一种用于人肾周血管壁间充质细胞的新型临床级分离方法

本临床级分离方法的总体目标是从人体肾脏周围血管间质中分离出肾脏周围血管基质细胞（kPSC），用于多种肾脏疾病的细胞治疗。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，例如适用于肾脏疾病中心神经治疗及移植的人源kPSC。该技术的主要优势在于其具备临床应用潜力，并且能够扩增出足够数量的kPSC用于细胞治疗。

我们实验室的技术员 Ellen Lievers 将演示 kPSCs 的功能检测。在开始肾脏细胞分离程序之前，将一个已灭菌的灌注托盘以垂直方向连接至水浴装置。当灌注托盘被水温加热后，将其改为水平位置，但仍保持与水浴装置的连接，然后将一根 L/S 25 管放入泵中。

将培养皿镊子置于导管一端，使导管自然放置于托盘底部。在导管上方覆盖无菌纱布以防止堵塞，并在导管另一端连接鲁尔接头，随后向托盘中加入约100毫升培养基，以每分钟100毫升的泵速开始冲洗L/S 25导管。为分离肾脏细胞，将肾脏从双层无菌袋中转移至无菌灌注托盘，使用剪刀并辅以轻柔撕扯，去除肾周脂肪组织及肾包膜。

在主动脉片上找到肾动脉后，使用辅助尖端插管肾动脉，并用无菌扎带固定尖端。启动泵后，将泵管末端连接至鲁尔接头，并以每分钟100毫升的流速用托盘中的培养基冲洗肾脏。

接下来，向灌注盘中加入 20 毫升胶原酶和 2.5 毫升 DNA 酶，使酶液消化肾脏组织，期间用手轻轻翻动器官，直至组织变软，灌注液开始变得浑浊。胶原酶消化时间至关重要：时间过短会导致细胞成团，而时间过长则会引起细胞死亡。酶消化结束后，轻轻按摩肾脏直至获得细胞悬液，并去除未消化的组织和尖刺物。

向细胞悬液中加入 50 毫升正常人血清，然后将连接肾脏的管子置于多个 50 毫升收集管上方，以低流速通过泵使细胞悬液从灌注盘流入收集管中。当所有细胞收集完毕后，离心细胞悬液，并用添加了 10% 正常人血清的洗涤液将沉淀洗涤两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于与细胞沉淀体积相等的细胞培养基中。

为了培养粗制肾细胞，将约1毫升细胞悬液加入含25毫升α-MEM加5%血小板裂解物细胞培养基的T175细胞培养瓶中，在37°C及5%二氧化碳条件下培养。两天后，去除上清液和细胞碎片，并用25毫升新鲜细胞培养基重新换液。当细胞达到汇合状态时，根据标准操作流程，通过磁性细胞分选法分离NG2阳性细胞组分。

然后在适当大小的细胞培养瓶中，以每平方厘米4×10³个NG2阳性细胞的密度接种，并将培养瓶放入细胞培养箱中。当细胞融合度达到90%至100%时，收集上清液，并用PBS洗涤贴壁细胞两次。根据培养瓶的大小，加入适量的胰蛋白酶消化细胞，5分钟后用预留的上清液终止反应。

轻轻重悬细胞，然后将细胞悬液转移至适当大小的锥形管中进行离心，并以每平方厘米4 × 10³个细胞的密度重新接种细胞。有时在NG2富集后，细胞会停止增殖，或开始形成三维结构。此问题可通过胰酶消化细胞并重新接种予以解决。

经过四到五次传代后，将kPSCs以每2毫升培养基含2 × 10⁵个细胞的浓度接种于六孔板中，每孔接种2毫升；另取近端小管上皮细胞以每孔5 × 10⁵个细胞接种于另一块六孔板中，每孔加入2毫升近端小管上皮细胞培养基。将两块六孔板均置于细胞培养箱中培养48小时，培养结束后收集kPSCs的上清液，随后吸除近端小管上皮细胞的上清液，使用黄色移液器吸头在每孔底部的细胞单层上划一道划痕。用PBS洗涤划痕后的细胞，然后加入来自肾血管基质细胞培养的条件培养基。

随后在倒置明场显微镜下，于划痕后4、8、12和24小时在预先标记的相同位置拍摄图像，以评估随时间推移的划痕闭合百分比。肾周血管外膜间充质细胞为贴壁生长、呈纺锤形的细胞，表达间充质和血管周细胞标志物，不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR等标志物。通常在第4代时可获得较为均一的肾周血管外膜间充质细胞群体，细胞在第9至第10代左右进入衰老期。

在此具有代表性的伤口划痕实验中，为了评估kPSCs的功能能力，当加入来源于肾周血管周围基质细胞培养的条件培养基后，伤口闭合速度显著快于使用对照培养基培养的孔。一旦掌握原代分离技术，整个过程约需两个小时；生成均一的kPSC群体则需要一到两个月时间。在进行该操作时，需注意一旦肾脏组织变软且液体变得不那么透明，应立即终止胶原酶消化处理。

除了本视频所展示的操作步骤外，这些技术还可用于从其他实体器官中分离血管周围基质细胞。利用该技术分离得到的肾周基质细胞（kPSCs）可用于研究这些细胞在多种肾脏疾病模型及移植模型中的再生潜能。观看本视频后，您应能够以符合临床级标准的方法分离并培养kPSCs。

请注意，处理人体材料存在病毒传播的风险，在进行此操作时，务必采取预防措施，例如检测 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎。