一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

本血凝抑制试验的总体目标是测定针对特定目标病毒的抗体滴度。该方法有助于回答疫苗学领域中关于不同人群以及不同年龄和患者群体中疫苗介导的免疫与保护作用的关键问题。该技术的主要优势在于其准确性高，并可快速确定中和抗体的存在及其滴度。

尽管该方法可用于研究人源抗体滴度，也可应用于其他体系，例如小鼠血清抗体滴度，以及培养上清液。首先，用相应的实验信息标记96孔微孔板。然后将板子竖直放置，使用多通道移液器向每个孔中加入25 µL PBS，但底部反向滴定行的第一孔除外。

向回滴定行的第一孔中加入 50 微升新鲜配制的相应抗原溶液，然后向前十行的第一孔中各加入 25 微升经 RDE 处理的血清样本。向第 11 行的第一孔中加入 25 微升相应的抗血清作为阳性对照。随后，将每行第一孔中的 25 微升液体转移至下一孔，进行连续的两倍稀释。

每个稀释步骤上下吹打10至15次，从最后一列孔中弃去最后25微升。接着，向第1至第11行的每孔中加入25微升抗原溶液，向回滴定行的每孔中仅加入25微升PBS。轻轻敲击酶标板四侧，每侧10次，以充分混匀。

然后在室温下盖上盖子孵育30分钟。孵育结束后，向每孔加入50 µL红细胞溶液，并通过轻轻敲击混匀。再次盖上盖子，根据下表中所述的物种要求孵育红细胞。

将红细胞加入板孔后，需根据检测中所用血液类型遵循相应的孵育时间。孵育时间过短或过长均会导致结果解读错误。孵育结束后，将板倾斜90度，持续25秒，观察血凝现象，并在板仍处于倾斜状态时，根据96孔板的打印示意图记录每个孔的结果。

在本实验中，评估了26名健康志愿者接种灭活三价流感疫苗后的抗体反应，这些志愿者在2015年流感季节前接种了含有甲型H1N1/加利福尼亚/2009、甲型H3N2/得克萨斯/2012和乙型B/马萨诸塞/02/2012的流感疫苗。观察到针对甲型H3N2/瑞士/2013和甲型H3N2/得克萨斯/2012病毒株的交叉反应性免疫应答，其中针对甲型H3N2/瑞士/2013的血凝素抑制几何平均滴度显著较低，且诱导的血清保护率低于针对甲型H3N2/得克萨斯/2012的水平。接种疫苗后，针对这两种病毒株的抗体滴度均有所升高，尽管甲型H3N2/瑞士/2013毒株并未包含在疫苗中。

病毒血凝素表现出依赖于物种的红细胞凝集潜能。值得注意的是，豚鼠血液与乙型流感病毒不能发生适当的血凝反应，而火鸡血液则具有与高滴度病毒发生血凝反应的潜力，且交叉反应性较低。若操作熟练，该技术可在正确实施的情况下于三小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要记得使用经RDE处理的血清，以灭活病毒血凝过程中可能存在的非特异性抑制物和非特异性结合。完成该步骤后，可进一步采用ELISA等其他方法，以探究病原体特异性免疫球蛋白在免疫应答中的具体作用。该技术建立后，为病毒免疫学领域的研究人员提供了有力工具，有助于深入理解不同年龄组健康个体及免疫抑制患者中与疫苗相关的免疫应答机制。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何大规模开展血凝抑制试验，以定量检测流感病毒株特异性抗体滴度。请注意，操作病毒抗原、动物血液及人血清样本具有极高危险性，进行本实验时必须采取相应防护措施，例如在生物安全二级（BSL2）实验室中操作。