细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞

本方法的总体目标是诱导副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的细胞分化，并获得大量易于用于荧光显微镜下单细胞分析的分化泳动细胞群体。该方法将有助于科学家理解细菌在细胞分化和形态发生过程中如何调控细胞内结构的组织方式。由于对细菌群落内的细胞进行成像具有挑战性，该技术的主要优势在于能够产生一层排列的分化泳动细胞，便于开展单细胞显微分析。

该技术的意义在于增进对细菌在细胞分化过程中如何调控细胞周期、细胞形态以及细胞内结构变化的理解。本方法的演示至关重要，因为可靠地诱导细胞分化并获得可用于单细胞分析的细胞十分困难。制备用于制作群游平板的琼脂溶液时，需将四克心浸液（H.I. agar）粉末溶于100毫升双蒸水中。

将H.I.琼脂溶液放入微波炉中仔细煮沸，期间不时摇动瓶子，直至粉末完全溶解。将琼脂溶液在121摄氏度下高压灭菌20分钟，然后在持续搅拌下冷却至60至65摄氏度。下一步操作涉及使用2,2'-联吡啶，该物质具有高毒性，因此必须佩戴手套和安全护目镜。

加入2,2'-联吡啶，使其终浓度为50微摩尔。加入氯化钙，使其终浓度为4毫摩尔。从单个菌落边缘接种少量副溶血性弧菌细胞至5毫升LB肉汤中。

将培养物置于37摄氏度的摇床培养箱中孵育，直至其在600纳米处的光密度达到0.8。这通常需要大约两到三个小时。在细胞培养生长的同时，用移液器将30至35毫升的终末H.I.琼脂溶液加入一个圆形150毫米的培养皿中，并让琼脂凝固。

在点样细胞培养物之前，将琼脂平板倒置，敞开盘盖，在37摄氏度下干燥至少10分钟，或直至液体残留物完全消失，但不可过度干燥。取1 µL细胞培养物，点于H.I.琼脂群游平板的中心位置，并让液滴自然干燥。用透明塑料胶带密封平板，注意避免胶带上产生气泡或褶皱。

将培养板在 24 摄氏度下孵育过夜。这将导致副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）群集菌落的形成，菌落周围有从中心向外延伸的群集焰状结构，如本延时视频片段所示。该实验步骤的第一步是为显微镜观察制备琼脂糖载玻片。

将一克琼脂糖加入100毫升20% PBS和10% LB肉汤溶液中。在微波炉中小心煮沸溶液以溶解琼脂糖，然后在磁力搅拌器搅拌下冷却至65至70摄氏度。将一块干净的显微镜载玻片放置在工作台面完全水平的区域上。

用两层通用实验室标签胶带覆盖载玻片两端，将载玻片固定在实验台上。两段胶带之间的距离应约为三厘米。用移液器吸取约 250 µL 预先配制好的琼脂糖溶液，滴加到未被覆盖的玻璃表面。

将第二张载玻片以与底部载玻片相同的方向叠放在上方，并轻轻按压，使残留的琼脂糖向两侧溢出。静置一至两分钟，待琼脂糖凝固。使用解剖刀切除附着在载玻片侧面的多余琼脂糖。

当琼脂糖凝固后，以水平方向缓慢地将顶部的玻片从底部玻片上取下。缓慢移除显微镜载玻片两端的胶带。琼脂糖载玻片应尽快使用，因其会逐渐开始干燥。

在将游动细胞转移至载玻片之前，立即使用手术刀将塑料胶带从预先准备好的游动细胞平板上切除。在切割游动琼脂时，重要的是要从游动菌落的外部向内部进行切割，以避免来自菌落中心的细胞污染游动焰状区域。使用新的手术刀，从游动菌落最外缘切下一小块3毫米×10毫米的游动琼脂，确保切割方向从游动菌落边缘的外部向菌落内部进行。

将带有菌群的琼脂块转移至显微镜用琼脂糖载玻片上，使细胞面朝向琼脂糖垫，以将游动细胞印迹到琼脂糖垫上。静置约30秒后，小心地从琼脂糖垫上移除琼脂块。在细胞印迹处的琼脂糖垫上放置盖玻片。

细胞现已准备好进行荧光显微镜观察。对副溶血性弧菌迁移菌落进行体视显微成像，随着放大倍数增加，可见迁移焰状结构从菌落边缘向外延伸。焰状结构中的细胞仅以单层或双层形式排列，而菌落中央区域的细胞则堆叠成多层结构。

微分干涉差（DIC）显微成像显示，菌群边缘的延伸部分仅由完全分化的游走细胞组成，而菌群中部的细胞明显较短，可能代表了游动细胞与游走细胞的混合群体。作为原理验证，对异源表达关键趋化蛋白YFP-CheW的野生型副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）游动细胞和游走细胞进行了DIC显微镜与荧光显微镜成像。在游动细胞中，YFP-CheW呈单极和双极定位；而在游走细胞中，YFP-CheW始终表现为双极定位，并且沿细胞长度方向随机形成簇状结构。

通过荧光焦点分布图示及荧光强度谱的人口统计学分析，也展示了YFP-CheW在游动细胞向群游细胞分化过程中定位模式的变化。该技术建立后，为微生物细胞生物学领域的研究人员探索细菌——副溶血性弧菌——在其游动细胞与群游细胞不同分化状态下如何调控内部结构组织提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导副溶血性弧菌的细胞分化，以及如何制备一群已分化的群游细胞，用于荧光显微镜下的单细胞分析。

请务必注意，副溶血性弧菌是一种人类病原体，应遵守您所在地区关于处理生物安全等级2级（BSL 2）病原体的适当程序和规定。