体外生物荧光法对乳腺上皮细胞昼夜节律的表征
September 28th, 2017
一个体外生物荧光法测定乳腺上皮细胞的细胞昼夜节律。该方法利用哺乳动物细胞报告质粒表达不稳定的荧光在周期 2基因启动子的控制下。它可以适应其他细胞类型, 以评估器官特定的影响昼夜节律。
这种体外生物发光测定的总体目标是确定不同环境昼夜节律干扰物和增强剂对正常或疾病状态下乳腺上皮细胞细胞昼夜节律的影响。这种方法可以帮助回答环境健康领域的关键问题，例如包括化合物在内的环境因素是否会影响细胞昼夜节律。因此，该测定的主要优点是它可以很容易地适应多种细胞类型，因此我们可以筛选不同器官中生物钟的环境调节剂。
与我一起演示该程序的是 Brian Estrella，我们实验室的研究生。人 PER2 启动子片段是从定制载体中获得的，该载体在多克隆区域中 SecI 和 HindIII 之间的位点包含人 PER2P。要从载体中切下人 PER2P 片段，将以下物质混合在无 DNA/RNA 和核苷酸的微量离心管中，加入 2.5 μL 限制性内切酶缓冲液、10 μL 载体、1 μL SacI 限制性内切酶、1 μL HindIII 限制性内切酶和超纯水至 25 μL。
在 37 摄氏度的加热块中孵育 90 分钟。限制性酶切完成后，在含有 0001% 溴化乙锭的 0.7% 琼脂糖凝胶上运行整个反应体积，以将人 PER2P 与载体分离。切下一段含有 941 个碱基对荧光条带的琼脂糖凝胶，从凝胶中纯化人 PER2P 片段，并按照文本方案中的说明定量 DNA。
下一步是将人 PER2P 克隆到具有不稳定火流荧光素酶的载体中。如前所述，通过用 SacI 和 HindIII 限制性消化线性化一微克载体。在含有溴化乙锭的凝胶上运行整个反应体积，然后像以前一样纯化和定量载体 DNA。
要将人 PER2P 连接到线性化载体中，请在微量离心管中轻轻混合以下物质、2 μL T4 DNA 连接酶反应缓冲液、3.26 μL 人 PER2P、1 μL 线性化载体和 20 μL 水。然后加入 1 微升 T4 DNA 连接酶，轻轻混匀，并在 16 摄氏度下在热循环仪中孵育过夜。第二天，将连接的载体放在冰上冷却。
转化前，将水浴置于 42 摄氏度，在室温下加热 SOC 培养基，并在 37 摄氏度培养箱中加热 LB 琼脂平板。在冰上解冻两瓶感受态大肠杆菌细胞。要开始转化，将 6 μL 连接载体添加到一管化学感受态大肠杆菌中，然后轻轻翻转试管以混合。
作为阴性对照，将 1 μL 空载体加入另一管化学感受态大肠杆菌中，并在冰上孵育 30 分钟。30 分钟后，在 42 摄氏度的水浴中热休克 30 秒，不要摇晃，然后将试管放回冰块。向每管中加入 250 μL SOC 培养基，并在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育 1 小时。
接下来，将 10 至 50 微升转化的大肠杆菌反应物均匀分布在 LB 琼脂平板表面。将板倒置在 37 摄氏度的培养箱中过夜。第二天，使用灭菌的接种环从每个板中挑选 3 到 6 个白色菌落，并将每个菌落释放到含有 4 毫升 LB 培养基和每毫升 50 微克氨苄青霉素的培养管中。
将试管在 37 摄氏度下孵育，并以 200 rpm 振荡过夜。使用每 4 毫升培养的大肠杆菌中的 2 毫升进行 DNA 提取。按照文本方案中的说明验证插入片段后，通过将剩余的 2 毫升培养的大肠杆菌加入 200 毫升含有每毫升氨苄青霉素 50 微克的 LB 培养基中，并在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育过夜，扩增选定的大肠杆菌。
然后根据制造商的说明，使用无内毒素的质粒大提试剂盒提取血浆 DNA。定量血浆 DNA 后，分装并储存在零下 80 摄氏度以备将来使用。用构建昼夜节律载体转染的乳腺上皮细胞与含有乳腺上皮基础培养基、生长补充剂和霍乱毒素的乳腺上皮细胞生长培养基一起培养。
要解离细胞，请与 10 mL 胰蛋白酶-EDTA 孵育约 20 分钟，然后加入 10 mL 胰蛋白酶中和溶液中和胰蛋白酶。将细胞转移到 50 mL离心管中。用 10 毫升缓冲盐水溶液冲洗培养皿，然后将冲洗液加入 50 毫升试管中。
以 1， 500 rpm 的速度离心细胞 10 分钟。去除上清液并加入 3 毫升 MEGM 以重悬细胞。在倒置显微镜下用血细胞计数器计数细胞。
计算单细胞悬液的浓度后，用 MEGM 每 35 毫米培养皿均匀接种 2 次 10 至 5 个细胞。彻底旋转板，以获得每个板中细胞的均匀分布。在细胞培养箱中将细胞生长至 20% 至 30% 汇合。
第二天，在 37 °C 水浴中预热还原血清培养基，并在室温下预热转染试剂 30 分钟。将血浆 DNA 加热至室温。用不含内毒素的 Tris-EDTA 缓冲液将血浆 DNA 稀释至 30 ng/μL，并保持在室温下。
在 1.5 mL 微量离心管中制备每种质粒转染混合物。首先，加入 63.6 μL 温热的还原血清培养基。然后，加入 33.4% 微升血浆 DNA，并通过移液轻轻混合。
最后，将 3 μL 转染试剂直接加入试管中心，不要接触管壁。通过移液轻轻混匀，并在室温下保持 30 分钟。将整个血浆转染混合物直接滴到板中培养基的中心表面，然后摇动培养皿轻轻混匀。
在二氧化碳培养箱中将细胞再培养 48 至 72 小时。转染后 48 至 72 小时，当培养的细胞达到约 70% 的汇合度时，用不含生长因子的 MEBM 替换培养基，并再培养细胞 24 小时。饥饿 24 小时后，在 MEBM 中将同步代理添加到单元中。
本实验使用 50% 马血清作为同步剂。在二氧化碳培养箱中孵育 1-1/2 小时。准备记录介质。
用同步剂处理完成后，用温热的 D-PBS 洗涤细胞 3 次。然后加入 2 毫升新鲜制备的含有荧光素的记录培养基。使用硅脂用消毒的盖玻片密封培养皿，以防止蒸发。
在侧面标记盘子。将密封的培养皿放在光度计内的座位上，并按照文本协议中的说明进行数据收集和分析。在该体外模型中，未处理的瞬时转染细胞在同步后至少显示出两个完整的发光信号循环。
暴露于诱变剂 NMU 的细胞在 0.5 毫摩尔浓度时表现出昼夜节律中断，这反映在同步后发光信号的丢失上。用 X257 或 Cambinol 抑制 Cert1 活性同样通过抑制随后的昼夜节律来破坏昼夜节律。重要的是，在培养基中添加化学预防 MSC 可恢复被 0.5 毫摩尔 NMU 破坏的节律，并防止 Cert1 抑制剂的破坏性作用。
在稳定转染的细胞中，NMU 和 Cert1 抑制剂均破坏了昼夜节律。MSC 恢复了用 NMU 、 X275 或 Cambinol 预处理的细胞的昼夜节律。与稳定转染细胞相比，瞬时转染细胞的生物发光强度较高，但节律维持时间较短，但总体结果一致。
使用 LumiCycle 分析软件，可以用昼夜节律参数（如周期和相位）来量化细胞昼夜节律。一旦掌握，这种技术就简单、快速且安全。在尝试此程序时，跟踪细胞是否增殖非常重要，因为非分裂细胞（如神经元细胞）的转染效率非常低，在这种情况下，可以考虑病毒间隔转染方法。
转染后，可以执行其他方法，例如使用不同的化学物质处理或基因改造，以回答其他问题，例如细胞昼夜节律如何受环境和遗传因素的影响。该测定可用于研究昼夜节律紊乱对细胞功能的影响。通过研究潜在机制，我们可以为那些因工作时间表异常而患乳腺癌风险增加的人制定更好的干预策略。
观看此视频后，您应该对如何建立和验证体外生物发光检测以确定目标细胞的昼夜节律有很好的了解。不要忘记，使用紫外线照明器可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用紫外线防护面罩。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种体外生物荧光分析法，旨在评估乳腺上皮细胞的细胞昼夜节律。该方法利用哺乳动物细胞报告质粒，这些质粒表达由PERIOD 2基因启动子控制的不稳定的荧光素酶，从而可以适用于各种细胞类型。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 昼夜节律
- 环境健康
背景
- 昼夜节律对各种细胞功能至关重要。
- 环境因素可能会破坏这些节律。
- 了解这些影响可以为健康相关研究提供信息。
- PER2基因是昼夜时钟的关键组成部分。
研究目的
- 评估环境昼夜节律破坏物和增强物的影响。
- 评估乳腺上皮细胞的细胞昼夜节律。
- 探索该分析法对不同细胞类型的适应性。
使用的方法
- 体外生物荧光分析法开发。
- 使用哺乳动物细胞报告质粒。
- 应用人类PER2启动子片段。
- 用于质粒制备的限制性酶切。
主要结果
- 该分析法可以有效测量乳腺上皮细胞的昼夜节律。
- 它可以适用于其他各种细胞类型。
- 环境因素可以显著影响细胞的昼夜节律。
- 该方法提供了对特定器官对昼夜生物学影响的见解。
结论
- 该分析法是研究昼夜节律的有价值工具。
- 它可以帮助识别昼夜时钟的环境调节因子。
- 未来的研究可以扩大其应用到其他器官系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
This in vitro bioluminescence assay addresses the need for scalable, cell-based screening tools to evaluate environmental circadian disruptors and enhancers in mammary epithelial cells. By enabling mechanistic de-risking of circadian pathway modulation, the assay supports target validation and predictive confidence in early discovery. Its adaptability across cell types facilitates translational continuity from discovery through preclinical assessment of chronobiological risk factors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying circadian rhythm modulation in response to chemical exposures.
- Operational Value: Enables functional target validation of core clock components like PER2 through luciferase reporter readouts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt or enhance cellular circadian clocks with dose-dependent luminescence changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated circadian reporter cells for high-throughput screening of environmental modulators.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative bioluminescence outputs enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Supports platform reuse in diverse cell types to assess organ-specific circadian responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling circadian disruption in normal and diseased mammary epithelial states.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical workflows through synchronized luminescence recording and LumiCycle analysis.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by revealing chemopreventive effects (e.g., MSC rescue of NMU-disrupted rhythms).
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into early discovery workflows to support hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of circadian targets prior to lead identification.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of circadian pathway regulation via PER2-driven luciferase expression.
- Screening: Provides assay-ready, stable reporter cells with quantifiable luminescence rhythms for compound screening.
- Analytics: Generates period and phase parameters via LumiCycle software to compare circadian responses across conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by modeling circadian disruption relevant to shift work and breast cancer risk.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening circadian modulators across multiple epithelial cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in circadian pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through synchronized cell preparation and luminescence recording protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying circadian liabilities early, reducing late-stage biological risk in drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on circadian disruption or enhancement potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and luciferase-based reporter assays.
- Dependent on luminometer access, silicone grease for sealing, and LumiCycle analysis software for rhythm quantification.
- Necessitates cross-team standardization of synchronization agents (e.g., 50% horse serum) and recording medium preparation.
- Involves adaptation considerations for transfection efficiency in nondividing or primary cell types.
- Limited by plasmid construct stability and potential variability in circadian amplitude between transient and stable transfection models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Concstruction of PER2 Promoter Driven Destabilized Luciferase Reporter Vector
10:16
Conclusion
8:52
Results: Effects of Chemicls on the Cellular Biological Clock
3:06
Transforming Ligated Vector pGL[hPer2P/Luc2P/Neo] to E. coli
5:28
Transient Transfection of Cells with the Circadian Vector
7:46
Establishment of the In Vitro Bioluminescence Assay in Transiently Transfected MCF10A Cells
