新生小鼠缺氧缺血性脑损伤模型中的神经行为学评估

缺氧缺血性新生儿脑损伤手术结合认知与运动功能检测的总体目标是建立一种用于研究此类损伤及相关脑损害的小鼠模型。该方法有助于回答关于新生儿缺氧缺血性脑损伤的关键问题，例如此类损伤如何影响运动和认知功能。该技术的主要优势在于其已被广泛认知且被普遍使用。

它也是脑性瘫痪和新生儿中风的临床前模型。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为单侧右侧颈总动脉较难辨认。与我共同演示该操作的是我们实验室的研究生Yoon-Kyum Shin。

麻醉至少五只出生七天的小鼠幼崽后，将一只幼崽置于解剖显微镜下，腹部朝上。然后用酒精清洁颈部。开始手术时，使用剪刀在颈部做一个0.7毫米的切口。

然后，使用镊子小心地去除脂肪组织，直至暴露单侧右侧颈动脉。接着，使用5-0缝线结扎单侧右侧颈动脉。现在，用5-0尼龙线缝合颈部切口，并对切口进行消毒。

然后，将幼鼠置于37摄氏度的低氧舱中，打开舱盖恢复约1小时。将另一只经手术处理的小鼠放入低氧舱中恢复。待所有幼鼠完全清醒后，关闭舱盖，并降低气体浓度以建立低氧环境。

缺氧90分钟后，将脑损伤的幼鼠放回笼中。一周后，按先前方法将幼鼠准备就绪进行手术，以观察损伤证据。在头皮上做切口，以确定右半球后外侧区域的脑部病灶。

透过半透明的颅骨观察皮质损伤和海马损伤的迹象，据此将幼鼠分为损伤组和未损伤的对照组。检查完毕后，用缝线闭合头皮，并对切口进行消毒。

当小鼠六周大时，根据其对有害刺激的学习和回避能力来评估记忆功能。使用商用的双室穿梭被动回避装置进行该实验。开始时，将小鼠放入箱体的明亮 compartment 中，持续 30 秒。

然后，打开隔室之间的门，记录动物进入暗室的潜伏期。允许最多300秒完成该任务。当小鼠四肢完全进入暗室后，关闭门。

然后，给予小鼠持续2秒、强度为0.5毫安的足部电击，随后将小鼠放回笼中。24小时后重复测试，此次允许小鼠在300秒内自由进入暗室，不再给予电击。

对六周龄小鼠进行梯子行走实验，通过定性和定量分析来区分运动功能的细微障碍。首先，设置梯子装置，然后架设视频摄像机以记录小鼠在装置上的肢体运动。接着，将小鼠放置在起始面板上，并启动视频摄像机开始录制。

确保视频中鼠腿清晰对焦。当小鼠触碰到阶梯装置的最后一个踏板时，停止录制。随后将小鼠移回起始踏板，再次记录其穿越装置的过程。

每只小鼠在每次试验日期需重复此操作共四次。之后分析视频时，以1/10倍速播放视频，手动统计每只肢体发生的滑动次数。当肢体在栏杆之间滑动时，即计为一次滑动。

当小鼠六周大时，评估其抓力强度。使用配备有直径为2毫米三角形金属丝的推拉式测力计，并将其固定在一块面板上。将小鼠置于面板上，用手抓住其尾巴固定。

然后，让小鼠仅用前肢接触金属丝。一旦小鼠抓住金属丝，轻拉其尾部直至其松开。仪器将以克为单位记录金属丝上的最大拉力。

在让小鼠休息之前，重复此测试五次。在抓力测试过程中，可观察到小鼠表现出明显的精准动作。在五次尝试中注意识别这些动作，之后让小鼠至少休息一分钟，以减少其肌肉疲劳。

在小鼠休息至少一分钟之后，再次重复五次试验系列。然后让小鼠再次休息，并在当天最后一次执行该系列试验。根据数据，分析时采用前肢或双侧前肢三次最高得分的平均值。

在收获14周龄缺氧缺血损伤动物的脑组织后，根据形态学评估将其脑组织分为无皮层损伤、轻度损伤或重度损伤。这些动物在一周前曾接受MRI扫描，结果同样具有重要提示意义。即使形态学上正常的脑组织，其海马区也显示出轻度损伤。

在出生六周龄、损伤后五周时，对小鼠进行多种行为学任务评估。缺氧缺血损伤小鼠在24小时被动回避任务中表现出认知功能障碍。由于仅右侧大脑半球受损，小鼠出现偏瘫性运动功能障碍。

这通过每只前肢在梯子横向横档上打滑百分比的差异得以揭示。此外，由于抓握力涉及大脑中的运动皮层，正常组与皮层损伤组在抓握力量上表现出差异。正常对照组与明确未受伤的小鼠之间未观察到差异，但受伤小鼠表现出明显功能障碍。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何结扎单侧右侧颈动脉以制备新生小鼠缺氧缺血模型，以及如何进行后续的行为学分析。需要注意的是，即使在损伤后七天大脑皮层未见明显损伤，MRI 仍可能显示海马区存在损伤。此外，务必轻柔对待幼鼠，并尽快完成手术操作。

幼鼠皮肤非常脆弱且薄，操作时需格外小心。