至储液槽中。使用多通道移液器，将50 µL细胞加入96孔板的每个孔中。在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。

转染前，在相差显微镜下观察接种的细胞，确保每孔细胞汇合度约为30%至50%，然后将细胞放回培养箱中。按照标记为odorant-to-receptor construct的行，依次加入辅助因子构建体和环磷酸腺苷生物传感器变体构建体。随后，为每块96孔板在500微升MEM中配制质粒转染混合物。

接下来，配制转染混合液，其中包含500微升MEM培养基和18微升脂质介导的转染试剂。用移液器反复吹打，将转染混合液与质粒混合液混匀。然后在室温下孵育15分钟。

孵育结束后，向转染混合物中加入5毫升含10%胎牛血清的MEM培养基以终止反应。接着，在细胞培养操作台内铺上一层厚厚的无菌纸巾。从培养箱中取出含有细胞的96孔板。

将培养板倒置，轻轻反复敲击在纸巾堆上，使培养基被纸巾完全吸收。向96孔板的每个孔中加入50 µL混合的转染液，于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜，时间为18至24小时。若一次实验中需检测多个96孔板，则可同时进行转染和刺激操作，并确保所有培养板的转染过程及刺激暴露时间间隔保持一致。

刺激前，将转染的细胞置于相差显微镜下观察，确保每孔细胞融合度在50%至80%之间，然后放回培养箱。随后，通过向Hanks'平衡盐溶液中加入10 mmol的heaps和5 mmol的葡萄糖，制备刺激用培养基。将实时cAMP检测底物试剂的55 µL分装样品置于冰上解冻。

通过混合55微升底物试剂和2,750微升刺激培养基，配制2%等量裂解液。在实验台上铺一层厚的纸巾，将培养板倒置后轻轻并反复敲击纸巾，使转染培养基被纸巾吸收。使用移液器向每个孔中加入50微升刺激培养基，对细胞进行洗涤。

轻柔地反复吸打96孔板中的刺激液。每孔加入25微升2%平衡溶液，于室温避光孵育两小时。在孵育结束前，将解冻的气味物质储备液稀释至工作浓度，并加入刺激液中。

在添加气味物质之前，使用化学发光酶标仪测量孔板的基础发光水平。迅速将孔板从酶标仪中取出，并向每个孔中加入25微升的气味物质稀释液。随后立即开始对所有孔进行连续发光检测，在30分钟内完成20个循环的测量。

采用实时cAMP检测法，对379种独特的人类嗅觉受体进行了30微摩尔麝香酮的筛选。X轴上的彩色方块表示不同的人类嗅觉受体家族。Y轴表示在加入气味分子后30分钟的归一化发光值，此时阳性对照的反应达到最大值。

显示了OR5AN1的响应情况。该图展示了不同浓度麝香酮激活OR5AN1的实时测量结果，以及无气味刺激的阴性对照结果。箭头指示气味分子添加的时间点。

此处展示了添加气味物质 30 分钟后 OR5AN1 对麝香酮的浓度反应曲线。此处所述技术共需三天时间，从第一天的培养层级库存板开始。一旦掌握，若操作得当，最后一天每块 96 孔板可在三小时内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用环磷酸腺苷（cAMP）检测方法来调控气味受体的激活，从而获取并利用实验结果。