Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

这种实时高通量环状 AMP 检测的总体目标是筛选气味剂与气味受体，反之亦然。由于小鼠可用于研究气味受体功能，因为它允许对气味受体和配体进行更大规模的筛选，以及感兴趣的受体-配体对的药理学卡特尔化。该技术的主要优点是我们可以有效可靠地评估气味剂对受体的激活。

使用活细胞的异源气味剂-受体表达系统。首先在相差显微镜下观察 Hana3A 细胞，以确保细胞活力并估计汇合度。然后从细胞培养皿中吸出所有培养基。

并在板上加入 10 毫升磷酸盐缓冲盐水，旋转培养皿并吸出 PBS，洗涤细胞。接下来，将 3 毫升 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 添加到板上。将胰蛋白酶留在细胞上 1 分钟或直到所有细胞都漂浮起来。

通过添加 5 毫升含 10% FBS 的 MEM 并上下吹打以分解细胞块来灭活胰蛋白酶。进行细胞计数后，将 2x10 个细胞转移至每 96 孔板的第 6 个细胞中，以转染到 15 mL 试管中。重要的是要计算要在 96 孔板上制备的正确细胞数量，以避免在刺激前细胞过度生长或生长不足。

试管以 200 倍 G 离心 5 分钟。然后在不干扰细胞托盘的情况下吸出上清液。为每个 96 孔板添加 6 毫升不含抗生素的培养基，并上下移液，不要产生气泡以分解细胞块。

将悬浮细胞转移到储液槽中。使用多通道移液器，将 50 微升细胞移液到 96 孔板的每个孔中。在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育过夜。

转染前，在相差显微镜下观察铺板的细胞，以确保每孔约 30% 至 50% 的适当汇合，然后返回培养箱。遵循行标记的气味剂-受体构建体、辅助因子构建体和环状 AMP 生物传感器变体构建体。然后为每个 96 孔板在 500 μL MEM 中制备血浆转染混合物。

接下来，在 500 μL MEM 中制备含有 18 μL 脂质介导的转染试剂的转染混合物。通过上下吹打将转染混合物与血浆混合物混合。然后在室温下孵育 15 分钟。

孵育后，向转染混合物中加入 5 mL 含 10% FBS 的 MEM 以终止反应。接下来，在细胞培养通风橱中铺上一层厚厚的无菌纸巾。从培养箱中取出装有细胞的 96 孔板。

轻轻地反复敲击纸巾堆上的盘子，使介质完全被纸巾吸收。将 50 μL 混合转染混合物转移至 96 孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育 18 至 24 小时。您可以管理转染，并且刺激计划应在仪器上持续进行，因为在一次实验中测试了多个 96 孔板，以便在相同的转染和蒸馏器曝光间隔后所有板都是镜像的。

刺激前，在相差显微镜下观察转染的细胞，以确保在返回培养箱之前每孔 50% 至 80% 的正确汇合。然后向 Hanks 平衡盐溶液中加入 10 毫摩尔堆和 5 毫摩尔葡萄糖来制备刺激培养基。在冰上解冻 55 微升实时环状 AMP 测定底物试剂 alloquats

通过将 55 微升底物试剂和 2， 750 微升刺激培养基混合，制备 2% 等研磨溶液。在工作台上铺开一层厚厚的纸巾后，轻轻地、反复地将板倒置在纸巾上，使转染培养基被纸巾吸收。通过向每个孔中移液 50 μL 刺激培养基来洗涤细胞。

轻轻地反复敲击 96 孔板中的刺激介质。将 25 微升 2% 平衡溶液移液到每个孔中，并在室温下避光孵育 2 小时。在孵育时间结束之前，将解冻的加臭剂储备液稀释至工作浓度和刺激介质。

在添加加臭剂之前，使用化学发光读板器测量板的基础发光水平。从读板器中快速取出板，并向每个孔中加入 25 μL 加臭剂稀释液。然后立即开始在 30 分钟内对所有孔进行 20 次循环的连续发光测量。

使用实时环状 AMP 测定法针对 30 μmol 麝香酮筛选了 379 个独特的人类气味受体。沿 X 轴的彩色块表示不同的人类气味受体家族。Y 轴表示添加加臭剂后 30 分钟的归一化发光，当阳性对照的响应达到最大值时。

指示 OR5AN1 的反应。该图显示了不同浓度的麝香酮对 OR5AN1 激活的实时测量以及无气味阴性对照的结果。箭头表示 oderant 添加的时间点。

这里显示了 OR5AN1 在添加 odent 后 30 分钟对麝香酮的浓度反应曲线。此处描述的技术总共需要三天时间，从第一天的培养层储备板开始。一旦掌握，如果作得当，每个 96 孔板的最后一天可以在三个小时内完成。

观看此视频后，您应该对如何使用环状 AMP 测定来管理 oderant 受体的激活有一个很好的了解，以利用结果。