诱导细胞分化和单细胞成像副溶血性弧菌
May 15th, 2017
该协议允许单细胞显微镜检查差异不同的副溶血弧菌游泳运动员和swarmer细胞。该方法产生容易获得单细胞分析的swarmer细胞群，并涵盖细胞培养物的制备，诱导分子分化，样品制备和图像分析。
该方法的总体目标是诱导副溶血性弧菌的细胞分化，并形成易于通过荧光显微镜进行单细胞分析的分化蜂群细胞群。这种方法将帮助科学家了解细菌如何在细胞分化和形态发生过程中调节细胞内组织。由于细菌群落内的细胞成像可能具有挑战性，因此该技术的主要优点是它会产生分化的蜂群细胞群，这些细胞群存在于单个细胞层中，随时可用于单细胞显微镜分析。
这项技术的影响延伸到更好地了解细菌如何在细胞分化过程中调节细胞周期、细胞形态和细胞内组织的变化。该方法的演示至关重要，因为难以实现细胞分化的可靠诱导和可用于单细胞分析的细胞的形成。要制备用于制作蜂群板的琼脂溶液，请悬浮 4 克心脏输液或 H.I.琼脂粉和 100 毫升双蒸水。
在微波炉中小心地将 H.I.琼脂溶液煮沸，不时摇晃瓶子，直到粉末溶解。将琼脂溶液在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟，在不断搅拌下将琼脂溶液冷却至 60 t0 65 摄氏度。下一步涉及处理 2,2'Bipyridyl，这是剧毒的，因此必须戴手套和安全护目镜。
加入 2， 2'联吡啶至终浓度为 50 微摩尔。加入氯化钙至终浓度为 4 millamolar。将少量副溶血性弧菌细胞从单个菌落的边缘接种到 5 毫升 LB 肉汤中。
在 37 摄氏度下在摇床培养箱中孵育培养物，直到达到 600 纳米的光密度 0.8。这通常需要大约两到三个小时。当细胞培养物生长时，将 30 至 35 毫升最终的 H.I.琼脂溶液移液到一个圆形的 150 毫米培养皿中，让琼脂凝固。
在点样细胞培养物之前，将琼脂平板直立并打开盖子在 37 摄氏度下干燥至少 10 分钟，或直到任何液体残留物消失，但不能再干燥。在 H.I.琼脂蜂群板的中心点一微升细胞培养物，然后让斑点干燥。用透明塑料胶带密封板，注意避免在胶带上形成气泡和折叠。
将板在 24 摄氏度下孵育过夜。这将导致形成一个 V.Parahaemolyticus 群落，其群耀斑从群落中心延伸，如此延时视频剪辑所示。该程序的第一步是制备用于显微镜检查的琼脂糖载玻片。
将 1 克琼脂糖添加到 100 毫升 20% PBS 和 10% LB 肉汤溶液中。在微波炉中小心地将溶液煮沸以溶解琼脂糖，然后冷却至 65 至 70 摄氏度，同时与磁力搅拌棒混合。将干净的显微镜载玻片放在工作台上完全水平的部分。
用两层通用实验室标签胶带覆盖载玻片的两端，将载玻片固定在工作台上。两条胶带之间的距离应在 3 厘米左右。将约 250 微升先前制备的琼脂糖溶液移液到未覆盖的玻璃表面上。
将第二张显微镜载玻片以与底部载玻片相同的方向放在顶部，然后轻轻向下按压，以便残留的琼脂糖可以流出到两侧。让琼脂糖凝固 1 到 2 分钟。使用手术刀切掉附着在显微镜载玻片侧面的任何残留琼脂糖。
当琼脂糖凝固后，以水平运动缓慢地将顶部载玻片从底部载玻片上拉出。慢慢撕下显微镜载玻片末端的胶带。琼脂糖玻片应尽快使用，因为它会慢慢开始变干。
在将蜂群细胞转移到显微镜载玻片之前，立即使用手术刀从先前准备好的蜂群板上剪下塑料胶带。在切除蜂群琼脂的过程中，重要的是将切口从外侧引导到蜂群集落的内部，以避免来自蜂群中部的细胞污染蜂群耀斑。使用新鲜的手术刀从蜂群菌落的最外边缘切出一块 3 毫米 x 10 毫米的蜂群琼脂，确保将切口从蜂群菌落边缘的外侧引导到蜂群内部。
将蜂群琼脂转移到显微镜琼脂糖载玻片上，使细胞面向琼脂糖垫，以将蜂群细胞印记到琼脂糖垫上。等待约 30 秒后，小心地从琼脂糖垫中取出琼脂块。将玻璃盖玻片放在印有细胞的琼脂糖垫上。
细胞现在已准备好进行荧光显微镜检查。放大倍数增加的副溶血性弧菌群群落的立体显微镜成像显示，从群落的外围延伸出群体耀斑。耀斑中的细胞仅以单层或双层形式分组，而群落中间的细胞则堆叠为多层。
DIC 显微镜成像显示，耀斑仅由完全分化的蜂群细胞群组成，而来自蜂群群落中间的细胞明显更短，可能代表游泳细胞和蜂群细胞的混合物。作为原理验证，对野生型副溶血性弧菌游泳细胞和蜂群细胞进行 DIC 和荧光显微镜成像，异位表达一种必需的趋化蛋白 YFP-CheW。在游泳细胞中，YFP-CheW 以单极和双极方式定位，但在蜂群细胞中，YFP-CheW 总是双极定位，并且还形成沿细胞长度随机定位的簇。
YFP-CheW 在游泳者到群体细胞分化过程中定位模式的变化也通过显示病灶分布和荧光强度分布的人口统计分析来显示。开发后，这项技术为微生物细胞生物学领域的研究人员探索细菌副溶血性弧菌如何在游泳细胞和蜂群细胞的不同分化状态中调节其内部组织铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何诱导副溶血性弧菌的细胞分化以及如何准备分化的蜂群细胞群进行荧光显微镜分析进行单细胞分析有很好的了解。
不要忘记副溶血性弧菌是一种人类病原体，应适用您所在地区如何处理 BSL 2 病原体的适当程序和规定。
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概述
该协议实现了哈维氏弧菌分化为群游细胞，以便进行单细胞显微镜分析。它涵盖了细胞培养的准备、群游细胞分化的诱导、样品准备和图像分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
背景
- 哈维氏弧菌是一种以群游行为而闻名的细菌。
- 细胞分化对于理解细菌形态和功能至关重要。
- 单细胞分析为细胞组织和行为提供了洞察。
- 在细菌群落中进行成像带来了独特的挑战。
研究目的
- 诱导哈维氏弧菌的细胞分化。
- 创建一个群游细胞群体用于单细胞分析。
- 加强对细菌细胞周期和形态的理解。
使用的方法
- 准备群游平板的琼脂溶液。
- 群游细胞分化的诱导。
- 用于成像分析的荧光显微镜。
- 用于显微镜的单细胞层准备。
主要结果
- 成功从哈维氏弧菌中诱导出群游细胞。
- 创建了一个有效成像的单细胞层。
- 对分化过程中的细胞内组织有了新的认识。
- 对细菌形态发生有了更深入的理解。
结论
- 该方法允许可靠地诱导群游细胞进行分析。
- 它为研究细菌分化提供了一个框架。
- 未来的研究可以在此技术基础上探索细菌行为。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables reliable induction of bacterial differentiation and isolation of single cells for fluorescence microscopy, addressing a key challenge in studying intracellular organization during phenotypic transitions. By producing a monolayer of differentiated swarmer cells at the edge of swarm colonies, it provides a scalable system for mechanistic de-risking of antimicrobial targets linked to virulence and motility. The approach supports early discovery workflows where phenotypic screening and target validation require quantitative, single-cell resolution data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking chemotaxis protein localization to cellular differentiation states in a human pathogen.
- Operational Value: Provides a reproducible system for phenotypic screening of compounds that disrupt swarmer differentiation or motility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, single-cell-ready samples for high-content imaging assays measuring subcellular protein dynamics.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent swarmer monolayer production, reducing variability in fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of differentiation to virulence phenotypes, supporting biomarker identification for anti-infective development.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity by enabling longitudinal tracking of intracellular organization during phenotypic switching.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where phenotypic switching informs target confidence and lead optimization decisions, particularly for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how pathogens regulate intracellular organization during morphogenesis and host adaptation.
- Screening: Delivers assay-ready, differentiated cell populations for compound screening against motility or biofilm formation.
- Analytics: Enables quantitative fluorescence intensity profiling and demographic analysis for objective comparison of cellular states.
- Translational Research: Links molecular differentiation markers to pathogenic potential, informing risk-adjusted target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying bacterial differentiation across multiple strains or species with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in virulence-related pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of single-cell imaging workflows in containment-required settings.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of phenotypic resistance mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of anti-infective candidates through mechanistic de-risking of colonization and persistence traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture techniques, microscopy, and image analysis software.
- Dependent on access to fluorescence microscopes, agarose preparation tools, and sterile swarming plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology and imaging groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to other bacterial species with different swarming dynamics.
- Includes practical limitations such as the need for BSL-2 compliance when working with V. parahaemolyticus and the time-sensitive use of agarose slides before drying.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
6:11
Results: Single Cell Analysis Reveals Changes in Intracellular Localization of YFP-CheW During V. parahaemolyticus Differentiation
1:14
Induction of Swarmer Cell Differentiation
7:41
Conclusion
3:39
Preparation of V. parahaemolyticus Swarmer Cells for Fluorescence Microscopy
