Name: 体外生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 了解体外生物发光检测法在乳腺上皮细胞中表征昼夜节律的技术。该方法利用PER2基因启动子控制的荧光素酶报告系统，可评估环境因子对细胞生物钟的影响，适用于多种细胞类型。

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本工作得到了2012年毒理学学会（SOT）-高露洁棕榄替代研究基金（M. Fang）和韩国动物与植物检疫署国际合作研究基金（M. Fang）以及美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）基金P30ES005022（H. Zarbl）的支持。我们感谢德克萨斯大学休斯顿健康科学中心麦戈文医学院郑 Chen 博士的有益讨论，感谢Shao-An Juan先生在实验方面的协助，以及Nakata Kimi女士在文稿校对方面的帮助。

1. 构建由PER2启动子驱动的不稳定化荧光素酶报告载体
<ol>
	<li>购买定制的 pLS[hPER2P/rLuc/Puro 载体，该载体包含编码 rLuc 和人类 PER2 启动子片段（hPER2P，941 bp）位于位点之间 Sac 我与 下肢 III 位于多克隆位点区域17.</li>
	<li>剪切人 PER2 启动子片段（hPER2P，941 bp）从载体中扩增出来。
	<ol>
		<li>加入2.5 &#181;L限制性内切酶缓冲液，10 &#181;L（180 ng）pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 载体，以及 1 &#181;每微升各限制性内切酶，Sac I（10 单位/微升）&#181;L）和 Hind III（10 单位/&#181;L），加入无 DNA/RNA/核苷酸的微量离心管中。加入超纯水（10.5 &#181;L）最多 25 &#181;用移液器轻轻吹打混匀。</li>
		<li>在37℃下孵育 &#176;在加热块中于 C 孵育 90 分钟。</li>
		<li>运行全部体积（25 &#181;使用含0.0001%溴化乙锭（EtBr）的0.7%琼脂糖凝胶对限制性内切酶反应产物进行电泳，以分离hPER2P与载体。 
		注意：溴化乙锭（EtBr，3,8-二氨基-1-乙基-6-苯基菲啶溴化物，CAS 登记号：1239-45-8）为无味红色液体，是一种嵌入性试剂，常用于琼脂糖凝胶电泳中作为荧光标记物（核酸染料），在紫外光下呈橙色。尽管尚无监管机构将其归类为致癌物，但在实验动物中已观察到其可能具有不可逆的致突变风险。18因此，我们将使用过的含溴化乙锭（EtBr）的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液作为化学危险废物收集，并提交至罗格斯大学环境健康与安全办公室处理。 &amp;#38; 安全（REHS）以安全地收取和处理。</li>
		<li>切下含有在941 bp处显示溴化乙锭荧光条带的琼脂糖凝胶片段，使用DNA凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化hPER2P片段，随后通过分光光度计在260 nm波长处测定吸光度（OD）进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线性化 1.0 &#181;L (1 &#181;g) 不稳定化的萤火虫荧光素酶表达载体 pGL[Luc2P/Neo] 采用与步骤 1.2.1–1.2.2 相同的方法。使用 DNA 纯化试剂盒提取质粒，随后使用分光光度计按照上述方法进行定量。</li>
	<li>将 hPER2P 连接到线性化载体 pGL[Luc2P/Neo 
	注意：根据制造商的说明，插入片段与载体的最佳摩尔比为2:1。对于50 ng载体，插入片段的理想用量可通过以下公式计算：[(50 ng载体 × 1.0 kb插入片段)/4.242 kb载体] × (2/1) = 23.6 ng插入片段。根据hPER2P的浓度（7.26 ng/μL）&#181;L）和 pGL[Luc2P/Neo]（50 ng/&#181;L），50 ng pGL[Luc2P/Neo] 和 23.6 ng hPER2P 被计算为 1 &#181;L 和 3.26 &#181;L，分别。
	<ol>
		<li>加入2 &#181;L T4 DNA连接酶反应缓冲液（10X）（50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂）2，1 mM ATP，和 10 mM DTT），3.26 &#181;L (23.6 ng) hPER2P, 1 &#181;L（50 ng）pGL[Luc2P/Neo]，以及13.74 &#181;L 水至 20 &#181;L，轻轻混匀。</li>
		<li>加入1 &#181;L T4 DNA连接酶（400单位/μL）&#181;L），轻轻混匀，于16℃孵育 &#176;在PCR仪中于4°C过夜连接，随后根据制造商说明将连接产物置于冰上冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将连接的载体 pGL[hPer2P/Luc2P/Neo] 转化至化学感受态 E. coli19.
	<ol>
		<li>将水浴温度设置为 42 &#176;C，将含有分解代谢物抑制的超优肉汤（S.O.C.）培养基（2% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂）预热2，10 mM MgSO₄4，以及 20 mM 葡萄糖）置于室温下，将含 100 的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板升温 &#181;g/mL 氨苄青霉素，80 &#181;g/mL X-gal，以及 0.5 &#181;M IPTG) 在 37 &#176;C 培养箱，并在冰上解冻一管感受态 E. coli 每次转化所需的细胞</li>
		<li>加入6 &#181;L（21 ng）连接载体或1 &#181;L（30 ng）空载体（阴性对照）加入至一支化学感受态细胞管中 E. coli (50 &#181;L）然后轻轻翻转试管混匀。冰上孵育30分钟。</li>
		<li>42°C 热激 &#176;37 °C 水浴中静置 30 秒，不摇动，然后放回冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个 E. coli 通过蓝/白筛选法筛选连接载体转化的菌落。
	<ol>
		<li>加入250 &#181;L S.O.C. 培养基用于转化后细胞的培养 大肠杆菌 管，37℃孵育1小时 &#176;在200 rpm条件下振荡培养。</li>
		<li>接种10-50 &#181;转化细胞的L 大肠杆菌 在LB琼脂平板表面均匀涂布。将平板倒置于37 &#176;C培养箱中孵育过夜。 
		注意：高效的克隆反应应产生数百个菌落。建议涂布两种不同的体积，以确保至少有一个平板上的菌落大而清晰，呈白色或蓝色，且分布间距良好。当菌落过小、颜色难以分辨时，使用显微镜（10倍或50倍）观察会有所帮助。</li>
		<li>从平板上用无菌牙签挑取 3-6 个白色菌落，分别将每个菌落接种至含有 4 mL 添加 50 &#181;g/mL 氨苄青霉素</li>
		<li>在 37 ℃ 条件下孵育试管 &#176;在200 rpm条件下振荡培养过夜。使用4 mL培养液中的2 mL提取DNA E. coli 按照制造商说明书，使用质粒DNA提取小量制备试剂盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证并分析插入片段（hPER2P，941 bp）
	<ol>
		<li>用限制性内切酶消化质粒DNA，并按照步骤1.2.1-1.2.3所述进行电泳，以确认是否存在插入片段。 
		注意：阳性对照（在步骤 1.2.4 中纯化的 hPER2P）和阴性对照（E. coli 转染空载体的细胞也被包括在内。</li>
		<li>使用 M13 正向引物和 M13 反向引物对所选质粒 DNA 进行测序，以确认插入片段在质粒中的方向和序列19. 
		注意：仅选择一个在电泳中插入片段大小正确、且测序结果中方向和序列均正确的hPER2P克隆。</li>
		<li>分析人类 PER2 昼夜节律调控元件的启动子片段（hPER2P，941 bp）序列，包括E-box基序（Bmal1结合位点，CAT/CGTG）、CCAATC、GC box以及转录起始位点（CAGCGG）20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增选定的 E. coli 通过加入剩余的2 mL培养液 大肠杆菌 加入含有50的200 mL LB培养基中 &#181;g/mL 氨苄青霉素，然后在 37℃ 过夜培养 &#176;在 200 rpm 条件下振荡培养。</li>
	<li>使用无内毒素质粒大提试剂盒，按照制造商说明书提取DNA，然后用分光光度计在260 nm波长下测定OD值以定量DNA。将质粒DNA pGL[hPer2P/Luc2P/Neo]分装后于-80 ℃保存 &#176;C 冻存以备将来使用。</li>
</ol>
2. 瞬时转染
<ol>
	<li>购买并培养 MCF10A 细胞
	<ol>
		<li>从商业细胞库购买一种永生化、非转化的正常人乳腺上皮细胞系（MCF10A），该细胞在冻存前已通过细胞遗传学检测和短串联重复序列分析进行鉴定。每瓶冻存细胞复苏后，培养时间最长不超过 8 周。 
		注意：与其他细胞不同，这些细胞在达到约 70% 汇合度时会出现接触抑制，因此传代应在约 70% 汇合度时进行。</li>
		<li>使用乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM），其中包含乳腺上皮基础培养基（MEBM）、生长添加剂和霍乱毒素，在 37 °C、95% 湿度和 5% CO2 的细胞培养箱中培养细胞。 
		注意：购买以 SingleQuot（SQ）形式提供的即用型生长因子，并单独获取霍乱毒素。生长添加剂的终浓度为 0.4% 牛垂体提取物、0.1% 胰岛素、0.1% 氢化可的松、0.1% 人表皮生长因子、100 ng/mL 霍乱毒素，以及 0.05% 庆大霉素硫酸盐和 0.05% 两性霉素 B。</li>
		<li>在 10 cm 培养皿中加入 10 mL 胰蛋白酶/EDTA，孵育约 20 分钟以解离细胞，然后加入 10 mL 胰蛋白酶中和液中和胰蛋白酶活性。用 HEPES 缓冲盐溶液（HBSS）收集全部细胞。</li>
		<li>在倒置显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数，计算单细胞悬液的浓度，然后根据需要接种一定数量的细胞。充分轻摇培养板，使细胞在每孔中均匀分布。将细胞置于 37 °C、95% 湿度和 5% CO2 的细胞培养箱中孵育。 
		注意：可购买包含胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和液和 HBSS 的传代试剂套装使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用构建的生物钟报告载体对细胞进行瞬时转染
	<ol>
		<li>将 2 × 105 个 MCF10A 细胞均匀接种于 35 mm 培养皿中，使用 MEGM 培养，使其生长至 20–30% 汇合度（次日）。</li>
		<li>将低血清培养基（例如，Opti-MEM）在 37 °C 水浴中预热，转染试剂在室温下平衡 30 分钟。用无内毒素的 Tris-EDTA（TE）缓冲液将构建的质粒 DNA（pGL[hPer2P/Luc2P/Neo]）稀释至 30 ng/µL，并置于室温保存。</li>
		<li>在 1.5 mL 微离心管中配制质粒转染混合物：先加入 63.6 µL 预热的低血清培养基，再加入 33.4 µL（0.1 µg）质粒 DNA，轻轻吹打混匀，最后直接将 3 µL 转染试剂滴加至管中心，避免接触管壁。吹打混匀后，室温静置 30 分钟。</li>
		<li>将全部质粒混合物（100 µL）直接滴加至培养皿中培养基表面，轻轻晃动培养皿混匀。将细胞在 CO2 培养箱中继续培养 48–72 小时。 
		注意：由于这些细胞在约 70% 汇合度时出现接触抑制，预计转染效率在 40–70% 汇合度时最高。因此，转染操作宜从约 20% 汇合度开始，并在达到约 70% 汇合度时停止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生物钟报告系统的建立 体外 瞬时转染MCF10A细胞中的生物发光检测
<ol>
	<li>在转染后48-72小时，当细胞融合度约为70%时，用不含生长因子的MEBM培养基对培养的细胞进行24小时的饥饿处理。</li>
	<li>在CO2培养箱中，使用同步化试剂（例如，50%马血清（HS））在MEBM培养基中处理细胞1.5小时。 
	注意：为选择理想的同步化试剂，比较了10 µM佛司可林、1 nM褪黑素、0.1 µM地塞米松、50% HS和100% SQ在转染了生物钟报告载体的细胞中对节律振幅和周期的影响。空载体转染的细胞以100% SQ处理作为阴性对照。</li>
	<li>在50 mL无菌离心管中，加入5 mL MEGM、15 mL MEBM、150 µL碳酸氢钠、200 µL HEPES和40 µL荧光素工作液（50 mM），预先配制20 mL记录培养基（适用于10个30 mm培养皿）。 
	注意：各组分的终浓度分别为：20% SQ和20 ng/mL霍乱毒素、0.06%碳酸氢钠、1%青霉素/链霉素和10 mM HEPES。将预先配制的记录培养基和无菌1x PBS在37 °C水浴中预热30分钟。使用前立即加入100 µM荧光素。</li>
	<li>用预热的1x杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）在同步化试剂孵育后清洗细胞3次，然后加入2 mL记录培养基。</li>
	<li>用硅脂将无菌盖玻片密封在培养皿上以防止蒸发，然后在侧面做好标记。</li>
	<li>将密封好的培养皿放入化学发光仪的样品槽中，并开启将文件保存至指定文件夹的选项（详见第6节）。</li>
</ol>
4. 筛选稳定转染的细胞
<ol>
	<li>优化理想的G418浓度（800 &#181;g/mL）的杀伤曲线分析法，按照制造商的说明筛选稳定转染的细胞。</li>
	<li>转染48小时或72小时后，将细胞传代并在100-mm培养皿中以5,000个细胞/皿的密度接种于MEGM培养基中。在细胞培养箱（37℃）中继续培养24小时 &#176;℃，95% 湿度和 5% CO₂2），用800 &#181;800 g/mL G418，通过将旧培养基更换为含800 g/mL G418的新培养基 &#181;每3-4天加入一次G418，浓度为g/mL，持续2周。</li>
	<li>将存活的稳定转染克隆用含500的MEGM传代培养1-3代&#181;g/mL G418以维持hPer2P/Luc2P的稳定表达，并置于液氮中冻存以备后续使用。</li>
	<li>处理 500&#181;g/mL G418，在常规传代后重新筛选稳定转染的细胞群体，如果结果中的生物发光强度 体外 经过多次传代使用后，生物发光检测信号逐渐降低。</li>
</ol>
5. 化学物质处理
<ol>
	<li>转染后48小时或72小时，在MEBM培养基中去除生长因子，对细胞进行24小时的饥饿处理。</li>
	<li>用50% HS同步处理2小时后，在含有20% SQ的MEBM培养基中，用0.25 mM或0.5 mM的亚硝基甲基脲（NMU）、20 nM EX527或1 µM cambinol处理细胞1小时。</li>
	<li>用1× D-PBS洗涤后，向细胞中加入含12.5 µM MSC的记录培养基，或联合添加20 nM EX527或1 µM cambinol。使用光度计监测生物发光信号。</li>
	<li>在用50% HS同步后，用0.5、1或2 mM的NMU、40 nM的EX527或2.0 µM的cambinol处理稳定转染的MCF10A/PER2-dLuc细胞1小时，随后将细胞培养于含12.5 µM MSC或不同浓度（5、10或20 µM）N-乙酰半胱氨酸（NAC）的记录培养基中。将培养板放入光度计，按照第3.6节所述方法连续记录并保存4至8天的生物发光数据。 
	注意：NMU是一种具有致突变性、致癌性和致畸性的甲基化亚硝基脲化合物。NMU为直接作用的烷化剂，半衰期较短（T1/2 ≈ 30分钟）。其在酸性条件（pH 4–5）下稳定，但在碱性条件（pH 9–10）及温度超过20 °C时不稳定。因此，可使用10%次氯酸钠溶液有效灭活可能被NMU溶液污染的实验台面和实验器皿。剩余的储备液应由环境健康与安全办公室（REHS）收集并安全处置。根据化学物质的作用机制，可在换为记录培养基前对同步化的细胞进行较短时间的处理；也可在记录培养基中进行较长时间（数天）的处理。</li>
</ol>
6. 数据采集、分析与展示
注意：在相同浓度和相同处理时间条件下，需采用标准方法（例如，MTT 法）测定细胞活力。体外 生物发光检测中使用的所有处理浓度均低于 30% 致死浓度（LC30）。所有实验均设三个重复，展示的是代表性结果。
<ol>
	<li>在密封培养皿（步骤 3.5）后，将培养皿装载到置于 37 ℃ 培养箱内的 luminometer 的样品座上 &#176;C 无 H2O 和 CO2，并连接至计算机。</li>
	<li>点击 &#34;保存&#34; 并输入用于保存相应培养皿记录的发光信号的文件夹和文件名。 
	注意：该系统通过4个光子计数型光电倍增管，实时检测培养皿中各个位置细胞的发光信号，并由数据采集软件将信号传输至计算机，进行保存和显示。</li>
	<li>记录4-7天后分析信号，必要时可更换培养基并继续记录第二周。 
	注意：为了获得包括相位、周期长度、节律振幅和阻尼率在内的昼夜节律参数，我们使用光度计分析软件对生物发光数据进行分析。</li>
	<li>使用移动平均法对原始数据进行去趋势处理，并通过正弦波最佳拟合分析获得周期、相位、振幅和阻尼率21,22.</li>
	<li>由于处理和换液后会出现较高的瞬时生物发光信号，分析时应排除第一个周期的数据。</li>
	<li>数据展示时，将原始数据（生物发光，计数/秒）对时间（小时或天）作图。必要时，可绘制减去基线后的数据，以比较振幅和相位。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在哺乳动物细胞中，生物钟的周期性由相互关联的转录/翻译反馈环路调控。Bmal1 与 Clock 或 Npas2 形成的异源二聚体通过结合核心时钟基因（CGs）以及众多时钟控制基因（CCGs）启动子区域的 E-box 元件来调控昼夜节律性转录，这些核心时钟基因包括 Per2 和 Cry4。随着 Per:Cry 异源二聚体在细胞内的积累，它们会经历翻译后修饰并被转运至细胞核，从而抑制 Clock:Bmal1 的转录活性。这一负反馈环路使核心时钟基因能够自我调控其转录，并建立 CGs 与 CCGs 的节律性表达模式23。尽管大多数哺乳动物细胞都具有内在的生物钟，但单个细胞中的生物钟可受到内在条件（例如，氧化还原电位）和外界环境刺激的同步调控24。体内（in vivo）的昼夜节律基因表达可由褪黑素同步，褪黑素是由松果体接收来自中枢起搏器（视交叉上核，SCN）的信号后分泌的一种激素。SCN 整合来自光照的信息，这些信息由视网膜中表达黑...

昼夜节律钟以大约24小时为周期，调控着从基因的昼夜表达到睡眠行为等多种生物学过程。流行病学研究强烈表明，轮班工作者（包括护士和机组人员）的昼夜节律长期紊乱会增加患乳腺癌和前列腺癌的风险1,2,3。啮齿类动物研究进一步证实了这一发现，暴露于持续光照、夜间光照或模拟时差的光照周期会增加肿瘤发生率并加速肿瘤生长4,5。基于人类和啮齿类动物研究的数据，国际癌症研究机构于2010年将轮班工作列为可能的人类致癌物（2A类）6。
此前，我们已证明单次致癌剂量的乳腺肿瘤特异性致癌物 N-亚硝基-N甲基脲（NMU）破坏了主要昼夜节律基因（CGs）的昼夜节律表达例如, Period 2, Per2）以及多个受昼夜节律调控的基因（CCGs），包括在靶向乳腺组织（而非肝脏）中关键的DNA损伤应答与修复（DDRR）基因。此外，重置这两种基因的昼夜节律性表达 Per2 并通过饮食化学预防方案使 DDRR 基因趋于正常 L甲基-硒代半胱氨酸（MSC）使肿瘤发生率降低了63%。这些发现首次揭示了昼夜节律、化学致癌作用与化学预防之间存在的机制性关联7,8暴露于其他已证明可干扰昼夜节律基因表达的环境毒物 体内 也与环境性疾病风险增加相关9,10. 阐明环境毒物干扰昼夜节律并导致疾病发生的机制，可能为基于机制的疾病预防策略提供依据。然而，旨在明确暴露因素与昼夜节律之间相互作用的研究通常在 体内 典型的 体内 研究昼夜节律影响的实验需要大量动物，因为在24或48小时的时间内，每隔3-4小时必须至少采集三只对照组和三只暴露组动物的组织。一种经过验证的 体外 重现的系统 体内 因此，这些观察和机制不仅能够减少所需实验动物的数量，还能显著降低实验成本以及研究人员连续工作24至48小时的需求。此外，一种经过验证的 体外 该系统可用于高通量筛选影响昼夜节律或其对环境应激源及毒物反应的化合物和/或基因改变。因此，策略性结合 体外 和 体内 需要不同的模型和实验来获得不同侧重点的深入认识。
在哺乳动物中，昼夜节律振荡器不仅存在于视交叉上核（SCN）的特化神经元中，也存在于大多数外周细胞类型中。这些分子钟与已建立的成纤维细胞系以及来自胚胎或成年动物的原代成纤维细胞中的分子钟相似；然而，仍需要建立特定组织类型的细胞模型11因此，传统的运动活动研究 体内，SCN 外植体 离体，以及基于细胞的 体外 在永生化成纤维细胞中进行的检测被广泛用于研究细胞自主性昼夜节律缺陷。然而，目前尚无证据表明这一点 体外 基于成纤维细胞的检测方法可重现其他外周器官细胞中存在的昼夜节律机制与反应 体内不同的细胞类型可能具有不同的基因表达模式、外源物质代谢能力以及DNA损伤应答与修复（DDRR）特征，毒性与昼夜节律基因表达之间的关联可能具有细胞类型特异性，和/或受到不同生理参数的调节。此外，基于成纤维细胞的系统中昼夜节律振荡器对环境毒物、应激因子及预防性干预物质的响应尚未得到充分评估，而这些因素与疾病发生和预防的机制密切相关。因此，亟需建立简便且经过验证的、具有细胞类型特异性的 体外 利用生物发光检测法研究器官特异性环境昼夜节律干扰物。尽管存在多种细胞生物钟模型（例如近年来，已开发出多种细胞系，包括肝细胞、角质形成细胞、脂肪细胞以及骨肉瘤细胞系12,13,14,15，本文所述的检测方法是首个在乳腺上皮细胞中建立的细胞钟模型，也是首次实现对该过程的重现 体内 对环境应激源、毒物、药物和化学预防剂的反应
海肾荧光素酶（rLuc）和萤火虫荧光素酶是分子量为30–61 kDa的单体蛋白，其酶活性无需翻译后加工即可发挥，翻译完成后可立即作为遗传报告基因发挥作用。当底物与荧光素酶结合后，所催化的生化反应会发出短暂的光信号。因此，荧光素酶构建体被广泛用作体外（in vitro）和体内（in vivo）的基因表达报告系统。然而，在昼夜节律研究中，由于荧光素酶蛋白的半衰期相对较长（T1/2 = 3.68 h），与昼夜基因表达变化的周期（尤其是较短周期）相比不够灵敏，限制了其作为报告基因的应用。尽管如此，多年来已有大量研究成功使用pGL3载体中的荧光素酶基因，表明对于周期较长（如24小时）的节律而言，快速降解型荧光素酶可能并非必需。因此，已开发出一种使用不稳定型荧光素酶载体pGL[Luc2P/Neo]的报告质粒，该载体包含hPEST（蛋白不稳定序列），可用于当前的体外（in vitro）生物发光检测作为昼夜节律报告载体。Luc2P编码的蛋白半衰期显著缩短（T1/2 = 0.84 h），因而对转录活性变化的响应更迅速且幅度更大，相较于野生型更能准确实时监测由PER2启动子调控的荧光素酶节律性表达16。

<table><tbody><tr><td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 载体</td><td>SwitchGear Genomics</td><td>S700000</td><td>定制载体</td></tr><tr><td>pGL4.18[Luc2P/Neo] 载体</td><td>Promega</td><td>9PIE673</td><td>不稳定型荧光素酶表达载体</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Invitrogen</td><td>15224041</td><td>用于亚克隆</td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-02</td><td>使用 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli</td></tr><tr><td>Sac I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>Hind III-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>CutSmart 缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>限制性内切酶缓冲液</td></tr><tr><td>DNA凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>LB Miller改良法</td><td>TEKNOVA</td><td>L8600</td><td>用于转化后的 E. Coli 培养物</td></tr><tr><td>LB 琼脂平板</td><td>TEKNOVA</td><td>L1902</td><td>用于白/蓝筛选</td></tr><tr><td>QIAprep 脱色微量制备试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>质粒DNA提取</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>质粒DNA提取</td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>MCF10A 细胞系</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CRL-10317</td><td>乳腺上皮细胞</td></tr><tr><td>MEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>乳腺上皮细胞生长培养基</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>乳腺上皮基础培养基</td></tr><tr><td>MEGM SingleQuot 试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>补充剂 &amp;与生长因子</td></tr><tr><td>试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>传代培养试剂</td></tr><tr><td>D-PBS（10倍浓度）</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>洗涤培养皿中的细胞</td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977</td><td>稀释10倍浓度的D-PBS</td></tr><tr><td>组织培养皿（35 mm）</td><td>BD/Falcon</td><td>353001</td><td>适用于LumiCycle的细胞培养皿</td></tr><tr><td>硅脂</td><td>Fisher</td><td>NC9044707</td><td>用于密封含有记录培养基的培养皿</td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>哈佛生物科学</td><td>64-1500 (CS-40R)</td><td>用于密封含有记录培养基的培养皿</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>生长培养基补充剂</td></tr><tr><td>G418硫酸盐（Geniticin）</td><td>Invitrogen</td><td>10131035</td><td>用于筛选稳定转染细胞的抗生素</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td>用于菌落筛选</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td>同步代理</td></tr><tr><td>褪黑素</td><td>Sigma</td><td>M5250</td><td>同步代理</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>同步代理</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td>同步代理</td></tr><tr><td>D-荧光素钠盐</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td>荧光素酶底物</td></tr><tr><td>IC261</td><td>Sigma</td><td>10658</td><td>昼夜节律干扰物的阳性对照</td></tr><tr><td>甲基亚硝基脲（NMU）</td><td>Sigma</td><td>N1517</td><td>乳腺特异性致癌物</td></tr><tr><td>甲基硒代半胱氨酸（MSC）</td><td>Sigma</td><td>M6680</td><td>有机硒（化学预防剂）</td></tr><tr><td>EX527</td><td>Sigma</td><td>E7034</td><td>SIRT1特异性抑制剂</td></tr><tr><td>Cambinol</td><td>Sigma</td><td>C0494</td><td>SIRT1 &amp;和 SIRT2 抑制剂</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NanoDrop 8000</td><td>定量核苷酸</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>应用生物系统公司</td><td>N805-0200</td><td>用于分子生物学实验</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>NAPCO</td><td>8000 系列 DH</td><td>在37℃、5% CO2条件下进行细胞培养 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>带制冷功能的台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>用于分子生物学实验</td></tr><tr><td>带摆桶转子的离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>80124</td><td>相差可选</td></tr><tr><td>组织培养罩</td><td>Labconco</td><td>II 级 A2</td><td>BSL-2 认证</td></tr><tr><td>LumiCycle 32</td><td>Actimetrics</td><td>暂无可用内容</td><td>发光检测器</td></tr></tbody></table>

体外 生物发光检测法用于表征乳腺上皮细胞中的昼夜节律

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

昼夜节律是所有生物体中存在的一种基本生理过程，可调控从基因表达到睡眠行为等多种生物学过程。在脊椎动物中，昼夜节律由分子振荡器控制，该振荡器在视交叉上核（SCN；中枢起搏器）以及构成大多数外周组织的单个细胞中均发挥作用。更重要的是，夜间光照、环境应激源和/或毒性物质引起的昼夜节律紊乱与慢性疾病风险增加及衰老密切相关。识别能够干扰中枢和/或外周生物钟的因子，以及能够预防或减轻昼夜节律紊乱影响的因子，对于预防慢性疾病具有重要意义。尽管可以使用啮齿类动物模型来鉴定诱导或预防/减轻昼夜节律紊乱的暴露因素和化合物，但这类实验需要大量动物。体内研究还需要大量资源和基础设施，并要求研究人员通宵工作。因此，迫切需要建立一种适用于不同类型器官和疾病状态下细胞类型的体外系统，用于筛选环境中的昼夜节律干扰物和增强剂。我们构建了一种载体，该载体在人PERIOD 2基因启动子的调控下驱动真核细胞中不稳定化荧光素酶的转录。将该昼夜节律报告基因构建体稳定转染入人乳腺上皮细胞，并筛选出具有昼夜节律响应性的报告细胞，以建立体外生物发光检测方法。本文提供了一套详细的方案，用于建立并验证该检测方法。此外，我们还提供了概念验证实验的具体细节，证明本体外检测方法能够重现各种化学物质对细胞生物钟的体内效应。结果表明，该检测方法可适用于多种细胞类型，用于筛选环境干扰物以及昼夜节律的化学预防性增强剂。

昼夜节律生物发光报告载体：由人 PER2 启动子驱动的不稳定型荧光素酶变体表达
用于构建昼夜节律报告载体 pGL[hPer2P/Luc2P/Neo] 的 DNA 序列包含一段来源于人类 PER2 启动子的 941 bp 片段，首先对该序列中已知调控昼夜节律基因表达的调控元件进行了分析。生物信息学分析显示，在该启动子片段内存在三个不同的 Bmal1 结合位点（E-box）（CAT/CGTG）、两个昼夜节律转录增强位点（CCAATG）、两个 GC 盒以及一个转录起始位点（图 1）。因此，预期该报告载体能够反映昼夜节律基因的表达。
同步剂的优化
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一个 体外 利用生物发光检测法测定乳腺上皮细胞中细胞昼夜节律。该方法采用哺乳动物细胞报告质粒，其在特定启动子调控下表达不稳定型荧光素酶。 PERIOD 2 基因启动子。该方法可适用于其他细胞类型，以评估器官特异性对昼夜节律的影响。

昼夜节律是一种存在于所有生物体中的基本生理过程，可调控从基因表达到……的多种生物学过程

本体外生物发光检测的总体目标是确定不同环境因素（包括昼夜节律干扰物和增强物）对正常或疾病状态下乳腺腺体来源的乳腺上皮细胞的细胞昼夜节律的影响。该方法有助于回答环境健康领域中的关键问题，例如包括化学物质在内的环境因素是否会影响细胞的昼夜节律。因此，该检测的主要优势在于其可轻松适用于多种细胞类型，从而能够筛选出影响不同器官中昼夜节律钟的环境调节因子。与我一同演示该实验步骤的是我们实验室的研究生 Brian Estrella。人源 PER2 启动子片段来自一种定制载体，该载体在多克隆位点中 SecI 与 HindIII 位点之间含有 人源 PER2P。为了从载体中切割出人源 PER2P 片段，请在无 DNA/RNA 和核苷酸污染的微量离心管中混合以下组分：2.5 微升限制性内切酶缓冲液、10 微升载体、1 微升 SacI 限制性内切酶、1 微升 HindIII 限制性内切酶，并用超纯水定容至 25 微升。在37摄氏度的加热块中孵育90分钟。限制性消化完成后，将反应体系的全部体积上样至含有0.001%溴化乙锭的0.7%琼脂糖凝胶，以分离人PER2P与载体。切下含有941个碱基对荧光条带的琼脂糖凝胶片段，从凝胶中纯化人PER2P片段，并按照文本方案中所述方法对DNA进行定量。下一步是将人源 PER2P 克隆至带有不稳定化萤光素酶的载体中。按先前方法，用 SacI 和 HindIII 限制性内切酶对 1 微克载体进行线性化消化。将整个反应体系在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳，随后如前所述纯化并定量载体 DNA。为了将人源 PER2P 连接到线性化载体中，需在微量离心管中轻轻混合以下组分：2 微升 T4 DNA 连接酶反应缓冲液、3.26 微升人源 PER2P、1 微升线性化载体，加水至总体积为 20 微升。然后加入 1 微升 T4 DNA 连接酶，轻轻混匀，并在热循环仪中于 16 摄氏度孵育过夜。次日，将连接产物置于冰上冷却。转化前，将水浴锅预热至42摄氏度，室温下预热SOC培养基，并将LB琼脂平板放入37摄氏度培养箱中预热。在冰上解冻两管感受态E.coli细胞。开始转化时，向一管化学感受态E.coli细胞中加入6 µL连接好的载体，轻轻翻转混匀。作为阴性对照，向另一管感受态大肠杆菌中加入一微升空载体，将各管置于冰上孵育30分钟。30分钟后，在42摄氏度水浴中热激30秒，期间不摇动，然后将各管放回冰上。向每管中加入250微升SOC培养基，于37摄氏度、200 rpm摇床中孵育1小时。接下来，将每种转化后的 E.coli 反应液 10 至 50 微升均匀涂布于 LB 琼脂平板表面。将平板倒置于 37 摄氏度培养箱中过夜培养。次日，使用灭菌的接种环从每个平板上挑取 3 至 6 个白色菌落，并将每个菌落分别接种于含有 4 毫升 LB 培养基和 50 微克/毫升氨苄青霉素的培养管

in-vitro-bioluminescence-assay-to-characterize-circadian-rhythm

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

体外生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征

表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞被皮下植入小鼠体内，并通过光学成像进行可视化，以在纵向研究中无创地监测肿瘤的生长和发育。...

体内 乳腺肿瘤的生物发光成像：使用 IVIS Spectrum

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

表达细菌生物发光基因盒（lux）的哺乳动物细胞能够自主发光。化学物质处理后所产生的生物发光动态变化已被证明可反映处理对细胞生长和代谢的影响，因此这类细胞可作为一种低成本、连续、实时的毒性筛选工具，并可轻松适用于高通量自动化检测。...

自主生物发光的哺乳动物细胞用于细胞毒性的连续与实时监测

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

基因编码的荧光素酶是一种常用的非侵入性基因表达报告分子。利用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR），可在多种条件下对生物发光细胞进行长期连续记录。本文展示了ALLIGATOR在昼夜节律研究中的应用方法。...

使用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR）灵活检测生物发光报告基因

这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。...

体内 利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

本方案提供了用于评估人乳腺细胞转化的体外实验工具。文中详细描述了检测细胞增殖速率、非贴壁依赖性生长能力，以及在含有基底膜基质的三维培养中细胞谱系分布的实验步骤。...

人乳腺上皮细胞中癌基因转化的体外评估

本文介绍了一种非侵入性监测方法，该方法涉及在多种乳腺癌细胞系中表达荧光素酶和绿色荧光蛋白。本方案提供了一种在小鼠体内实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。...

利用生物发光技术监测小鼠体内乳腺癌生长及转移灶形成

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。...

活体乳腺组织亚细胞显微成像

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

了解体外生物发光检测法在乳腺上皮细胞中表征昼夜节律的技术。该方法利用PER2基因启动子控制的荧光素酶报告系统，可评估环境因子对细胞生物钟的影响，适用于多种细胞类型。

体外生物发光检测法用于表征乳腺上皮细胞中的昼夜节律

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体外 生物发光检测法用于表征乳腺上皮细胞中的昼夜节律

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