使用定量成像技术鉴定和表征异源细胞群体
June 30th, 2017
我们已经开发了一种用于研究异源细胞群体动力学以响应扰动的新方案。该手稿描述了基于成像的平台，其产生定量数据集，以稳健的方式同时表征异源细胞群体的多种细胞表型。
该方法的总体目标是定量评估异细胞群体对插管的动态表型反应，同时区分亚群。大多数生理相互作用发生在多种细胞类型存在的情况下。这种方法可以帮助细胞生物学家评估异质细胞如何响应相同的环境压力以及不同的细胞如何相互影响。
该技术有几个优点，它可以区分多种细胞类型，它允许同时分析亚群，包括出生率和死亡率以及形态动力学。虽然该方案可用于研究许多生物过程，但我们将展示使用 H3255 肿瘤细胞和用厄洛替尼（一种化疗药物）处理的 CCD19LU 成纤维细胞的工作流程。首先，根据文本方案在试管中制备细胞悬液后，倒置试管以将细胞混合在溶液中以标准化接种。
然后将每种细胞悬液的 10 微升移液到微量离心管中，并加入 10 微升台盼蓝。将 10 μL 溶液移液到细胞计数载玻片中，然后将玻片插入自动细胞计数仪中。重复细胞计数至少三次，或直到获得的计数一致。
使用多通道移液器，在 96 孔板的孔中将总共 1， 500 个细胞接种在 100 微升 RPMI 中。将每个细胞悬液一式三份铺板，每个时间点使用相同的板设置。将细胞孵育过夜。
将 DMSO 添加到 Erlotinib 粉末中，制成 10 毫摩尔的 Erlotinib 储备溶液。然后，使用细胞培养基将药物稀释至最高最终浓度 10 微摩尔的两倍。以 1：10 的比例连续稀释药物 4 次，总共 5 种药物浓度，无药物对照。
将100 μL 药物溶液移液到 96 孔细胞板的适当孔中，使最终药物浓度为 1 倍，在培养基中稀释。然后，为了对细胞进行基于荧光的分类染色，在 PBS 中制备每毫升 5 微克的核染色剂和 5 微摩尔的死细胞染色剂。对于基于形态学的分类，在 PBS 中制备每毫升 5 微克核染色剂、5 微摩尔死细胞染色剂和 5 微摩尔细胞染色剂。
向每个孔中加入 20 微升染料溶液。然后，将样品在 37 摄氏度避光孵育 30 分钟。要获取图像，请使用 70% 乙醇擦拭板的底部并将板放入成像室中。
在 setup up 选项卡的 channel selection 下，单击加号按钮以将相应的通道添加到图像中。在布局选择下，每两微米设置一个测试图像的 z 堆栈，从 0 微米开始，到 20 微米结束，以确定焦点平面。单击每个通道下的快照以评估强度并优化曝光时间。
根据需要在 time （时间） 下输入更高或更低的值。细胞中的细胞核必须聚焦，以确保下游分析的准确性。在板示意图上，突出显示相应的孔。
然后在井示意图中，以类似的方式突出显示要成像的 25 个字段。在运行实验下，在板名称中标识板，然后单击开始按钮以 10 倍物镜运行图像采集协议，以在所选通道中生成灰度 TIFF 图像。安装开源软件 CellProfiler 和 CellProfiler 分析后，打开 CellProfiler，单击文件、导入、从文件导入管道，然后选择适当的文件。
选择基于荧光的分类流程，根据 EGFP 强度将细胞分类为 H3255 或 CCD19LU 并计算形态特征。单击 View output settings，然后选择要分析的图像文件的位置以及提取数据的目标。在运行分析之前，应在测试模式下测试协议以检查参数值。
细胞核和细胞分割准确很重要。该方案旨在识别具有不同细胞核染色的细胞，确保细胞核扩增的像素值足够大以掩盖具有最高 DNA 染色的细胞核，但又足够小以不掩盖周围的细胞核。要根据荧光对种群进行分类，首先，重新缩放 GFP 强度范围，然后测量每个已识别细胞核的 GFP 强度，并根据用户定义的阈值对对象进行分类。
接下来，单击 analyze images 开始分析。分析完成后，转到默认输出文件夹以查看计算数据。对于基于形态学的分类，在 Cell Profiler 中运行适当的方案以生成全细胞形态学特征。
打开 Cell Profiler 分析软件，选择在 Cell Profiler 中生成的数据库属性文件，然后单击，打开。单击屏幕左上角的 Classifier 选项卡。要从实验中调用随机单元格图像，请单击 fetch，图像将出现在未分类的窗口中。
通过选择单元格并将其拖动到相应的素材箱，手动将单元格分类为正或负，此处表示 H3255 或 CCD19LU。对每个亚群至少 50 个细胞进行分类后，单击 Train Classifier，然后单击 Check Progress。最后，单击 Score All 以生成一个表，其中包含每个子群体的单元格计数。
在 H3255 肿瘤和 CCD19LU 成纤维细胞的异细胞冷培养中，根据 DNA 染色鉴定和分割细胞核。通过人工诱导荧光或机器学习算法训练对细胞群进行分类，以根据形态差异识别细胞类型。基于荧光和形态学的方法之间存在高度一致性。
两种分类方法独立隐含于相同的图像，在未处理和处理的人群上分别有 97.4% 和 92.5% 的一致性。在这里，研究了细胞形态的变化和对厄洛替尼治疗的反应。药物治疗 3 天后，观察到 H3255 细胞的细胞核面积减少和细胞面积增加。
这可能是由于细胞死亡。为了测试 Erlotinib 是否对细胞有细胞毒性或细胞抑制作用，根据碘化丙啶染色鉴定死细胞。观察到厄洛替尼对 H3255 细胞的细胞毒性和细胞抑制作用，药物治疗后死亡人数增加，出生人数减少。
一旦掌握，如果执行得当，这种技术可以在两个非连续的小时内完成。按照此程序，可以执行其他方法，例如 RA 干扰或 CRISPR，以解决研究功能基因组学的其他问题。开发后，这项技术为癌症生物学领域的研究人员探索基质细胞对多种癌症类型肿瘤进展的影响铺平了道路。
观看此视频后，您应该对如何研究异细胞对环境刺激的反应有很好的了解，特别是如何以高通量方式分析基于显微镜的成像数据。
概述
本研究提出了一种新的协议，用于研究异质细胞群体在受到扰动时的动态行为。该方法利用基于成像的平台生成定量数据集，用于表征多种细胞表型。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 成像技术
- 群体动态学
背景
- 生理相互作用通常发生在多种细胞类型之间。
- 了解异质细胞如何响应环境压力是至关重要的。
- 该方法允许评估不同细胞群体之间的相互作用。
- 它可以应用于各种生物过程。
研究目的
- 定量评估异质细胞群体的动态表型反应。
- 在相同条件下区分不同亚群体。
- 使用特定细胞类型和处理方法演示工作流程。
使用的方法
- 细胞悬液的制备和接种的标准化。
- 使用特拉帕蓝进行细胞计数和自动分析。
- 使用厄洛替尼药物处理和荧光染色进行分类。
- 使用CellProfiler软件进行图像采集和分析。
主要结果
- 荧光和基于形态的方法之间高度一致。
- 未处理和处理过的群体的分类准确率分别为97.4%和92.5%。
- 成功识别和分割基于染色的细胞核。
结论
- 该协议有效地区分多种细胞类型。
- 它能够同时分析亚群体，包括出生率和死亡率。
- 该方法可以适应各种生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
