Name: 一种优化的血凝抑制 (HI) 测定流感特异抗体滴 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学习血凝抑制测定法检测流感特异性抗体滴度，该方法使用96孔微量滴定板进行血清样本分析。此技术可准确量化中和抗体，为疫苗免疫效果评估提供可靠数据支持。

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A.E. 获得了“SNSF Ambizione Score”项目（PZ00P3_154709）、巴塞尔大学“Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte”、巴塞尔传染病基金会以及Bangeter Rhyner基金会的资助。L.K. 获得了奥地利格拉茨技术大学资助项目的资助。J.L. 感谢SystemsX.ch系统生物学项目（9）提供的iPhD奖学金支持。th 呼叫

定量检测接种疫苗前后流感病毒特异性抗体滴度是疫苗研究中必不可少的重要工具。根据血清保护（&#62;1:40）或血清转化（抗体滴度升高4倍）等替代指标来评估对病毒感染的保护效果，可优化疫苗接种策略9。采用所提供的实验方案可以测定：（i）特定病毒的血凝活性，以及（ii）目标病毒的抗体滴度。
修改与故障排除：
本方案基于世界卫生组织标准12我们通过使用PCR管条进行血清制备对方案进行了修改（见步骤5）。该改进显著减轻了工作量，并提高了检测通量。此外，在抗原滴定步骤中，我们将抗原用量减少了四分之一，长期来看具有成本效益。在RDE处理中可使用更少的血清量（10 µL），这在样本量有限时尤为有利例如，小鼠血清）。抗体检测板中包含反向滴定和阳性对照，作为适当的内部对照，并用于监测红细胞的老化情况。
此外，我们采用了与世界卫生组织（WHO）标...

流感病毒感染与较高的发病率、死亡率以及高昂的医疗费用密切相关1,2,3,4尤其是老年人、新生儿、孕妇以及慢性病患者，面临更严重临床后果的风险。因此，针对流行流感病毒株接种疫苗是降低这些高危人群疾病负担的主要措施。接种疫苗后个体免疫反应的增强， 例如，高于保护性阈值的流感特异性抗体可降低个体感染风险，并普遍降低病毒在人群中的传播可能性5在不同人群及各个年龄组中，深入理解疫苗诱导的体液免疫应答是回答重要临床问题的关键环节。6,7,8,9，例如：为何一些老年患者在既往接种疫苗后仍会发生感染？什么是 &#34;良好&#34; 和 &#34;充足&#34; 疫苗诱导的保护效果如何？对于免疫功能低下患者，应以何种频率接种疫苗才能达到保护性抗体滴度？最有效的剂量是多少？新型佐剂对疫苗接种后抗体滴度有何影响？检测疫苗特异性抗体的产生情况有助于回答这些关键问题，并改善疫苗接种效果。
病毒特异性抗体滴度的定量可通过多种免疫学方法进行，包括固相10 或基于微珠的ELISA11 检测，血凝抑制试验12和中和实验13基于ELISA的方法可用于对大量血清样本进行多种抗原的筛查，并可分别检测病原体特异性的免疫球蛋白（Ig）M和IgG。尽管抗原的特性 例如线性氨基酸序列或病毒样颗粒可能影响抗体的结合，潜在表位的范围非常广泛，且无法提供抗体反应是否具有功能相关性的信息。
相比之下，中和试验用于确定抗体在功能上抑制细胞感染的能力，因此可反映其潜在的中和活性。然而，该方法劳动强度大，需要培养特定的细胞系和活病毒，因此耗时较长、成本较高，且需要特殊设备。
本文介绍了一种基于世界卫生组织（WHO）的血凝抑制（HI）实验方案12，用于定量检测流感特异性抗体滴度。血凝是某些病毒的特征性效应，可导致红细胞发生凝集。利用患者血清抑制该效应，可测定具有抑制能力的抗体浓度，从而反映其中和作用。
我们已对世界卫生组织（WHO）方案的工作流程进行了改进，以便更高效地同时处理多个样本，从而缩短所需时间。第一个方案描述了特定流感抗原凝集能力的测定方法。通过该步骤，可确定第二个方案所需的正确流感抗原浓度。每次使用新的病毒抗原或每批血液时，均应重复此部分操作。
第二个方案描述了流感特异性抗体滴度的测定。所展示的方案已针对流感病毒和人血清样本的检测进行了优化，但也可适用于小鼠血清样本或经刺激的免疫细胞的细胞培养上清液。 例如，病毒特异性B细胞。结果可表示为绝对测定滴度。在许多疫苗研究中，通常会展示每个特定人群的几何平均滴度及其95%置信区间。在结果解读中，常使用血清保护或血清转化来描述人群对某种病毒的易感性。血清保护定义为滴度≥1:40，血清转化则定义为两次时间点之间（最常见的是接种前与接种后30天）滴度升高超过4倍，并达到血清保护水平的滴度。
两种方案均易于使用，且可针对广泛的研究问题进行调整。特别是，它们可用于可靠且快速地确定&#160;针对具有血凝能力的多种其他病毒（如麻疹病毒、多瘤病毒、腮腺炎病毒或风疹病毒）的抗体滴度14,15,16.

<table><tbody><tr><td>25 ml 一次性多通道移液器储液槽</td><td>Integra</td><td>4312</td><td></td></tr><tr><td>8孔PCR管</td><td>Brand GMBH</td><td>781332</td><td>用于血清分装</td></tr><tr><td>96孔U型微孔板</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>使用哺乳动物红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用</td></tr><tr><td>96孔V型微孔板</td><td>Corning Costar</td><td>3897</td><td>使用禽类红细胞进行血凝抑制（HI）试验时使用</td></tr><tr><td>注射用水（Aqua ad iniect. Steril）</td><td>Bichsel AG</td><td>1000004</td><td>用于配制流感抗原和霍乱滤液溶液</td></tr><tr><td>鸡红细胞（10%）</td><td>Cedarlane</td><td>CLC8800</td><td>在Alsever's溶液中配制的10%鸡红细胞悬液</td></tr><tr><td>霍乱滤液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8772</td><td>用作受体破坏酶（RDE）</td></tr><tr><td>Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>用于稀释血清样本、红细胞和抗原</td></tr><tr><td>Eppendorf多通道移液器，12通道，10–100 &amp;micro;l</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683949</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf多通道移液器，8通道，10–100 &amp;micro;l</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683930</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠红细胞（10%）</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1800</td><td>在Alsever's溶液中配制的10%豚鼠红细胞悬液</td></tr><tr><td>流感抗A/California/7/09 HA血清&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/134&amp;nbsp;</td><td>用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照</td></tr><tr><td>流感抗A/Switzerland/9715293/2013样HA血清&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/272</td><td>用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照</td></tr><tr><td>流感抗A/Texas/50/2012样HA血清&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/178</td><td>用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照</td></tr><tr><td>流感抗B/Brisbane/60/2008-HA血清&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/254&amp;nbsp;</td><td>用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照</td></tr><tr><td>流感抗B/Massachusetts/02/2012 HA血清&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/182</td><td>用作血凝抑制（HI）试验的阳性对照</td></tr><tr><td>流感抗原A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&amp;nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>12/168</td><td>灭活的、部分纯化的A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&amp;nbsp;病毒（约46&amp;micro;gHA/ml）</td></tr><tr><td>流感抗原A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88)</td><td>NIBSC</td><td>14/254</td><td>灭活的、部分纯化的A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88)病毒（约55&amp;micro;gHA/ml）</td></tr><tr><td>流感抗原A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)</td><td>NIBSC</td><td>13/112</td><td>灭活的、部分纯化的A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)病毒（约74&amp;micro;gHA/ml）</td></tr><tr><td>流感抗原B/Brisbane/60/2008</td><td>NIBSC</td><td>13/234</td><td>灭活的、部分纯化的B/Brisbane/60/2008病毒（约42&amp;micro;gHA/ml）</td></tr><tr><td>流感抗原B/Massachusetts/02/2012</td><td>NIBSC</td><td>13/134</td><td>灭活的、部分纯化的B/Massachusetts/02/2012病毒（约35&amp;micro;gHA/ml）</td></tr><tr><td>血清管</td><td>S-Monovette, Sardstedt</td><td>01.1601.100</td><td>用于含凝血激活剂的血清提取</td></tr><tr><td>单个供体人红细胞，O型</td><td>Innovative Research</td><td>IPLA-WB3&amp;nbsp;</td><td>在Alsever's溶液中配制的单个供体人红细胞悬液（约26%）</td></tr><tr><td>火鸡红细胞（10%）</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1180</td><td>在Alsever's溶液中配制的10%火鸡红细胞悬液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种优化的血凝抑制（hi）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

抗体滴度通常被用作评估针对流感及其他病原体血清学保护效果的替代指标。要理解疫苗诱导的免疫反应，必须详细了解接种疫苗前后抗体的产生情况。本文介绍了一种可靠的逐点操作方案，用于测定流感特异性抗体滴度。第一个方案描述了确定血凝反应所需抗原量的方法，从而为后续第二个方案（血凝试验，HA试验）中的抗原浓度提供标准化依据。第二个方案描述了通过系列稀释人血清或细胞培养上清液，定量检测针对不同病毒株的流感特异性抗体滴度的方法（血凝抑制试验，HI试验）。
作为一个应用实例，我们展示了健康人群在接受三价灭活流感疫苗后产生的抗体反应。此外，还展示了不同流感病毒之间的交叉反应性，并解释了通过使用不同种类动物的红细胞（RBCs）来减少交叉反应性的方法。讨论部分重点分析了所介绍检测方法的优缺点，以及流感特异性抗体滴度的测定如何有助于加深对疫苗相关免疫的理解。

流感疫苗接种前后针对甲型流感 H3N2 的抗体反应 
在2014/2015流感季节之前，对26名健康志愿者接种含甲型流感A/H1N1/California/2009、A/H3N2/Texas/2012和B/Massachusetts/02/2012的灭活三价亚单位流感疫苗后诱导的抗体反应进行了评估。图6展示了其中2名疫苗接种者的代表性结果。值得注意的是，在该特定流感季节，A/H3N2/Texas/2012并未流行，取而代之的是略有不同的病毒株A/H3N2/Switzerland/2013。A/H3N2/Texas/2012与A/H3N2/Switzerland/2013的病毒血凝素氨基酸序列具有97%的一致性，仅在11个氨基酸位点上存在差异（见表4），这些位点在图7中已标出。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。

一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

抗体滴度通常被用作流感及其他病原体血清学保护的替代标志物。对抗体的详细认知……

本血凝抑制试验的总体目标是测定针对特定目标病毒的抗体滴度。该方法有助于回答疫苗学领域中关于不同人群以及不同年龄和患者群体中疫苗介导的免疫与保护作用的关键问题。该技术的主要优势在于其准确性高，并可快速确定中和抗体的存在及其滴度。尽管该方法可用于研究人源抗体滴度，也可应用于其他体系，例如小鼠血清抗体滴度，以及培养上清液。首先，用相应的实验信息标记96孔微孔板。然后将板子竖直放置，使用多通道移液器向每个孔中加入25 µL PBS，但底部反向滴定行的第一孔除外。向回滴定行的第一孔中加入 50 微升新鲜配制的相应抗原溶液，然后向前十行的第一孔中各加入 25 微升经 RDE 处理的血清样本。向第 11 行的第一孔中加入 25 微升相应的抗血清作为阳性对照。随后，将每行第一孔中的 25 微升液体转移至下一孔，进行连续的两倍稀释。每个稀释步骤上下吹打10至15次，从最后一列孔中弃去最后25微升。接着，向第1至第11行的每孔中加入25微升抗原溶液，向回滴定行的每孔中仅加入25微升PBS。轻轻敲击酶标板四侧，每侧10次，以充分混匀。然后在室温下盖上盖子孵育30分钟。孵育结束后，向每孔加入50 µL红细胞溶液，并通过轻轻敲击混匀。再次盖上盖子，根据下表中所述的物种要求孵育红细胞。将红细胞加入板孔后，需根据检测中所用血液类型遵循相应的孵育时间。孵育时间过短或过长均会导致结果解读错误。孵育结束后，将板倾斜90度，持续25秒，观察血凝现象，并在板仍处于倾斜状态时，根据96孔板的打印示意图记录每个孔的结果。在本实验中，评估了26名健康志愿者接种灭活三价流感疫苗后的抗体反应，这些志愿者在2015年流感季节前接种了含有甲型H1N1/加利福尼亚/2009、甲型H3N2/得克萨斯/2012和乙型B/马萨诸塞/02/2012的流感疫苗。观察到针对甲型H3N2/瑞士/2013和甲型H3N2/得克萨斯/2012病毒株的交叉反应性免疫应答，其中针对甲型H3N2/瑞士/2013的血凝素抑制几何平均滴度显著较低，且诱导的血清保护率低于针对甲型H3N2/得克萨斯/2012的水平。接种疫苗后，针对这两种病毒株的抗体滴度均有所升高，尽管甲型H3N2/瑞士/2013毒株并未包含在疫苗中。病毒血凝素表现出依赖于物种的红细胞凝集潜能。值得注意的是，豚鼠血液与乙型流感病毒不能发生适当的血凝反应，而火鸡血液则具有与高滴度病毒发生血凝反应的潜力，且交叉反应性较低。若操作熟练，该技术可在正确实施的情况下于三小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记得使用经RDE处理的血清，以灭活病毒血凝过程中可能存在的非特异性抑制物和非特异性结合。完成该步骤后，可进一步采用ELISA等其他方法，以探究病原体特异性免疫球蛋白在免疫应答中的具体作用。该技术建立后，为病毒免疫学领域的研究人员提供了有力工具，有助于深入理解不同年龄组健康个体及免疫抑制患者中与疫苗相关的免疫应答机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何大规模开展血凝抑制试验，以定量检测流感病毒株特异性抗体滴度。请注意，操作病毒抗原、动物血液及人血清样本具有极高危险性，进行本实验时必须采取相应防护措施，例如在生物安全二级（BSL2）实验室中操作。

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一种优化的血凝抑制 (HI) 测定流感特异抗体滴

本研究建立了一种简单的槽点印迹法，利用针对流感病毒血凝素和神经氨酸酶最保守序列的通用抗体，对其进行定量分析，这些保守序列通过生物信息学分析确定。该创新方法可能为所有病毒血凝素和神经氨酸酶的定量测定提供一种有用的替代方案。...

使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

该视频演示了用于检测血清中针对特定抗原的抗体的血凝抑制试验。通过不同的视觉模式，可确认检测孔中出现血凝抑制现象，而对照孔中出现血凝现象。该试验在病毒学和免疫学领域中对于评估免疫反应、疫苗有效性以及研究病毒感染具有重要作用。...

检测血清中针对目标抗原抗体的血凝抑制试验

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过...

生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

本视频展示了一种用于测定血清样本中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制性抗体滴度的检测方法。将含有抗NA抗体的血清样本加入包被有胎球蛋白（fetuin）的微孔板中。加入病毒后，抗体可阻止病毒NA切割胎球蛋白并暴露其半乳糖基团。随后加入辣根过氧化物酶标记的凝集素，该凝集素可结合暴露的半乳糖。通过比色法测定NA抑制性抗体滴度，即固定化的凝集素偶联过氧化物酶催化过氧化物酶底物产生显色反应。...

一种用于测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度的检测方法

我们描述了一种用于测定血清中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制抗体滴度的酶联凝集素检测法（ELLA）。该检测方法利用花生凝集素来定量当神经氨酸酶从包被有胎球蛋白的96孔板上去除唾液酸后暴露出的半乳糖残基。...

通过酶联凝集素法测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度

定量微量中和试验的优化

我们描述了一种方法，用于鉴定人源或鼠源单克隆抗体结合甲型流感病毒血凝素所必需的关键残基。该方案可适用于其他病毒表面糖蛋白及其相应的中和抗体。...

中和流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的生成

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。...

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a...

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。...

新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

学习血凝抑制测定法检测流感特异性抗体滴度，该方法使用96孔微量滴定板进行血清样本分析。此技术可准确量化中和抗体，为疫苗免疫效果评估提供可靠数据支持。

一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

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