Name: 人类肾脏血管周围间质细胞新型临床分级分离方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习临床级分离培养人肾脏血管周围间质细胞(kPSCs)的方法，采用全器官灌注和NG2细胞富集技术。该方法可生成均质细胞群，用于肾脏疾病再生医学的细胞治疗研究。

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本研究获得了欧洲共同体第七个框架计划（FP7/2007-2013）的资助，资助协议编号为305436 STELLAR。

欧洲协作组（STELLAR）的当地医学伦理委员会和伦理咨询委员会批准了本研究以及因手术原因被弃用的人体移植级肾脏的收集。所有肾脏均获得了用于研究的知情同意。
1. 细胞培养的准备工作
<ol>
	<li>制备血小板裂解液混合物。
	<ol>
		<li>将过期不超过2天的血小板储存于-80 °C，直至使用（最长不超过1年）。 
		注意：血小板最初来源于商业供应商，另从当地血库获取了医院富余的材料。</li>
		<li>至少5名（最好10名）供体的血小板在4 °C过夜解冻。</li>
		<li>将血小板汇集至一个大型无菌瓶中，转移至锥形离心管，于4 °C、1,960 x g离心10分钟。 
		注意：血小板的体积取决于供体数量以及每位供体的医院剩余材料量。</li>
		<li>通过50 mL注射器筒将上清液移入血袋（50 mL/袋）。于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养基的制备
	<ol>
		<li>在37 °C水浴中解冻一袋血小板裂解物。</li>
		<li>加入 1 L (即 2 瓶最小必需培养基 - α 改良型（alphaMEM）、5 mL 200 mM 谷氨酰胺，以及 20 mL 青霉素（5,000 U/mL）/链霉素（5,000 µg/mL）（pen/strep）加入袋中。</li>
		<li>37 °C 下孵育 3 小时。</li>
		<li>将袋子放在平坦表面上，轻轻敲击袋子以去除凝胶。</li>
		<li>使用无菌50 mL注射器将5%血小板裂解物培养基通过输注系统的滤器进行过滤。</li>
		<li>将培养基分装至50 mL离心管中，于-80 °C保存备用。 
		注意：每一批新的血小板裂解物均需在细胞培养中进行测试，并通过将目标细胞（bmMSCs 或 kPSCs）在新旧两批裂解物中培养至汇合来比较。新批次中培养的 kPSCs 或 bmMSCs 在细胞数量和活力方面与前一批次相比差异不应超过 10%；通过流式细胞术分析的 CD73、CD90、CD105 以及 CD31、CD34 和 CD45 的标志物表达水平也应无差异。细胞培养方法详见方案第 6 节（kPSC 培养）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞收获前的准备工作
<ol>
	<li>溶液的配制。
	<ol>
		<li>通过向500 mL（1瓶）Dulbecco改良必需培养基（DMEM）-F12中加入10 mL青霉素-链霉素溶液（pen/strep），配制基础培养基。</li>
		<li>通过向1瓶DMEM-F12培养基中加入50 mL正常人血清（NHS）和10 mL青霉素-链霉素溶液（pen/strep），配制洗涤培养基。</li>
		<li>通过向160 mL威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution）中加入2.9 mL 1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1.2 mL 2.5% [w/v] NaHCO3 溶液和160 µL 1 M CaCl2，配制酶储备缓冲液。</li>
		<li>通过缓慢将20 mL酶储备缓冲液加入含有&#62;2,000 U/瓶胶原酶的GMP级胶原酶瓶中，配制胶原酶溶液。在4 °C下溶解约40分钟，溶解过程中轻轻振荡数次。</li>
		<li>通过向45 mL正常人血清（NHS）中加入5 mL二甲基亚砜（DMSO），配制冻存培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注托盘的准备（图1A）。
	<ol>
		<li>清洁层流舱并覆盖手术巾。将水浴加热至约40 - 45 °C，以使灌注托盘预热至37 °C。穿戴手术衣和手术手套。</li>
		<li>将已灭菌的灌注托盘连接至水浴，利用温水预热灌注托盘。开始时将灌注托盘保持垂直位置，确保其中无空气。如有必要，向水浴中添加更多水，以防止空气进入灌注托盘。</li>
		<li>将LS25管路安装至泵中，将管路的两个无菌端均保留在层流柜内。在管路一端夹上柯赫钳（Kocher's forceps），并使其自然放置于灌注托盘底部。在管路上方覆盖一块无菌纱布，以防堵塞。在另一端管路上连接鲁尔接头（Luer connector）。</li>
		<li>向灌注托盘中加入约100 mL基础培养基，以100 mL/min的泵速开始冲洗管路。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肾脏细胞分离
<ol>
	<li>肾脏的准备。
	<ol>
		<li>将肾脏从双层无菌袋中取出，放置于无菌灌注托盘上（图1B）。使用剪刀并辅以轻柔撕扯，去除肾周脂肪组织和肾包膜（图1C），并在主动脉片上识别肾动脉，如图 图1D 所示。</li>
		<li>使用配套穿刺针插入肾动脉，用无菌扎带固定，并在泵运行状态下通过鲁尔接头将其连接至泵管末端。若管道未完全充满液体，应先向托盘中加入更多培养基，并启动泵以冲洗管道（图1E - F）。通过泵以100 mL/min的流速用基础培养基冲洗肾脏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原酶处理与肾细胞分离。
	<ol>
		<li>向灌注托盘中加入胶原酶（20 mL，&#62;2,000 U）和DNase（2.5 mL，1 mg/mL）（图1G）。用手不时轻柔翻动肾脏。等待直至肾脏变软，灌注液变得浑浊（约30 - 40分钟）。</li>
		<li>轻柔按摩肾脏（图1H），直至获得细胞悬液（图1I）。去除未消化的组织及肾动脉中的穿刺针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肾细胞的洗涤与收集。
	<ol>
		<li>向细胞悬液中加入50 mL NHS。将泵调至低流速，并将原本连接肾脏的管道置于50 mL离心管上方，从灌注托盘中排出细胞悬液（图1J）。</li>
		<li>在4 ˚C下以300 × g离心7分钟，弃去上清液。用含10% NHS的洗涤液重悬沉淀，再次在300 × g下离心7分钟。重复洗涤一次。测量细胞沉淀体积，并加入等体积的细胞培养基。</li>
		<li>可在此处将细胞加入等体积冻存液，按1:1比例混合后，根据标准操作程序分装至冻存管中进行冷冻保存；或继续进行细胞培养（第4节）。 
		注意：该细胞悬液含有细胞团块，若需获得单细胞需额外处理，但会导致细胞死亡率升高。因此，此阶段细胞保持悬液状态，不进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 粗制肾细胞的细胞培养
<ol>
	<li>在T175细胞培养瓶中，将约1 mL细胞悬液加入24 mL含5%血小板裂解物的αMEM培养基（细胞培养基）中（图1K），于37 °C、5% CO2条件下培养。2 d后&#160;移除贴壁细胞的培养基及细胞碎片，并更换为25 mL新鲜细胞培养基。</li>
	<li>每周更换两次培养基：采用无菌技术移除一半培养基（12.5 mL），并加入等体积（12.5 mL）的新鲜培养基。</li>
	<li>持续培养至细胞融合（通常为5–7 d）（图1L）。移除培养基，用PBS洗涤两次，每瓶T175培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育5 min进行消化。用培养基中止消化，离心（490 × g，5 min），弃去上清液。</li>
</ol>
5. 通过磁性细胞分选对NG2进行细胞富集（图1M）
<ol>
	<li>根据制造商方案配制细胞分离缓冲液。</li>
	<li>将经胰蛋白酶消化的kPSCs重悬于10 mL细胞分离缓冲液中，490 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于300 µL细胞分离缓冲液中。</li>
	<li>每5 × 107个细胞加入100 µL FcR阻断试剂，再每5 × 107个细胞加入100 µL抗黑色素瘤（NG2）磁珠，4 °C孵育30分钟。根据制造商方案分离NG2阳性组分。加入10 mL培养基，490 × g离心5分钟。</li>
	<li>使用Bürker计数板根据制造商方案对细胞进行计数。将细胞以约4 × 103个细胞/cm2的密度接种至培养瓶中，并进行培养。 
	注意：细胞接种密度如下：&#60;250,000个细胞接种于T25培养瓶，250,000–500,000个细胞接种于T75培养瓶，700,000–800,000个细胞接种于T175培养瓶。磁性细胞富集后，可获得约1–2%的阳性组分。然而，由于该步骤为细胞富集而非细胞分选，培养物中仍会存在其他细胞类型（图1N）。经过数次传代（通常约4–5次）后，培养物中仅存均一的kPSC群体（图1P）。</li>
</ol>
6. kPSCs 的培养
<ol>
	<li>每周更换两次培养基，移除一半原有培养基，并加入新鲜解冻的培养基（图1N）。 
	注意：仅更换一半培养基时，kPSCs的存活率和增殖能力通常更高。</li>
	<li>kPSCs的传代。 
	注意：当细胞融合度达到90–100%，或出现三维结构时（见 图1O），或细胞连续超过一周未见生长时，应进行传代。后两种情况尤其可能出现在细胞富集后的早期传代阶段。此时，传代后细胞通常会重新开始在单层培养中生长（图1P）。
	<ol>
		<li>从90–100%融合的细胞中移除培养基（保留培养基以备后续使用）。用PBS洗涤培养瓶两次（T25中加入1 mL，T75中加入5 mL，T175中加入10 mL）。加入胰蛋白酶（T25中0.5 mL，T75中2 mL，T175中5 mL），于37 °C孵育5分钟。将之前保留的旧培养基加入培养瓶中，轻轻吹打重悬细胞。</li>
		<li>转移至15&#160;或50 mL离心管（根据体积选择），在490 × g下离心5分钟。计数活细胞，并将&#60;250,000个细胞接种至T25培养瓶，250,000–500,000个接种至T75培养瓶，或700,000–800,000个接种至T175培养瓶（约4 × 103 个细胞/cm2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第5或第6代对kPSCs进行检测（例如，划痕实验，第7节）。 
	注意：使用标准方案通过流式细胞术对扩增的细胞进行表征。NG2、PDGFR-β、CD146、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC的标志物表达应均为阳性，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR应为阴性。根据临床微生物实验室的标准方案，检测培养基中的支原体、细菌和真菌。通过肾上皮细胞伤口划痕实验对kPSCs进行功能性检测。实验通常使用无菌、经流式细胞术确认的均一kPSC群体进行，且细胞应具有第6–8代之间的伤口愈合能力。</li>
	<li>按照标准操作，将0.5 mL细胞悬液（每毫升培养基含200万个细胞）与0.5 mL冻存液混合，对kPSCs进行冻存。 
	注意：解冻后，应以较高密度接种kPSCs（T175培养瓶中接种106&#160;个细胞）。</li>
</ol>
7. kPSCs 的功能检测：肾上皮细胞划痕损伤实验
<ol>
	<li>将kPSCs以每孔200,000个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基。在37 °C、5% CO2条件下培养48小时后，收集上清液，即为条件培养基。</li>
	<li>将HK-2（近端小管上皮细胞）17接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 mL近端小管上皮细胞（PTEC）培养基，该培养基由DMEM-F12按1:1比例配制，并添加胰岛素（5 mg/mL）、转铁蛋白（5 mg/mL）、硒（5 ng/mL）、氢化可的松（36 ng/mL）、三碘甲腺原氨酸（40 pg/mL）、表皮生长因子（10 ng/mL）以及青霉素/链霉素，接种密度为每孔500,000个细胞。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下培养48小时后，移除HK-2细胞的培养基，使用黄色移液器吸头从孔的顶部到底部划线，在HK-2单层细胞上制造划痕伤口。用PBS洗涤HK-2细胞，随后加入kPSCs的条件培养基或对照培养基。在培养板底部标记将要成像的区域。 
	注意：HK-2细胞应达到完全汇合状态。每孔选择两个区域进行成像。</li>
	<li>使用倒置明场显微镜，在划痕后4、8、12和24小时，于同一标记位置对划痕区域进行成像。</li>
	<li>使用Image J软件中的多边形选择工具测量划痕面积，计算划痕闭合的百分比。</li>
</ol>

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</ol>

D.G.L.、M.A.E. 和 T.J.R. 与本研究相关的专利申请有关。其他作者无任何利益冲突需要披露。

已从多种不同的人体实体器官（包括胰腺、脂肪、软骨和肾脏）中分离出血管周细胞9,15,16。然而，大多数方法基于小量组织样本，需经过解剖后使用消化酶处理。此外，这类操作通常不使用临床级产品进行，因此这些策略在需要大量临床级细胞的直接临床转化应用中适用性较低。
本文展示了一种基于临床级酶和材料灌注的全新人kPSCs全器官分离方法。该方案改编自我们中心目前用于临床应用的临床级朗格汉斯胰岛分离方案18。
这是首个可获得大量kPSCs的临床级方法。细胞产量的差异主要取决于供体。然而，根据目前从三位不同供体的粗细胞悬液部分所获得的细胞产量进行推算，理论上每位供体平均可获得2.7 × 1012个kPSCs。由于MSC治疗通常包括两次细胞输注，每次剂量为1 - 2 × 106个细胞/千克体重4，因此这些细胞数量足以用于多位患者的异体治疗。
分离过程中的一个关键步骤是胶原酶消化的时间。如果消化时间过短，组织会残留较大的团块，难以进行培养；如果灌注时间过长，则可能出现细胞死亡增加的情况。因此，一旦肾脏开始变软且液体变得不那么透明，就应轻轻按摩肾脏，并立即停止胶原酶处理。
另一个关键步骤是在NG2细胞富集后的细胞培养。有时在NG2细胞富集后，血管周围细胞不会开始增殖，或开始形成三维结构。在这种情况下，当细胞经胰蛋白酶消化并重新接种后，通常会开始以单层形式生长。
实验所用起始材料主要为因外科原因被弃用的人类移植级肾脏。这些器官功能正常，且无明显纤维化。我们承认这可能存在一定局限性，因为此类器官来源相对稀少且难以获取。摘除的肾脏可能是另一种来源；然而，根据肾脏摘除原因的不同，这些肾脏可能含有较多纤维化组织，因而含有更多的肌成纤维细胞，因此需格外注意，以免分离和培养到肌成纤维细胞而非血管周围细胞。
由于采用本方案分离的kPSCs表现出具有肾脏上皮伤口愈合能力的类器官特性15，因此在肾脏疾病和器官移植中应用kPSCs进行细胞治疗将是未来一个颇具前景的方向。为此，目前存在多种细胞/细胞产品递送策略。第一种策略是静脉输注kPSCs，类似于当前骨髓间充质干细胞（bmMSC）的临床研究中所采用的方法。另一个有前景的应用是在移植前将kPSCs或其分泌因子用于机器灌注。通过这种方式，可能改善离体肾脏的质量，从而提升移植后的肾功能。对于这两种策略而言，kPSCs均是一种值得进一步探索用于临床的新颖细胞来源。

间充质基质细胞（MSCs）是一类具有免疫调节功能的细胞，最初从骨髓中分离获得。这类细胞具有纺锤形的形态特征，能够分化为脂肪、骨和软骨组织，并能贴附于塑料表面生长。MSCs表达基质细胞标志物CD73、CD90和CD105，而不表达CD31和CD451,2,3。由于MSCs具有维持组织稳态和免疫调节的能力，因此在细胞治疗领域展现出广阔的应用前景。目前，骨髓来源的MSCs（bmMSCs）正在多种疾病的临床试验中被研究，包括肾脏疾病和肾移植，相关综述可参见其他文献4。
先前的研究表明，来自多种不同实体器官（包括脂肪组织、胎盘和骨骼肌）的血管周围细胞具有与间充质干细胞（MSCs）相似的特性9。然而，这些细胞还表现出组织特异性的功能，可导致器官特异性修复10。例如，人心肌来源的血管周围细胞在缺氧条件下可促进血管生成反应，并能分化为心肌细胞，而来自其他组织的血管周围细胞则不具有这些潜能11。
血管周围基质细胞也可从小鼠12,13,14和人类肾脏15,16中分离获得。我们对肾源性基质细胞（kPSCs）进行了全面表征，并将其与骨髓间充质干细胞（bmMSCs）进行了比较。研究发现，kPSCs与bmMSCs相似，具有免疫抑制能力，并可支持血管丛的形成。然而，这两种细胞类型之间存在组织特异性差异：kPSCs表现出器官特异性的转录表达特征，包括肾源性转录因子HoxD10和HoxD11。与bmMSCs不同的是，kPSCs在TGF-β刺激后不会转化为肌成纤维细胞，也无法分化为脂肪细胞。此外，在肾小管上皮细胞划痕损伤实验中，kPSCs可加速上皮完整性的恢复，而这一现象在bmMSCs中未被观察到。这种增强的伤口修复作用是通过释放肝细胞生长因子介导的。此外，kPSCs在急性肾损伤小鼠模型中可改善肾脏损伤15。因此，kPSCs似乎具有更强的肾脏修复能力，是肾脏疾病细胞治疗中一个颇具前景的新细胞来源。
为了能够将kPSC用于细胞治疗，必须使用临床级酶和临床级方案以符合临床标准的方式分离kPSC。此外，为了能够利用一位供体来源的kPSC治疗多名患者，需要获得足够数量的细胞。本文详细展示了从完整的可用于移植的肾脏中进行临床级kPSC分离的流程，该方法可获得足量的细胞，用于临床细胞治疗。

<table><tbody><tr><td>Baxter 袋</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>人类血小板</td><td>Sanquin</td><td></td><td>医院剩余材料在过期不足2天内使用</td></tr><tr><td>血小板裂解物</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>一次性无菌瓶</td><td>康宁</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 聚丙烯离心管</td><td>康宁</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺替代物（GlutaMAX）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>输血系统</td><td>科丹</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>生命技术公司</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>正常人血清（NHS）</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>生命之桥</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶NB1 GMP级</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>3M 荷兰</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>metrohm</td><td>x007528300</td><td></td></tr><tr><td>泵头</td><td>metrohm</td><td>x077202600</td><td></td></tr><tr><td>灌注托盘</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>LS25 Masterflex 管</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>附属刺突</td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>普洛酶</td><td>罗氏</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm 培养瓶&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>75 cm² 培养瓶&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>175 cm² 培养瓶&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>sigma</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>FcR封闭试剂</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>抗黑色素瘤微珠（NG2）</td><td>美天旎</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>70 微米细胞筛 &amp;micro;m</td><td>康宁</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 磁铁</td><td>美天旎</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>550315</td><td></td></tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R&amp;研发</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555596</td><td></td></tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555555</td><td></td></tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>安塞尔</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>559866</td><td></td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555516</td><td></td></tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>550257</td><td></td></tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555445</td><td></td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>美天旎</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&amp;nbsp;</td><td>R&amp;研发</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 FITC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>345815</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>345816</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 APC</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>345818</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>555743</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>默克</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒）</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲状腺原氨酸</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>永生化人肾近端小管上皮细胞（HK2）</td><td></td><td></td><td>由都柏林大学学院 M. Ryan 提供</td></tr></tbody></table>

一种用于人肾周血管壁间充质细胞的新型临床级分离方法

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

间充质基质细胞（MSCs）是一类具有组织稳态维持和免疫调节功能的细胞，在肾脏疾病及肾移植中已显示出有益作用。血管周围基质细胞（PSCs）具有与骨髓间充质基质细胞（bmMSCs）相似的特性，但由于局部印记效应，它们还具备组织特异性特征，并参与局部组织的稳态维持。这种组织特异性可能在人体肾脏内介导特定的修复过程。我们先前研究表明，人肾源性PSCs（kPSCs）可显著促进肾上皮细胞伤口愈合，而bmMSCs则无此潜能。此外，kPSCs能够改善肾脏损伤。 体内因此，kPSCs 是细胞治疗的一个重要来源，尤其适用于肾脏疾病和肾移植。本文展示了基于经肾动脉全器官灌注消化酶并结合血管周标志物NG2富集，从移植级人肾中分离和培养kPSCs的详细方法。通过该方法可获得大量适用于细胞治疗的细胞。

临床级kPSCs的分离方法总结于图1。通过胶原酶灌注从人移植级肾脏中分离粗制肾细胞。将所得细胞悬液在5%血小板裂解物中培养至融合。然后根据NG2的表达分离血管周围基质细胞组分。
kPSCs 是贴壁生长的纺锤形细胞（图 2A），表达间质标记物 CD73、CD90、CD105 以及血管周标记物 NG2、PDGFR-B 和 CD146，而不表达 CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR（图 2B）。通常在第 4 代时可获得较为均一的 kPSCs 群体，而 kPSCs 约在第 9–10 代时进入衰老期（图 2C）。因此，建议在第 5–8 代之间进行实验。
为了评估分离得到的kPSCs的功能能力，我们进行一项 体外 每次新批次的kPSCs均需进行肾上皮细胞划痕伤口愈合实验，因为我们先前已证实，kPSCs的条件培养基可在该划痕实验中加速上皮细胞伤口的愈合15kPSC 条件培养基的制备方法是将 kPSCs 在含 5% 血小板裂解物的 αMEM 中培养 48 小时，然后收集上清液。接下来，使用永生化的人肾近端小管上皮细胞（HK-2）17 培养至细胞融合后，制造划痕伤口，随后向孔中加入kPSCs的条件培养基或对照培养基，并测定伤口愈合速度。当加入kPSCs的条件培养基时，伤口闭合显著加快（图2D).
<img alt="肾细胞分离与kPSC培养方法、示意图、灌注过程、细胞悬液、分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：人源kPSC的临床级分离方法。 移植级肾脏通过肾动脉插管，并经肾动脉灌注胶原酶（A - G），所得细胞悬液经洗涤后，可进行冻存或直接接种培养（H - K）。细胞培养至融合状态（L）后，进行NG2阳性细胞富集（M）。当细胞达到融合状态、增殖停止或出现三维结构时，进行胰酶消化处理（N - P）。kPSC的放行标准包括无菌性、标志物表达以及促进肾小管上皮细胞伤口愈合的能力（Q）。箭头：肾动脉。比例尺 = 200 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="干细胞鉴定：显微镜图像、流式细胞术、生长曲线、伤口愈合实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：人源kPSCs的鉴定。A) kPSCs呈纺锤形，为贴壁生长的细胞。 B) kPSCs表达间充质细胞标志物CD73、CD90、CD105，以及血管周细胞标志物NG2、PDGFR-β和CD146，而不表达CD31、CD34和CD45。kPSCs表达MHC-I类分子（HLA-ABC），但不表达II类分子（HLA-DR）。 C) 来自三个不同供体的kPSCs的生长特性，流式细胞术证实其为均一的NG2阳性细胞群体（第4代）。kPSCs在第9–10代左右进入衰老期。 D) kPSCs可在划痕伤口愈合实验中促进肾小管上皮细胞的修复。图中显示了对照培养基和kPSC条件培养基在t=0、4、8和12小时的代表性图像。A)中的比例尺 = 200 µm，D)中的比例尺 = 100 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍一种基于全器官灌注消化酶和NG2细胞富集的新型临床级肾脏血管周围基质细胞（kPSCs）分离与培养方法。利用该方法，可获得足够数量的细胞用于细胞治疗。

间充质基质细胞（MSCs）是一类具有组织稳态维持和免疫调节功能的细胞，在肾脏疾病中已显示出有益作用，并且……

本临床级分离方法的总体目标是从人体肾脏周围血管间质中分离出肾脏周围血管基质细胞（kPSC），用于多种肾脏疾病的细胞治疗。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，例如适用于肾脏疾病中心神经治疗及移植的人源kPSC。该技术的主要优势在于其具备临床应用潜力，并且能够扩增出足够数量的kPSC用于细胞治疗。我们实验室的技术员 Ellen Lievers 将演示 kPSCs 的功能检测。在开始肾脏细胞分离程序之前，将一个已灭菌的灌注托盘以垂直方向连接至水浴装置。当灌注托盘被水温加热后，将其改为水平位置，但仍保持与水浴装置的连接，然后将一根 L/S 25 管放入泵中。将培养皿镊子置于导管一端，使导管自然放置于托盘底部。在导管上方覆盖无菌纱布以防止堵塞，并在导管另一端连接鲁尔接头，随后向托盘中加入约100毫升培养基，以每分钟100毫升的泵速开始冲洗L/S 25导管。为分离肾脏细胞，将肾脏从双层无菌袋中转移至无菌灌注托盘，使用剪刀并辅以轻柔撕扯，去除肾周脂肪组织及肾包膜。在主动脉片上找到肾动脉后，使用辅助尖端插管肾动脉，并用无菌扎带固定尖端。启动泵后，将泵管末端连接至鲁尔接头，并以每分钟100毫升的流速用托盘中的培养基冲洗肾脏。接下来，向灌注盘中加入 20 毫升胶原酶和 2.5 毫升 DNA 酶，使酶液消化肾脏组织，期间用手轻轻翻动器官，直至组织变软，灌注液开始变得浑浊。胶原酶消化时间至关重要：时间过短会导致细胞成团，而时间过长则会引起细胞死亡。酶消化结束后，轻轻按摩肾脏直至获得细胞悬液，并去除未消化的组织和尖刺物。向细胞悬液中加入 50 毫升正常人血清，然后将连接肾脏的管子置于多个 50 毫升收集管上方，以低流速通过泵使细胞悬液从灌注盘流入收集管中。当所有细胞收集完毕后，离心细胞悬液，并用添加了 10% 正常人血清的洗涤液将沉淀洗涤两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于与细胞沉淀体积相等的细胞培养基中。为了培养粗制肾细胞，将约1毫升细胞悬液加入含25毫升α-MEM加5%血小板裂解物细胞培养基的T175细胞培养瓶中，在37°C及5%二氧化碳条件下培养。两天后，去除上清液和细胞碎片，并用25毫升新鲜细胞培养基重新换液。当细胞达到汇合状态时，根据标准操作流程，通过磁性细胞分选法分离NG2阳性细胞组分。然后在适当大小的细胞培养瓶中，以每平方厘米4×10³个NG2阳性细胞的密度接种，并将培养瓶放入细胞培养箱中。当细胞融合度达到90%至100%时，收集上清液，并用PBS洗涤贴壁细胞两次。根据培养瓶的大小，加入适量的胰蛋白酶消化细胞，5分钟后用预留的上清液终止反应。轻轻重悬细胞，然后将细胞悬液转移至适当大小的锥形管中进行离心，并以每平方厘米4 × 10³个细胞的密度重新接种细胞。有时在NG2富集后，细胞会停止增殖，或开始形成三维结构。此问题可通过胰酶消化细胞并重新接种予以解决。经过四到五次传代后，将kPSCs以每2毫升培养基含2 × 10⁵个细胞的浓度接种于六孔板中，每孔接种2毫升；另取近端小管上皮细胞以每孔5 × 10⁵个细胞接种于另一块六孔板中，每孔加入2毫升近端小管上皮细胞培养基。将两块六孔板均置于细胞培养箱中培养48小时，培养结束后收集kPSCs的上清液，随后吸除近端小管上皮细胞的上清液，使用黄色移液器吸头在每孔底部的细胞单层上划一道划痕。用PBS洗涤划痕后的细胞，然后加入来自肾血管基质细胞培养的条件培养基。随后在倒置明场显微镜下，于划痕后4、8、12和24小时在预先标记的相同位置拍摄图像，以评估随时间推移的划痕闭合百分比。肾周血管外膜间充质细胞为贴壁生长、呈纺锤形的细胞，表达间充质和血管周细胞标志物，不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR等标志物。通常在第4代时可获得较为均一的肾周血管外膜间充质细胞群体，细胞在第9至第10代左右进入衰老期。在此具有代表性的伤口划痕实验中，为了评估kPSCs的功能能力，当加入来源于肾周血管周围基质细胞培养的条件培养基后，伤口闭合速度显著快于使用对照培养基培养的孔。一旦掌握原代分离技术，整个过程约需两个小时；生成均一的kPSC群体则需要一到两个月时间。在进行该操作时，需注意一旦肾脏组织变软且液体变得不那么透明，应立即终止胶原酶消化处理。除了本视频所展示的操作步骤外，这些技术还可用于从其他实体器官中分离血管周围基质细胞。利用该技术分离得到的肾周基质细胞（kPSCs）可用于研究这些细胞在多种肾脏疾病模型及移植模型中的再生潜能。观看本视频后，您应能够以符合临床级标准的方法分离并培养kPSCs。请注意，处理人体材料存在病毒传播的风险，在进行此操作时，务必采取预防措施，例如检测 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎。

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