全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

本实验的总体目标是在无需甲醛交联、染色质溶解或抗体的情况下，原位生成高分辨率、低背景的全基因组蛋白-DNA 相互作用图谱。该方法有助于回答转录领域中的关键科学问题，例如各种调控因子相对于基因调控区域在染色质上的结合位置。该技术的主要优势在于能够提供背景信号可忽略不计的高分辨率基因组结合图谱，并避免了标准 ChEC-seq 方案相关的局限性。

演示该实验步骤的是来自弗雷德·哈钦森癌症研究中心的同事 Sebastian Grunberg。在实验前一天的下午或晚上，开始接种实验菌株的预培养物。用含有MNase标签因子的单菌落接种3毫升已使用过的蛋白胨葡萄糖培养基（peptone dextrose）或适当的筛选培养基。

将该培养物在30摄氏度摇床培养箱中过夜培养。次日早晨，将过夜培养物按1:50比例稀释至培养基中，使600纳米处的光密度值达到0.2至0.3。将培养物继续在摇床培养箱中培养，直至其在600纳米处的光密度值达到0.5至0.7。

配制所需体积的缓冲液 A 及其添加剂，并在实验过程中保持室温。准备微量离心管用于样品收集。每分析一种新因子，均需收集未添加钙的样品，并在添加钙后 30 秒、1 分钟、2.5 分钟、5 分钟和 10 分钟时分别收集样品。

向每根试管中加入 90 微升终止液和 10 微升 10% SDS。当菌液在 600 纳米处的光密度达到 0.5 至 0.7 时，将菌液倒入 50 毫升锥形管中，在室温下以 1,500 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，将菌体充分重悬于 1 毫升缓冲液 A 中，并将重悬的菌体转移至微量离心管中。

在微型离心机中，于室温下以1,500 × g离心30秒，使重悬的细胞沉淀。吸除上清液，并用1毫升缓冲液A通过上下吹打充分重悬细胞。再次于室温下以1,500 × g离心30秒，使重悬的细胞沉淀。

弃去上清液，将细胞重悬于1毫升缓冲液A中，再次离心。弃去上清液后，将细胞充分重悬于570微升缓冲液A中。加入30微升2%的皂苷以促进细胞通透，并颠倒混匀。将细胞置于30摄氏度水浴中孵育5分钟以完成通透处理。

用移液器反复吹打反应液，以确保细胞均匀分布。作为阴性对照，取100 µL破膜细胞等分试样转移至含有终止液和SDS的微量离心管中，短暂涡旋混匀。在开始时间进程实验前，务必将终止液管、移液器、移液器吸头和计时器放置在加热块旁边，以便高效地收集早期时间点的样品。

为开始时间进程，向透化的细胞中加入1.1 µL 1 M氯化钙以激活MNase，并快速颠倒混匀数次。立即将混合反应物放回30 °C，并启动计时器。在每个采集时间点，用移液器将反应液上下吹打，以确保细胞均匀分布，然后取100 µL透化细胞样品加入含有终止液和SDS的微量离心管中。

涡旋混匀片刻。待所有时间点的样品收集完毕后，向每个样品中加入4 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K。涡旋混匀片刻，于55 °C孵育30分钟。

向每个样品中加入 200 微升苯酚：氯仿：异戊醇，剧烈涡旋混匀，然后在室温下以最大速度离心 5 分钟。将水相转移至新管中。加入 30 微克糖原和 500 毫升 100% 乙醇。

剧烈涡旋混匀，然后在干冰中沉淀10分钟，或直至溶液变得黏稠。在4°C下以最大速度离心10分钟，使沉淀的DNA形成沉淀小球。倒去上清液，每份沉淀小球用1毫升室温的70%乙醇洗涤。

倒出乙醇，并将离心管倒置，轻轻在纸巾上敲击以去除残留的乙醇。使用台式离心机短暂离心样品，然后用移液器小心吸除残留的乙醇，注意不要扰动沉淀。将沉淀在室温下空气中干燥5分钟。

在DNA沉淀干燥的同时，配制用于重悬干燥后沉淀的Tris缓冲液和RNase A的主混合液，并涡旋混匀。向每个干燥的DNA沉淀中加入30微升RNase A溶液，涡旋混匀后，在37摄氏度孵育20分钟以消化RNA。20分钟后，将1微升6×DNA上样染料与5微升每种样品混合，随后在120伏电压下于1.5%琼脂糖凝胶中电泳40分钟。

开始片段大小筛选步骤，向每个样本中加入75 µL SPRI磁珠（溶于聚乙二醇溶液中）。用移液器上下吹打10次以充分混匀磁珠与DNA混合物，随后在室温下孵育5分钟。在SPRI磁珠孵育期间，为每个样本准备微量离心管，其中含有96 µL 10 mmol/L Tris（pH 8.0）和4 µL 5 mol/L氯化钠。

将含有磁珠和DNA混合物的离心管置于磁力架上静置2分钟，使磁珠吸附于管壁一侧，随后将每管上清液转移至含有Tris和氯化钠的新离心管中。向每个样品中加入200微升苯酚:氯仿:异戊醇，涡旋振荡混匀，然后在室温下以最大转速离心5分钟。小心移取每管的水相至新的离心管中，加入30微克糖原和500微升100%乙醇。

将 DNA 在干冰上沉淀 10 分钟，或直至溶液变得黏稠。在最大转速及 4°C 下离心 10 分钟，使沉淀的 DNA 形成沉淀小球。倒去上清液，并用 1 毫升 70% 乙醇洗涤每个沉淀小球。

倒出乙醇，将离心管倒置并轻轻在纸巾上轻敲以去除残留的乙醇。使用台式离心机短暂离心样品，然后用移液器小心吸除残留的乙醇，注意不要扰动沉淀。将沉淀在室温下空气中干燥五分钟。

将每个干燥的沉淀物重悬于25 µL Tris（pH 8）中。使用高灵敏度检测法测定每个样品的浓度。对Reb1（一种结合于核小体缺失区域的通用调控因子）进行染色质内源性切割分析所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示随着时间推移，DNA片段化程度呈钙依赖性增加，表现为条带拖尾，最终导致基因组DNA完全降解。

Reb1染色质内源性切割测序实验中片段末端的可视化结果显示，在加入钙离子处理30秒后，来自游离MNase菌株的样本中，Reb1信号相对于背景具有显著富集。类似地，在加入钙离子一分钟后，由中介复合物亚基Med8与MNase融合蛋白驱动的实验观察到明显的DNA切割信号，而由Med8启动子驱动的游离MNase则未检测到显著信号。为了将Reb1染色质内源性切割测序数据与染色质免疫沉淀结合高通量测序数据进行比较，研究选取了通过有机方法确定的1,992个Reb1峰，以其基序中心为参照，计算在基序中点周围100个碱基对窗口内每个碱基位置的平均片段末端计数。

在 Reb1-MNase 释放的片段末端中，大多数定位于基序上游侧，表现出显著的不对称性和切割特征。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一整天的工作时间内完成。在进行此实验时，重要的是要记住限制平行检测的样品数量，以确保移液的准确性和操作时间的可控性。

该技术问世后，首次为转录领域的研究人员明确表征酵母中一种非DNA结合型、兆道尔顿级蛋白复合物的基因组关联提供了可能。观看本视频后，您应能充分掌握如何在酿酒酵母基因组中运用ChEC-Seq方法进行全基因组范围的蛋白结合位点定位。