Name: 与ChEC-seq的蛋白质-DNA相互作用的全基因组映射酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习ChEC-seq技术，利用微球菌核酸酶融合蛋白在酿酒酵母中进行全基因组蛋白质-DNA相互作用的高分辨率定位。该方法无需甲醛交联，背景噪音极低，适用于转录调控研究。

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感谢Moustafa Saleh和Jay Tourigny对本文稿的审阅，感谢Steven Hahn和Steven Henikoff在ChEC-seq技术开发及其应用于Mediator复合物研究过程中提供的指导与支持。S.G.的研究得到美国国立卫生研究院基金R01GM053451和R01GM075114的资助，G.E.Z.的研究得到印第安纳大学启动资金的支持。

1. 酵母菌株的构建
<ol>
	<li>构建一种酵母菌株，使其所含的目的因子带有MNase标签。
	<ol>
		<li>从目标载体中PCR扩增MNase标签盒（表1) 使用指定的反应混合物（表2）以及循环条件（表3)。取5 µL PCR反应产物与1 µL 6X DNA上样缓冲液混合，将每份PCR样品在0.8%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。预期扩增产物大小约为2.3 kb。</li>
		<li>使用标准的醋酸锂转化法将扩增的标签盒转入目标菌株22 并进行筛选。</li>
		<li>通过菌落PCR验证标签盒的正确整合。
		<ol>
			<li>配制指定的反应混合物（表4用于筛选的菌落数量。使用前保持在冰上。</li>
			<li>使用无菌牙签或移液器吸头，从每个菌落中挑取一部分接种至PCR管底部。</li>
			<li>将挑取的菌落置于高火微波加热1分钟。</li>
			<li>加入50 µL PCR混合液（表4将适量溶液加入每个微波处理后的菌落中，用移液器吹打混匀。按照指定的循环条件进行PCR反应。表5).</li>
			<li>将50 µL PCR反应产物与10 µL 6X DNA上样缓冲液直接在每个PCR管中混合。取10 µL每种样品在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。预期扩增产物大小约为700 bp。 
			注意：如有需要，可通过蛋白质印迹法验证MNase融合蛋白的适当表达。预期标签蛋白的分子量将发生约20.6千道尔顿的偏移。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过同源克隆将目标基因的启动子插入 pGZ136 载体（表 1），并按照步骤 1.1.2 进行转化与筛选，从而构建一个游离型 MNase 菌株。
	<ol>
		<li>或者，将目的基因的启动子与3xFLAG-MNase-SV40 NLS连接至质粒载体中，按步骤1.1.2进行转化与筛选，并在适当的筛选条件下培养菌株以维持质粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ChEC
<ol>
	<li>在进行ChEC实验的前一天下午或晚上，用携带MNase标签因子的菌株单菌落接种3 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基或适当的筛选培养基。将该培养物在30 °C、180 RPM振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>在进行ChEC实验当天的早晨，将过夜培养物按OD600为0.2–0.3的比例稀释至50 mL新鲜培养基中。在30 °C、180 RPM振荡条件下继续培养，直至OD600达到0.5–0.7。当培养物接近目标OD600时，将加热块或水浴预热至30 °C，并开始解冻缓冲液A的添加剂（表6）。</li>
	<li>为每份培养物准备5 mL含添加剂的缓冲液A（表6）。操作过程中将缓冲液A保持在室温（RT）。</li>
	<li>为每个待采集的时间点准备微量离心管，每管含90 µL终止液（表7）和10 µL 10% SDS。每分析一个新的因子时，需采集0 s、30 s、1 min、2.5 min、5 min和10 min时间点的样品。</li>
	<li>将培养物倒入50 mL锥形管中，在室温下以1,500 × g离心1分钟。</li>
	<li>用1 mL缓冲液A充分重悬细胞，并将重悬后的细胞转移至微量离心管中。在微量离心机中以1,500 × g、室温离心30秒，使细胞成团。</li>
	<li>吸除上清液，通过反复吹打用1 mL缓冲液A充分重悬细胞。在微量离心机中以1,500 × g、室温离心30秒，使细胞成团。重复此步骤一次。</li>
	<li>用570 µL缓冲液A充分重悬细胞。加入30 µL 2%洋地黄皂苷（终浓度为0.1%），颠倒混匀以促进细胞通透化。</li>
	<li>将细胞置于30 °C加热块或水浴中通透化5分钟。</li>
	<li>上下吹打反应液以确保细胞均匀分布。取100 µL通透化细胞作为阴性对照，加入含终止液和SDS的微量离心管中（步骤2.4），短暂涡旋混匀。</li>
	<li>向通透化细胞中加入1.1 µL 1 M CaCl2（终浓度为2 mM）以激活MNase，快速颠倒数次或短暂涡旋混匀。立即将反应体系放回30 °C环境，并启动计时器。</li>
	<li>在每个待采集的时间点，上下吹打反应液以确保细胞均匀分布，然后取100 µL通透化细胞加入含终止液和SDS的微量离心管中，短暂涡旋混匀。每分析一个新的因子时，应采集0 s（未加CaCl2&#160;）、30 s、1 min、2.5 min、5 min和10 min时间点的样品。 
	注意：对于在30 °C下快速切割DNA的因子，可选择在较低温度下进行ChEC实验，以减缓MNase的切割动力学。</li>
	<li>所有时间点采集完毕后，向每个样品中加入4 µL 20 mg/mL蛋白酶K，短暂涡旋混匀，并在55 °C孵育30分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入200 µL 25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，剧烈涡旋混匀，然后在微量离心机中以最大转速、室温离心5分钟。</li>
	<li>将各管中的水相（约150 µL）转移至新管。加入30 µg糖原和500 µL 100%乙醇，剧烈涡旋混匀，置于干冰中沉淀10分钟，或直至溶液变黏稠。</li>
	<li>在微量离心机中以最大转速、4 °C离心10分钟，沉淀DNA。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL室温70%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>弃去乙醇，将管倒置并轻轻在纸巾上轻拍以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心，再用移液器小心吸除残余乙醇，注意勿扰动沉淀。将沉淀在室温下空气干燥5分钟。</li>
	<li>在沉淀干燥期间，配制主混合液，使每个干燥沉淀重悬于29 µL Tris（pH 8.0）和1 µL 10 mg/mL RNase A中。在37 °C消化RNA 20分钟。</li>
	<li>将1 µL 6× DNA上样染料与5 µL各样品混合，于1.5%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。</li>
</ol>
3. 大小筛选
注意：大小选择的目的是从待测序样本中去除多千碱基的基因组DNA片段，并富集约150 bp（相当于核小体DNA的大小）或更小的片段。在测序数据中，这些片段 &#60;400 bp 的片段被富集，其中约核小体DNA大小（~150 bp）处出现显著峰，以及亚核小体片段的峰或宽分布。
<ol>
	<li>向每个样本中加入75 µL聚乙二醇（PEG）溶液中的固相可逆固定化（SPRI）磁珠23 上下吹打10次以混匀。室温孵育珠：DNA混合物5分钟。</li>
	<li>在SPRI磁珠孵育期间，为每个样本准备含有96 µL 10 mM Tris（pH 8.0）和4 µL 5 M NaCl的微量离心管。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁一侧。静置2分钟，使磁珠充分吸附在管壁一侧。</li>
	<li>将每份上清液转移至含有 Tris 和 NaCl 的新离心管中（步骤 3.2）。</li>
	<li>向每个样品中加入 200 µL 25:24:1 苯酚:氯仿:异戊醇，涡旋混匀，在微量离心机中以最大转速于室温离心 5 分钟。</li>
	<li>将每份水相移至新离心管中。加入30 µg糖原和500 µL 100%乙醇。在干冰中沉淀DNA 10分钟，或直至溶液变得黏稠。</li>
	<li>在4 °C下，以最大速度在微量离心机中离心10分钟，使DNA沉淀成团。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>弃去乙醇，将离心管倒置并轻轻在纸巾上敲击以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心样品，用移液器小心吸除残留乙醇，注意勿扰动沉淀。将沉淀在室温下晾干5分钟。</li>
	<li>将干燥的沉淀物重悬于 25 µL Tris（pH 8.0）中。使用高灵敏度检测法测定样品浓度。在 TF ChEC 实验中，经片段大小选择后通常可回收 10–100 ng DNA。</li>
	<li>制备测序文库。文库制备方案不依赖于大小选择，如先前所述24，适合对较宽范围片段大小（25-500 bp）进行测序。</li>
	<li>以双端模式进行序列文库测序。为实现高质量的读段比对，每端至少需要获得25个碱基的序列。每个ChEC样本测序100万至200万条读段即可提供足够的覆盖深度。 
	注意：ChEC-seq 数据的分析是一个复杂的过程，超出本文范围。有关数据分析的详细信息可参见以往的出版物。1,21，用于分析的自定义脚本可在 GitHub 上获取（https://github.com/zentnerlab/chec-seq）。HOMER25 (http://homer.salk.edu) 也可用于 ChEC-seq 数据的命令行分析。</li>
</ol>

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<li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li>
<li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已证明，ChEC 可用于在染色质上定位多种类的酵母蛋白，并预计该方法将广泛适用于酵母中不同家族的转录因子（TFs）及其他染色质结合因子。ChEC-seq 的优势在于无需交联、染色质溶解或抗体。因此，ChEC 可避免 X-ChIP-seq 中可能存在的假象，例如超ChIPable假象3,4，以及传统ChIP中因蛋白溶解不完全导致的假阴性结果14。ChEC-seq 的主要缺点与所有酶融合方法相同，即需要构建融合蛋白。在芽殖酵母中可快速实现，但在多细胞生物中则更为繁琐。ChEC-seq 的另一局限性是无法直接用于组蛋白修饰的分析。然而，可将组蛋白修饰结合结构域与MNase融合并表达，从而实现利用ChEC-seq进行组蛋白修饰的定位。在此基础上，已有研究利用表位标签标记的组蛋白修饰结合结构域进行ChIP-seq，以绘制全基因组范围内的组蛋白修饰图谱26。
使用游离MNase对...

绘制转录因子（TFs）、染色质重塑因子及其他染色质相关调控因子的结合位点，是理解所有基于染色质过程的关键。尽管染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）方法已被用于获得基因组生物学中的许多重要发现，但其存在显著局限性。我们近期提出了一种替代方法，称为染色质内源性切割结合高通量测序（ChEC-seq）1，以克服这些缺点。
染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）通常首先进行甲醛交联（X-ChIP-seq），以稳定蛋白质-DNA相互作用。然而，近年来多项研究表明，X-ChIP-seq会捕获短暂或非特异性的蛋白质-DNA相互作用2,3,4,5,6,7,8，从而导致假阳性结合位点的出现。此外，在X-ChIP-seq实验中常用的超声处理用于染色质片段化，但其优先剪切开放染色质区域，导致这些区域的片段回收存在偏差9,10。超声处理还会产生长度不均一的片段混合物，最终限制结合位点的分辨率，尽管加入外切核酸酶消化步骤可显著提高分辨率11,12。天然ChIP方法，例如通过亲和纯化天然分离染色质获得的基因组占据区域（ORGANIC）13，不使用交联，并利用微球菌核酸酶（MNase）对染色质进行片段化，从而避免了甲醛交联和超声处理可能带来的偏差。然而，在天然染色质提取所需的相对温和条件下，许多染色质结合蛋白的溶解性较差，可能导致动态范围降低和/或出现假阴性结果14。
尽管ChIP-seq的多种变体是全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用最常用的方法，但已有若干基于将目标蛋白质与不同DNA修饰酶融合的绘图技术被开发和应用。其中一种方法是DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DNA adenine methyltransferase identification, DamID）15，该方法将感兴趣的染色质结合蛋白在基因上与Dam融合，并在细胞或动物体内表达该融合蛋白，从而导致该蛋白结合位点附近的GATC序列发生甲基化。DamID的优势在于不依赖免疫沉淀，因此无需交联、抗体或染色质溶解步骤，且可在活体（in vivo）条件下进行。然而，DamID的分辨率仅限于千碱基（kilobase）尺度，且Dam融合蛋白的甲基化活性是组成型的。另一种基于酶融合的方法是Calling Card-seq16，该方法将目标因子与转座酶融合，从而引导转座子在特定基因组位点的整合。与DamID类似，Calling Card-seq不依赖免疫沉淀，因而具有相似的优势，并且分辨率更高。然而，Calling Card-seq可能受到转座酶序列偏好性的限制，且其效率还依赖于转座子插入位点附近是否存在合适的限制性酶切位点。
Laemmli 实验室开发的第三种酶融合方法是染色质内源性切割技术（chromatin endogenous cleavage, ChEC）17。在 ChEC 中，将染色质相关蛋白与 MNase 的融合蛋白在细胞中表达，加入钙离子以激活 MNase，从而在标记因子结合位点附近切割 DNA（图 1）。结合 Southern 印迹技术，ChEC 已被用于表征酵母中多个特定基因座的染色质结构和蛋白质结合情况17,18，并已与低分辨率微阵列分析相结合，用于研究核孔复合物组分与酵母基因组的相互作用19。ChEC 具有与 DamID 和 Calling Card-seq 类似的优点，当采用引物延伸法分析时，其分辨率接近单碱基对19。此外，ChEC 具有可调控性：MNase 介导的强烈 DNA 切割依赖于毫摩尔浓度钙离子的添加，从而确保在活体酵母细胞内低游离钙浓度条件下 MNase 保持无活性20。
此前，我们曾提出将ChEC与高通量测序技术（ChEC-seq）相结合，可获得转录因子结合位点的高分辨率图谱。事实上，ChEC-seq已成功生成了芽殖酵母中通用调控因子（GRFs）Abf1、Rap1和Reb1在整个基因组范围内的高分辨率结合图谱1。我们还成功将ChEC-seq应用于模块化的中介复合物（Mediator complex）——一种保守且必需的全局转录共激活因子21，从而拓展了ChEC-seq在不直接接触DNA、且难以通过基于ChIP的方法进行定位的兆道尔顿级复合物上的应用。ChEC-seq不仅可用于独立验证ChIP-seq结果，还能为染色质相关过程的调控机制提供新的见解。本文中，我们提供了一套在芽殖酵母中实施该方法的逐步操作方案。

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>其他高保真 DNA 聚合酶（如 Phusion）也可用于片段扩增。</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>必须使用不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，以避免通过螯合 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 抑制 MNase 的切割活性。</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin，高纯度</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>通过将 20 mg Digitonin 溶解于 1 mL DMSO 中并剧烈涡旋，配制 2% 储存液。</td></tr><tr><td>蛋白酶 K，20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A，10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>可依据已发表的方案（参考文献 24）制备类似 Ampure 的磁珠。</td></tr><tr><td>MagneSphere 磁力架</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

全基因组范围内利用 chec-seq 技术在 saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-dna 相互作用图谱

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用图谱对于理解基因调控、染色质重塑及其他染色质相关过程至关重要。通过甲醛交联、染色质免疫沉淀及高通量测序（X-ChIP-seq）的方法，已在基因组生物学领域获得诸多重要发现。然而，X-ChIP-seq存在明显的局限性，主要与交联和超声处理相关。天然染色质免疫沉淀（Native ChIP）通过省略交联步骤避免了这些缺陷，但通常导致染色质结合蛋白的回收率较低。此外，所有基于ChIP的方法均受限于抗体质量的影响。近年来，也发展了利用将目标蛋白与DNA修饰酶融合的酶学方法来绘制蛋白质-DNA相互作用图谱。我们近期将其中一种方法——染色质内源性切割技术（chromatin endogenous cleavage, ChEC）与高通量测序相结合，建立了ChEC-seq技术。ChEC-seq依赖于将目标染色质相关蛋白与微球菌核酸酶（MNase）融合，在活细胞中钙离子存在条件下实现靶向DNA切割。ChEC-seq不依赖免疫沉淀，因而规避了交联、超声处理、染色质溶解以及抗体质量等潜在问题，同时能够以高分辨率实现背景信号极低的精确图谱绘制。我们预期ChEC-seq将成为ChIP技术的有力补充，为验证ChIP-seq结果以及发现基因组调控新机制提供一种独立且可靠的方法。

在 ChEC 实验成功的情况下，通过琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 可观察到随着时间的推移，DNA 断裂程度呈现钙依赖性增加，表现为条带拖尾以及基因组 DNA 最终被完全消化。在某些情况下，经过长时间消化后，会出现类似于传统 MNase 消化所见的梯状条带。Reb1 的 ChEC 分析即为此类情况，Reb1 是一种结合核小体缺失区域（NDRs）的通用调控因子（图 2）。我们发现，对于通用调控因子（GRFs），延长消化时间会导致在快速切割的结合位点处信号丢失1。理想情况下，应选择基因组 DNA 条带尺寸减小且呈现高分子量拖尾现象的样本（例如 Reb1 ChEC 的 30 秒和 1 分钟时间点）用于测序，以避免因时间延长而导致信号丢失。
Reb1 ChEC-seq 实验中片段末端的可视化显示，与未添加钙的 Reb1-MNase 菌株以及在相同时长（30 ...

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用图谱对于理解基因调控、染色质重塑及其他染色质相关过程至关重要。

该实验的总体目标是无需甲醛交联、染色质溶解或抗体，即可在原位生成高分辨率、低背景的全基因组范围蛋白质-DNA相互作用图谱。该方法有助于回答转录领域中的关键问题，例如各种调控因子相对于基因调控区域在染色质上的结合位置。该技术的主要优势在于能够提供背景信号可忽略不计的高分辨率基因组结合图谱，并避免了标准ChEC-seq实验方案相关的局限性。演示该实验步骤的是来自弗雷德·哈钦森癌症研究中心的我的同事 Sebastian Grunberg。在实验前一天的下午或晚上，开始接种实验菌株的预培养物。用含有MNase标签因子的单个菌落接种3毫升已使用过的蛋白胨葡萄糖培养基，或相应的选择性培养基。将该培养物在30摄氏度摇床培养箱中过夜培养。次日早晨，将过夜培养物按1:50比例稀释至培养基中，使600纳米处的光密度值达到0.2至0.3。将培养物继续在摇床培养箱中培养，直至其在600纳米处的光密度值达到0.5至0.7。配制所需体积的缓冲液A及其添加剂，并在操作过程中保持室温。准备微量离心管用于样品收集。每分析一种新因子，均需收集未添加钙的样品，并在添加钙后30秒、1分钟、2.5分钟、5分钟和10分钟时分别收集样品。向每根试管中加入 90 微升终止液和 10 微升 10% SDS。当菌液在 600 纳米处的光密度达到 0.5 至 0.7 时，将菌液倒入 50 毫升锥形管中，在室温下以 1,500 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，用 1 毫升缓冲液 A 充分重悬细胞，并将重悬的细胞转移至微量离心管中。在微型离心机中，以1,500 × g离心重悬的细胞，室温下离心30秒。吸除上清液，用1毫升缓冲液A通过上下吹打彻底重悬细胞。再次以1,500 × g离心重悬细胞，室温下离心30秒。弃去上清液，将细胞重悬于1毫升缓冲液A中，再次离心。弃去上清液后，将细胞充分重悬于570微升缓冲液A中。加入30微升2%的皂苷以促进细胞通透化，并颠倒混匀。将细胞置于30摄氏度的加热块中孵育5分钟以完成通透化处理。用移液器反复吹打反应液，以确保细胞均匀分布。作为阴性对照，取100微升已透化的细胞等分试样，转移至含有终止液和SDS的微量离心管中，短暂涡旋混匀。在开始时间进程实验前，务必将终止液管、移液器、移液器吸头和计时器置于加热块旁，以便高效收集早期时间点的样品。为开始时间进程，向透化的细胞中加入 1.1 微升 1 摩尔的氯化钙以激活 MNase，并快速颠倒混匀数次。立即将混合反应物放回 30 摄氏度，并启动计时器。在每个待采集的时间点，用移液器将反应液上下吹打，以确保细胞均匀分布，然后取 100 微升透化细胞样品加入含有终止液和 SDS 的微量离心管中。涡旋混匀片刻。待所有时间点样品收集完毕后，向每个样品中加入4微升浓度为20毫克/毫升的蛋白酶K。涡旋混匀片刻，于55摄氏度孵育30分钟。向每个样品中加入200微升苯酚:氯仿:异戊醇，剧烈涡旋混匀，然后在室温下以最大速度离心5分钟。将水相转移至新管中。加入30微克糖原和500毫升100%乙醇。剧烈涡旋混匀，然后在干冰上沉淀10分钟，或直至溶液变得黏稠。在4°C下以最大速度离心10分钟，使沉淀的DNA形成沉淀小球。倒去上清液，每份沉淀物用1毫升室温的70%乙醇洗涤。弃去乙醇，将离心管倒置并轻轻在纸巾上敲击以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心样品，然后用移液器小心吸除残留乙醇，注意勿扰动沉淀。将沉淀在室温下空气干燥五分钟。在DNA沉淀干燥的同时，配制用于重悬干燥后沉淀的Tris缓冲液和RNase A的主混合液，并涡旋混匀。向每个干燥的DNA沉淀中加入30 µL的RNase A溶液，涡旋混匀，于37°C孵育20分钟以消化RNA。20分钟后，将1 µL的6× DNA上样缓冲液与5 µL的每个样品混合，然后在1.5%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。开始片段大小筛选步骤：向每个样本中加入75 µL SPRI磁珠（溶于聚乙二醇溶液中），用移液器吹打10次以充分混匀磁珠与DNA混合物，随后在室温下孵育5分钟。在SPRI磁珠孵育期间，为每个样本准备微量离心管，其中含有96 µL 10 mM Tris（pH 8.0）和4 µL 5 M氯化钠。将含有磁珠和DNA混合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，使磁珠吸附至管壁一侧，随后将每管上清液转移至含有Tris和氯化钠的新离心管中。向每个样品中加入200微升苯酚:氯仿:异戊醇，涡旋振荡混匀，然后在室温下以最大转速离心5分钟。小心移取每管的水相至新的离心管中，加入30微克糖原和500微升100%乙醇。将DNA在干冰上沉淀10分钟，或直至溶液变得黏稠。在4°C下以最大速度离心10分钟，使沉淀的DNA形成沉淀小球。弃去上清液，每份沉淀小球用1毫升70%乙醇洗涤。弃去乙醇，将离心管倒置并轻轻在纸巾上轻敲以去除残留液体。使用台式离心机短暂离心，然后用移液枪小心吸除残留乙醇，注意勿扰动沉淀。室温下晾干沉淀5分钟。将每个干燥的沉淀物重悬于25 µL Tris（pH 8）中。使用高灵敏度检测法测定每个样品的浓度。对Reb1（一种结合于核小体缺失区域的通用调控因子）进行染色质内源性切割分析所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示随着时间推移，DNA片段化程度呈钙依赖性增加，表现为条带拖尾，最终导致基因组DNA完全降解。Reb1染色质内源性切割测序实验中片段末端的可视化显示，在钙处理30秒后，来自游离MNase菌株的样本中Reb1信号显著高于背景。类似地，在添加钙离子一分钟后，由中介复合物亚基Med8与MNase融合蛋白驱动的实验观察到明显的DNA切割，而由Med8启动子驱动的游离MNase则未见明显切割。为了将Reb1染色质内源性切割测序数据与染色质免疫沉淀结合高通量测序数据进行比较，选取通过有机方法确定的1,992个Reb1峰，并以其基序为中心，计算在基序中点周围100个碱基对窗口内每个碱基位置的平均片段末端计数。在 Reb1-MNase 释放的片段末端中，大多数映射到基序上游侧，表现出显著的不对称性和切割特征。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一个完整工作日内完成。在进行此实验时，重要的是要记住限制平行检测的样本数量，以确保移液和操作时间的准确性。该技术建立后，首次为转录领域的研究人员明确表征酵母中一种非DNA结合型、兆道尔顿级蛋白复合物的基因组关联提供了可能。观看本视频后，您应能充分掌握如何在酿酒酵母基因组中运用ChEC-Seq方法进行全基因组范围的蛋白结合位点定位。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

与ChEC-seq的蛋白质-DNA相互作用的全基因组映射<em&gt;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）</em

本文介绍了一种用于鉴定酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中利用定量蛋白质组学鉴定蛋白质复合物

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

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改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

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Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。...

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

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通过富集和测序蛋白质相关新生DNA方法对复制DNA链上蛋白质进行链特异性分析

学习ChEC-seq技术，利用微球菌核酸酶融合蛋白在酿酒酵母中进行全基因组蛋白质-DNA相互作用的高分辨率定位。该方法无需甲醛交联，背景噪音极低，适用于转录调控研究。

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