Name: 实时 cAMP 检测气味受体激活的活细胞测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习使用实时高通量cAMP检测法在活细胞中筛选气味受体激活，该方法利用Hana3A细胞异源表达系统，可高效可靠地评估气味分子与受体相互作用，为嗅觉神经科学和药理学研究提供重要技术支持。

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本工作得到中国国家自然科学基金（31070972）、上海市科学技术委员会（16ZR1418300）、上海市教育委员会创新团队计划、上海市东方学者计划（J50201）以及国家重点基础研究发展计划（2012CB910401）的资助。

1. Hana3A 细胞的培养与维持
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中，将细胞培养于100 mm细胞培养皿中的10 mL最低必需培养基（MEM）中，培养基中含10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素-链霉素和1.25 µg/mL两性霉素B。每次传代时，每隔一次加入1 µg/mL嘌呤霉素，以维持质粒的稳定转染（参见引言）。 
	注意：所有涉及细胞培养的操作步骤均应在II级生物安全柜中进行，以确保无菌环境。</li>
	<li>每2–3天以10–20%的比例在100 mm培养皿中进行传代培养。</li>
</ol>
2. 转染用细胞铺板
<ol>
	<li>在相差显微镜下观察 Hana3A 细胞，以确保细胞活性并评估汇合度。</li>
	<li>吸除细胞培养皿中的全部培养基。</li>
	<li>加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，轻轻晃动培养皿后吸除 PBS。</li>
	<li>向培养皿中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），混匀 1 分钟，或直至所有细胞悬浮。 
	 注意：必要时在显微镜下观察细胞从培养皿底部脱落的进程。</li>
	<li>加入 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 MEM 培养基以终止胰蛋白酶作用，并通过吹打使细胞团块分散。 
	 注意：若用于转染前的铺板，所用培养基中不应含有抗生素。添加抗生素可能会降低转染效率。</li>
	<li>根据待转染的培养板数量，将适量细胞转移至 15 mL 离心管中。每块 96 孔板接种 2 × 106 个细胞，约为一个 100% 汇合度的 100 mm 培养皿细胞量的 1/5，相当于每孔 2 × 104 个细胞，或每孔汇合度约为 15–30%。在 200 × g 条件下离心 5 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。 
	 注意：应准确计算接种至 96 孔板的细胞数量，以避免在刺激前出现细胞过度生长或生长不足的情况。</li>
	<li>向 15 mL 离心管中加入适量含 10% FBS 的 MEM 培养基，通过吹打使细胞团块充分分散。每块 96 孔板使用 6 mL 含 10% FBS 的 MEM 重悬细胞。 
	 注意：操作时需小心，避免在离心管中产生气泡。</li>
	<li>将重悬的细胞加入储液槽中，使用多通道移液器向 96 孔板的每孔加入 50 µL 细胞悬液。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
</ol>
3. 质粒转染
<ol>
	<li>转染前，在相差显微镜下观察培养板中的细胞，确保每孔细胞汇合度约为30-50%，随后将培养板放回培养箱。</li>
	<li>提前准备好带有Rho标签的OR构建体11,21,22,28，辅助因子构建体（RTP1S22,36 和 M3R23），以及生物传感器变体构建体29,30 通过质粒小提纯化。使用分光光度计测定DNA浓度，并调整质粒DNA浓度（例如必要时用蒸馏水稀释至100 ng/µL。</li>
	<li>转染混合物的制备
	<ol>
		<li>为每块96孔板，在500 µL MEM中配制质粒转染混合液，具体步骤如下 表1. 
		注意：当在同一块96孔板上测试不同的嗅觉受体（OR）时，转染混合物体积以及加入的质粒DNA量必须根据转染了特定OR的孔数进行相应调整。</li>
		<li>在试管中，将18 µL脂质介导转染试剂加入500 µL MEM中，配制转染混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器反复吹打，将质粒混合物与转染混合物混匀。室温孵育15分钟。</li>
	<li>通过加入5 mL含10% FBS的MEM终止反应。</li>
	<li>在细胞培养超净台内铺一层较厚的无菌纸巾。从培养箱中取出含有细胞的96孔板，轻轻反复将板子倒置敲击在纸巾堆上，使培养基被纸巾完全吸收。 
	注意：切勿用力或突然敲击培养板，以免造成细胞丢失。</li>
	<li>将50 µL混合转染液转移至96孔板的每个孔中，在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜18–24 h2. 
	注意：当一个实验中需检测多个96孔板时，应事先规划好转染和刺激的时间安排，以确保所有孔板在相同的转染时间和刺激暴露时间后进行检测。</li>
</ol>
4. 使用实时 cAMP 检测法刺激并测量嗅觉受体活性
<ol>
	<li>在相差显微镜下观察转染后的细胞，确保每孔细胞融合度为50-80%，然后放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>通过向Hank's平衡盐溶液（HBSS）中添加10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5 mM葡萄糖，制备刺激培养基。</li>
	<li>将实时cAMP检测底物试剂分装样品置于冰上解冻。将底物试剂以每管55 µL分装于PCR管中，于-80 °C保存。每块板使用1管。</li>
	<li>将55 µL底物试剂与2750 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液混合，配制2%平衡溶液。</li>
	<li>在实验台上铺一层厚的纸巾。将培养板倒置，轻轻反复敲击纸巾，使转染培养基被纸巾完全吸收。</li>
	<li>用移液器向每孔加入50 µL HBSS/HEPES/葡萄糖溶液，洗涤细胞。</li>
	<li>轻轻反复敲击96孔板，去除HBSS/HEPES/葡萄糖溶液。</li>
	<li>向每孔加入25 µL 2%平衡溶液，在室温避光条件下孵育2小时。</li>
	<li>提前用DMSO配制1 M气味分子储备液，并于-20 °C保存，直至使用。</li>
	<li>在孵育结束前，将气味分子储备液用HBSS/HEPES/葡萄糖刺激培养基稀释至工作浓度。 
	注意：本步骤中配制的气味分子稀释液浓度应为最终所需浓度的两倍，以确保每孔中达到正确的终浓度。</li>
	<li>使用化学发光酶标仪，在加入气味分子前，以每孔1000 ms的速率连续测量培养板的基础发光水平两次34。</li>
	<li>迅速将培养板从酶标仪中取出，向每孔加入25 µL气味分子稀释液，并立即开始对所有孔进行连续发光检测，30分钟内完成20个循环的测量。 
	注意：当在同一块板中使用不同气味分子或同一气味分子的不同浓度时，应小心移液，避免污染相邻孔。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>从化学发光酶标仪软件中导出数据。</li>
	<li>使用以下公式计算每个时间点的归一化OR反应值： 
	（luminescenceN – luminescencebasal）/（luminescencehighest – luminescencebasal） 
	其中，N 表示某一孔的发光值；basal 表示两个基础发光值的平均值；highest 表示一块或一组板中的最高发光值。 
	注意：根据实验目的，可采用其他图形表示方法。例如，在筛选实验（见图1）和构建浓度-反应曲线时，可使用动力学测量过程中某一特定时间点（如最大值或终末值）的某一孔的发光值。</li>
</ol>

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<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

准确测量某一嗅觉受体（OR）在特定气味分子作用下的激活情况，是解析嗅觉信息编码的首要步骤。本研究展示的实验示例了如何利用一种方法来鉴定 体外 OR表达系统，筛选人类OR基因库中对该目标气味化学物质有响应的嗅觉受体，随后利用不同浓度的该化学物质表征受体的药理学特性。我们的结果证实OR5AN1是一种 真正有效的 麝香酮受体。这与之前的一项报道一致39 并为“仅有少量受体参与麝香气味感知”这一推测提供了进一步证据27,40与佐藤-秋原的筛查数据相比 等 在使用萤光素酶检测法于相似或异源表达系统中进行检测时，我们的筛选结果显示信噪比较低。除不同技术本身固有的差异外，结果差异可能源于我们采用了较低的麝香酮浓度（30 µM）。 与 100 µM）。事实上，EC50 OR5AN1 对麝香酮的浓度-反应曲线经实时 cAMP 检测法测得的值，与 Sato-Akuhara 所获得的值处于同一数量级 <...

嗅觉在动物的生存中起着重要作用，因为动物依赖其嗅觉能力来获取食物、躲避捕食者和危险、区分物种以及选择配偶1,2。这些功能的实现依赖于气味受体（ORs），这些受体在位于嗅上皮（OE）中的嗅觉感觉神经元（OSNs）的纤毛表面单独表达。ORs属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族中最大的家族，在人类和小鼠中分别约有400个和1200个不同的OR基因3,4,5。当ORs被气味分子激活后，会通过依次激活嗅觉G蛋白（Golf）和III型腺苷酸环化酶（ACIII），导致细胞内cAMP水平升高。升高的细胞内cAMP可作为第二信使，打开细胞膜上的核苷酸门控通道，引发包括Ca2+在内的阳离子内流以及动作电位的产生，最终启动神经电位传递和嗅觉感知。ORs对大量气味分子的检测与分辨过程被认为是嗅觉感知的第一步6,7。
自从Buck和Axel以来8 首次成功克隆嗅觉受体并阐明由ORs启动的嗅觉感知机制后，OR家族的去孤儿化成为该领域的研究热点之一。多种 体内, 离体 和 体外 已报道了多种测量嗅觉受体激活的方法9,10,11,12一种使用Ca的传统方法2+ 成像结合对嗅觉神经元的单细胞RT-PCR，实现了对脂肪族气味物质响应的不同嗅觉受体的鉴定13,14,15近年来，大规模转录组分析的出现推动了更高通量技术的发展 体内 方法。利用S100a5-tauGFP报告小鼠品系和微阵列分析，肯塔基检测法鉴定了对丁子香酚和麝香酮有响应的小鼠嗅觉受体9基于气味暴露后OR mRNA水平的下降，DREAM技术采用转录组学方法来确定脊椎动物和非脊椎动物物种中的OR激活谱型。16同样，鉴于S6在神经元激活过程中的磷酸化现象，Matsunami研究组通过对磷酸化核糖体进行免疫沉淀后测序mRNA，以鉴定响应性的嗅觉受体（ORs）。12最后，Feinstein 团队报道了超级嗅觉小鼠，可作为研究气味编码的平台 体内，称为MouSensor技术17.
在体外（in vitro）条件下，由于培养嗅觉神经元（OSNs）存在困难，因此构建一种能够模拟体内（in vivo）嗅觉受体（OR）功能表达的异源表达系统，成为对气味化学物质进行大规模筛选的理想方案。然而，由于非嗅觉来源的培养细胞系与天然OSNs存在差异，OR蛋白往往滞留在内质网中，无法转运至细胞膜，导致OR降解并丧失受体功能18,19。为解决这一问题，研究人员已开展大量工作，致力于在异源细胞系中实现OR在细胞膜上的功能性表达。Krautwurst 等首次将视紫红质（rhodopsin）的前20个氨基酸（Rho标签，Rho-tag）连接至OR蛋白的N端，从而促进了部分OR在人胚肾（HEK）细胞中的细胞表面表达20。Saito 等通过分析单个OSNs的基因表达序列标签（SAGE）文库，首次克隆出受体转运蛋白（RTP）家族成员RTP1和RTP2，以及受体表达增强蛋白1（REEP1），这些蛋白可促进OR向细胞膜的转运，并增强HEK293T细胞中OR对气味分子的响应能力21。基于上述发现，Matsunami研究团队成功构建了Hana3A细胞系，该细胞系在HEK293T细胞中稳定转染了RTP1、RTP2、REEP1和Gαolf，并瞬时转染带有Rho标签的OR，从而实现了高效的OR功能性表达。后续研究进一步揭示：1）RTP1的一个较短亚型RTP1S，其促进OR功能的效果优于全长RTP1蛋白；2）M3型毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M3R）可通过抑制β-arrestin-2的募集来增强OR活性。这两项成果随后被引入异源表达系统，以优化实验结果22,23。
已有多种检测方法用于量化异源系统中的受体激活。分泌型胎盘碱性磷酸酶（SEAP）检测法利用由cAMP反应元件（CREs）转录调控的报告酶，使其成为评估嗅觉受体（OR）激活的优选方法。在与SEAP检测试剂孵育后，可直接在培养基样品中检测到荧光信号24。利用该方法，不仅嗅觉受体（ORs）的功能得到了表征，而且在嗅上皮（OE）中表达的另一类化学感受受体——痕量胺相关受体（TAARs）的功能也已被阐明25,26,27。另一种常用方法是荧光素酶检测法，该方法采用受cAMP反应元件（CRE）调控的萤火虫荧光素酶报告基因。通过检测荧光素酶表达所产生的发光信号，可高效且稳健地量化OR的激活水平10,11,28。
实时cAMP检测技术也已广泛用于动态监测异源或内源性G蛋白偶联受体（GPCR）的功能。其中一种先进的检测方法利用了一种基因编码的生物传感器变体，该传感器包含一个与突变型荧光素酶融合的cAMP结合域。当cAMP结合时，引发构象变化，从而激活荧光素酶，其产生的发光信号可通过化学发光检测仪进行测量29,30。已有研究报道，实时cAMP技术适用于在HEK293细胞和NxG 108CC15细胞中对人类嗅觉受体进行去孤儿化研究31,32,33，同时也适用于HEK293T衍生的Hana3A细胞34,35。Krautwurst研究组还详细描述了该技术适用于双向大规模嗅觉受体筛选策略32,33。
本文介绍了一种利用Hana3A细胞中实时cAMP检测方法测定嗅觉受体（OR）激活的实验方案。在此方案中，对预先平衡的活细胞在加入特定挥发性化合物后，连续30分钟动力学地测定其发光信号，从而实现对OR激活更为高效且准确的分析，该方法相较于长时间孵育条件下易产生的细胞环境干扰及气味诱导的细胞毒性等假象具有更强的抗干扰能力。这种实时检测方法可用于大规模筛选OR受体及其配体，并可用于表征特定的OR-配体相互作用。利用该方法，我们通过对379种人源OR进行筛选，并进一步验证阳性结果，成功鉴定出OR5AN1为麝香成分麝香酮的受体。

<table><tbody><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP试剂</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP质粒</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A细胞</td><td></td><td></td><td>可根据要求向作者索取</td></tr><tr><td>不含钙或镁的HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R质粒</td><td></td><td></td><td>克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中</td></tr><tr><td>含EBSS和L-谷氨酰胺的MEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>麝香酮</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>西藏麝香酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>OR质粒</td><td></td><td></td><td>用Rho标签克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中</td></tr><tr><td>不含钙或镁的PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S质粒</td><td></td><td></td><td>克隆至如pCI等哺乳动物表达载体中</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 17 mm × 120 mm锥形管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8通道和/或12通道多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔平底白色细胞培养板</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 20 mm细胞培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>带有层流的II级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵育箱，含5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机，配备适用于15 mL锥形管的摆动桶转子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite F200酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备×10和×20物镜的相差显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于多通道分配的无菌试剂储液槽</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞中气味受体激活的实时camp检测测量方法

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

哺乳动物嗅觉受体（OR）家族数量庞大，导致在众多挥发性化学物质中鉴定其对应配体存在困难。为高效且准确地去孤儿化OR，我们结合使用异源细胞系表达哺乳动物OR，并利用基因改造的生物传感器质粒，实时检测OR激活后下游的cAMP生成。该检测方法可用于对OR进行气味分子筛选。 反之亦然通过使用不同气味分子浓度进行测试并绘制浓度-反应曲线，可进一步验证筛选中发现的气味分子-受体阳性相互作用。本文采用该方法对一种气味化合物在表达于Hana3A细胞中的人类嗅觉受体文库中进行了高通量筛选，并确认产生阳性反应的受体即为该目标化合物的特异性受体。我们发现，该高通量检测方法在评估嗅觉受体激活方面具有高效性和可靠性，本研究的数据为该方法在嗅觉受体功能研究中的潜在应用提供了实例。

麝香酮是天然麝香中的主要芳香成分。近期研究通过与小鼠中克隆自对麝香酮有反应的嗅小球的嗅觉受体 MOR215-1 进行同源性比对，鉴定出 OR5AN1 是人类识别麝香酮及其他大环麝香化合物的受体37,38。通过筛选人类嗅觉受体文库，我们课题组与东原课题组也利用荧光素酶报告基因检测系统分别鉴定出 OR5AN1 是环十五酮和麝香酮这两种大环麝香化合物的主要受体38,39。
利用此处描述的实时cAMP检测方法，我们用30 µM麝香酮对人类嗅觉受体（OR）文库进行了筛选（图1）。在筛选的379个人类OR中，OR5AN1对麝香酮表现出显著的响应，而其他OR以及阴性对照（无气...

对气味受体功能的表征是去孤儿化过程中的关键环节。本文描述了一种利用cAMP检测法实时测量气味受体激活的方法。

活细胞中气味受体激活的实时cAMP检测测量方法

哺乳动物嗅觉受体（OR）家族的庞大数量使得在众多挥发性化学物质中寻找其特异性配体变得困难。

本实时高通量环磷酸腺苷（cAMP）检测方法的总体目标是实现气味分子与气味受体之间的相互筛选，即既可针对气味受体筛选气味配体，也可反之进行。由于小鼠模型适用于研究气味受体的功能，可支持更大规模的气味受体及其配体筛选，并可用于特定受体-配体组合的药理学表征。该技术的主要优势在于，能够高效且可靠地评估气味分子对受体的激活作用。使用活细胞的异源气味分子-受体表达系统。首先在相差显微镜下观察Hana3A细胞，以确保细胞活性并评估汇合度。随后吸除细胞培养皿中的全部培养基。通过向培养板中加入10毫升磷酸盐缓冲液，轻轻晃动培养皿，然后吸去PBS，洗涤细胞。接着，向培养板中加入3毫升0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。将胰蛋白酶作用于细胞1分钟，或直至所有细胞悬浮。 通过加入5毫升含10%胎牛血清（FBS）的MEM培养基并反复吹打以分散细胞团块，从而抑制胰蛋白酶活性。细胞计数后，将每96孔板2×10⁶个细胞转移至15毫升离心管中用于转染。重要的是，必须准确计算接种到96孔板的细胞数量，以避免在刺激前出现细胞过度生长或生长不足的情况。将离心管在200 × g条件下离心5分钟。然后小心吸走上清液，避免扰动细胞沉淀。每块96孔板加入6 mL不含抗生素的培养基，轻轻吹打混匀，避免产生气泡，以分散细胞团块。将悬浮细胞转移至储液槽中。使用多通道移液器，将50微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。转染前，在相差显微镜下观察培养板中的细胞，确保每孔细胞融合度约为30%至50%，然后放回培养箱。按照气味分子受体构建体、辅助因子构建体和环磷酸腺苷生物传感器变体构建体的行进行操作。随后为每块96孔板在500微升MEM中配制质粒转染混合液。接下来，配制转染混合液，其中包含500微升MEM培养基和18微升脂质介导的转染试剂。用移液器反复吹打，将转染混合液与质粒混合液混匀。然后在室温下孵育15分钟。孵育结束后，向转染混合物中加入5毫升含10%胎牛血清（FBS）的MEM培养基以终止反应。接着，在细胞培养操作台内铺上一层厚厚的无菌纸巾。从培养箱中取出含有细胞的96孔板。轻轻反复将培养板倒扣在纸巾堆上，使培养基被纸巾完全吸收。向96孔板的每个孔中加入50微升混合好的转染混合物，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜18至24小时。若单次实验需检测多个96孔板，则可统一安排转染与刺激时间表，确保所有培养板的转染操作及刺激暴露间隔保持一致。刺激前，在相差显微镜下观察转染的细胞，确保每孔细胞融合度在50%至80%之间，然后放回培养箱。随后，通过向Hanks'平衡盐溶液中加入10毫摩尔HEPES和5毫摩尔葡萄糖，制备刺激用培养基。将实时cAMP检测底物试剂的55微升分装样品置于冰上解冻。通过混合55微升底物试剂和2,750微升刺激培养基，配制2%等量裂解液。在实验台上铺一层厚的纸巾，将培养板倒置后轻轻并反复在纸巾上轻敲，使转染培养基被纸巾吸收。使用移液器向每个孔中加入50微升刺激培养基，对细胞进行洗涤。轻柔地反复吸打96孔板中的刺激液。每孔加入25微升2%平衡溶液，室温避光孵育两小时。在孵育结束前，将解冻的气味物质储备液稀释至工作浓度，并加入刺激液中。在添加气味物质之前，使用化学发光酶标仪测量孔板的基底发光水平。迅速将孔板从酶标仪中取出，向每孔加入25微升气味物质稀释液，然后立即开始对所有孔进行连续发光检测，共检测20个循环，持续30分钟。采用实时cAMP检测法，对379种独特的人类嗅觉受体进行了30微摩尔麝香酮的筛选。X轴上的彩色方块表示不同的人类嗅觉受体家族。Y轴表示在加入气味分子后30分钟的归一化发光值，此时阳性对照的反应达到最大值。显示了OR5AN1的响应情况。该图展示了不同浓度麝香酮激活OR5AN1的实时测量结果，以及无气味刺激的阴性对照结果。箭头指示气味分子添加的时间点。此处展示了添加气味物质30分钟后，OR5AN1对麝香酮的浓度-反应曲线。本方法共需三天时间，从第一天的培养物原代细胞库开始。一旦熟练掌握，若操作得当，最后一天每块96孔板可在三小时内完成。观看本视频后，您应充分了解如何利用环磷酸腺苷（cAMP）检测方法来调控气味受体的激活，从而获取并利用实验结果。

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实时 cAMP 检测气味受体激活的活细胞测量

本文展示了一种用于活细胞染色的实验方案，可方便地检测气味受体在HEK293T细胞表面的表达。此外，该方法也可用于检测其他化学感受受体或G蛋白偶联受体（GPCRs）在细胞表面的表达。...

在异源细胞中检测化学感受受体的表面表达

本视频演示了利用环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和发光检测技术，在转染细胞中检测气味受体激活的实验方案。该方法可用于研究嗅觉神经元中的受体-配体相互作用及信号转导通路。...

使用实时环磷酸腺苷检测法测量气味受体激活

来源：de March, C. A. 等. 气相气味分子对体外气味受体激活的实时监测。J. Vis. Exp.

重组细胞中气味受体激活的实时监测

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。...

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

嗅觉受体的激活模式编码了气味的身份信息，但由于目前尚无公开发表的数据来明确哺乳动物嗅觉受体的气味配体，这阻碍了构建全面的气味编码模型。本实验方案描述了一种方法，可促进嗅觉受体配体的高通量鉴定以及受体激活程度的定量分析。...

高通量分析哺乳动物嗅觉受体：通过荧光素酶活性检测受体激活

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

本方案分析导航行为 黑腹果蝇 幼虫在嗅觉神经元同时接受光遗传学刺激时的行为反应。使用波长为630...

追踪 果蝇 幼虫对嗅觉神经元光遗传学刺激的行为反应

生理上，气味受体由气相吸入的气味分子激活。然而，大多数体外系统采用液相气味刺激。本文介绍一种方法，可在气相气味刺激条件下实现对气味受体激活的实时体外监测。...

气相气味分子实时体外监测气味受体激活

本研究中介绍的实验方案展示了cAMP差异检测器In...

利用荧光cAMP差异检测器原位监测活细胞中cAMP的实时动态变化

嗅觉受体神经元（ORNs）首先将气味信号转化为受体电流，进而触发动作电位，并传递至嗅球中的二级神经元。本文描述了采用吸液电极技术，同时记录小鼠嗅觉受体神经元中由气味诱导产生的受体电流和动作电位的方法。...

使用吸管技术记录嗅觉受体神经元对气味分子刺激的反应

学习使用实时高通量cAMP检测法在活细胞中筛选气味受体激活，该方法利用Hana3A细胞异源表达系统，可高效可靠地评估气味分子与受体相互作用，为嗅觉神经科学和药理学研究提供重要技术支持。

活细胞中气味受体激活的实时cAMP检测测量方法

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