Name: 评估血脑屏障网状血管形成和破坏的体外测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 了解血脑屏障体外测定方法，用于研究屏障覆盖调控机制及病理条件下的破坏过程。该技术可揭示阿尔茨海默病等神经退行性疾病的病理机制，为开发治疗策略提供重要实验基础。

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Leon Tai 由伊利诺伊大学芝加哥分校的启动资金资助。

所有实验均遵循伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物护理和使用委员会的方案。
1. 常规准备
注意：人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）是一种经过广泛表征的永生化人脑内皮细胞系14,15,16,18,19. 将hCMEC/D3细胞培养于I型胶原（小牛皮，0.1%溶液以Hank's平衡盐溶液（HBSS）含Ca²⁺中1:20稀释）包被的组织培养瓶中2+ 和 Mg2+) 于含2-5%胎牛血清（FBS）、10%抗坏血酸、10%硫酸庆大霉素、25%氢化可的松以及每500 mL培养基中加入所提供的生长因子补充剂总体积的1/4的内皮细胞基础培养基（EBM-2）中培养［血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），参见 材料表]. 
注意：含胎牛血清和生长因子的 EBM-2 培养基称为 &#34;EBM-2 完全培养基&#34;不含FBS和补充剂的EBM-2 &#34;EBM-2 基础培养基&#34;。当 hCMEC/D3 细胞达到完全汇合时，其数量约为 1 x 105 细胞/厘米²2.
<ol>
	<li>以1:5的比例传代hCMEC/D3细胞，首先用不含Ca的HBSS孵育3分钟2+ 和 Mg2+ 随后用5 mL胰蛋白酶/EDTA（0.25%）消化5分钟。用EBM-2完全培养基以1:1比例中和胰蛋白酶，于4 °C、290 × g离心5分钟，弃上清液。将沉淀用EBM-2完全培养基重悬，并按1:5比例重新接种。</li>
	<li>根据供应商提供的方案培养原代人周细胞和星形胶质细胞[材料表将周细胞在含有胎牛血清和周细胞生长添加剂的周细胞基础培养基中进行培养。</li>
	<li>在含有星形胶质细胞生长因子的星形胶质细胞培养基中培养人星形胶质细胞。将周细胞和星形胶质细胞均接种于涂有3 mL多聚-L-赖氨酸（PLL）的组织培养瓶中以促进细胞贴壁，并使用第2至第5代的细胞进行实验。</li>
	<li>处死7只小鼠，用镊子取出脑干和小脑；将脑组织在纱布上轻轻滚动以剥离脑膜。在含有HEPES的最低必需培养基（MEM）中（每只脑组织使用5 mL），用无菌剃刀片在培养皿中将剩余的脑组织切碎。根据参考方案，从2月龄的C57BL/6J小鼠中分离原代小鼠脑微血管内皮细胞（BECs）。20.</li>
	<li>将剪碎的脑组织转移至15 mL锥形管中，在4 °C下以290 × g离心5 min。弃去上清液，将组织置于含有木瓜蛋白酶（每脑833.33 µL）和DNase（每脑41.7 µL）的溶液中，于37 °C水浴孵育1 h，以消化组织。</li>
	<li>依次使用19号和21号针头吹打匀浆液，按1:1比例加入22%牛血清白蛋白（BSA）溶液混匀，于4 °C、1360 x g离心10分钟。</li>
	<li>将所得沉淀重悬于1 mL EBM-2完全培养基中，于4 °C、290 × g离心5分钟。再次重悬于1 mL EBM-2完全培养基中，将细胞接种至经胶原蛋白包被的6孔板中（每孔1 mL，每孔约相当于1个脑组织）。</li>
	<li>24 小时后更换为含有 4 µg/mL 盐酸嘌呤霉素的 EBM-2 完全培养基；2 天后更换为 EBM-2 完全培养基。原代 BECs 的培养方式与 hCMEC/D3 细胞相同，在 1 × 105 细胞/厘米²2.</li>
	<li>在检测前24小时配制100 µM的oAβ。 
	注意：寡聚态Aβ（oAβ）被视为与疾病相关的Aβ形式。对于oAβ，应使用Dahlgren所描述的经过充分表征的制备方法。 等21.</li>
	<li>将基底膜储存液在4 °C条件下过夜解冻，分装至无菌PCR管条（每条8管），每管140 µL基底膜。将每条分装管条重新冷冻，并于-20 °C保存。在实验开始前24小时，将每块96孔板所需的一条管条在4 °C条件下解冻。预冷移液器吸头以防止液体凝固。 
	注意：所有对基底膜基质的操作均需在冰上进行，以避免其快速凝固。由于每次检测每孔使用10 µL基底膜基质，每条基质足以用于一块96孔板。</li>
	<li>在检测前24小时，将完全融合的BEC置于EBM-2基础培养基中孵育。 
	注意：其原理在于，EBM-2完全培养基含有促进细胞最佳生长的补充因子和胎牛血清（FBS）；然而，促进细胞生长的相同分子通路在有或无应激刺激的情况下，也对脑微血管内皮细胞（BEC）的覆盖和动态变化具有重要作用。因此，我们对BEC进行血清和补充因子饥饿处理，以减少细胞信号通路残余激活所带来的混杂效应。需要注意的是，在检测前中和胰酶消化的细胞时，细胞会短暂接触FBS（5分钟）。与BEC不同，由于周细胞和星形胶质细胞的生长需要不同的因子，且这些细胞类型在血清饥饿条件下相对不稳定（Tai实验室，未发表观察结果），因此不对其进行血清饥饿处理。 
	注意：在单层和三层共培养网状结构形成及破坏实验中，应使用EBM-2基础培养基。这一点至关重要，可防止混杂的应激因素或治疗相关信号干扰。</li>
</ol>
2. 网状结构形成与破坏实验
<ol>
	<li>单细胞BEC培养实验 
	注意：展示了三种不同的脑微血管内皮细胞（BEC）单层培养模式 图1A每种实验范式旨在评估脑微血管内皮细胞（BECs）在不同血管覆盖模型中的反应。范式1为网状结构形成。该范式用于考察应激因素和/或处理对血管生成及网状结构形成的影响。在0小时时间点，将BECs、寡聚化Aβ（oAβ）及处理因素同时加入培养板中。范式2为预防网状结构破坏。细胞在生长因子或药物存在下接种，并孵育4小时以形成类似网状结构。随后在4小时时间点加入应激因素（本实验中为oAβ）。该范式用于评估处理因素对预先形成的类网状结构抵抗应激因素诱导损伤的保护能力。范式3为网状结构破坏的同步处理。细胞接种后孵育4小时以形成类网状结构，随后在4小时时间点同时加入处理因素和oAβ，用于评估已形成的细胞网络对不同处理的响应能力。所有实验范式均遵循相似的基本步骤，仅在处理因素加入的时间点上有所不同。
	<ol>
		<li>在检测当天，将基底膜基质以每孔10 µL加入96孔板底部，37 °C孵育1小时使其凝固。</li>
		<li>重悬冻干的绿色细胞示踪染料（参见 材料表) 溶于10 µL DMSO中，配制10 mM的储备液，再用EBM-2基础培养基稀释至10 µM（1:1000）。吸除完全汇合的培养瓶中的培养液，更换为含绿色细胞示踪染料的EBM-2基础培养基（75 cm²培养瓶加入5 mL）2 烧瓶）。在开始检测前20分钟，用绿色细胞示踪染料对BEC进行预加载。</li>
		<li>将细胞在37 °C孵育20-30分钟，移除含细胞示踪染料的培养基，并按照步骤1.1所述方法消化细胞。用含10% FBS的EBM-2培养基中和，于4 °C以240 × g离心5分钟。将沉淀重悬于1 mL EBM-2基础培养基中。</li>
		<li>将BEC以每孔10,000个细胞的密度接种于96孔板中，使用EBM-2基础培养基（所有实验方案中的0小时时间点）。 
		注意：根据所采用的实验范式，需在指定时间点加入处理因素、应激刺激物或溶剂对照。在所有实验范式中，均需收集培养基用于后续分析例如 ELISA分析），并在24小时时用新配制的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定细胞。作为确定oAβ对网状结构形成作用的替代方法，可对本方案进行修改：先将融合的细胞培养瓶与oAβ预孵育，随后进行网状结构形成实验（含或不含oAβ）。 
		注意：所有实验组每孔终体积均为 70 µL。所有处理（oAβ、EGF、 等等。以1:20的稀释比例加入各自的孔中 即 每种处理3.5 µL。在范式1中，将细胞以63 µL/孔的细胞悬液加入，随后立即加入oAβ、所需处理物和对照物，每种各3.5 µL/孔，总体积为70 µL。在范式2中，加入63 µL细胞悬液和3.5 µL处理物（例如 在0小时时间点加入100 ng/mL EGF。孵育4小时后，加入3.5 µL的oAβ储备液（例如 对于最终oAβ浓度为100 nM的情况，加入3.5 µL的2 µM oAβ储备液。在范式3中，在0 h时间点加入63 µL细胞悬液，于4 h时每孔分别加入oAβ和所需处理物各3.5 µL，总体积为70 µL。这些体积可根据具体处理条件进行调整。例如，若仅需一种处理物，则可将细胞悬液体积调整为66.5 µL（保持每孔10,000个细胞），处理物体积仍维持3.5 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三重培养实验 
	注意：除了BEC的单层培养实验外，我们还建立了一种三重培养实验体系（图1B以确定预形成网络中的脑微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞对相关应激源的反应（例如oAβ）。在0 h加入所需处理因素并接种BEC。4 h时轻柔加入周细胞。7 h时加入星形胶质细胞，随后在11 h加入应激刺激。细胞继续孵育至24 h时间点。 
	注意：进行三重培养实验时，需注意时间安排，以确保所有细胞在同一时间达到融合状态。人星形胶质细胞和周细胞应在实验前1周开始培养，而hCMEC/D3细胞则需在实验前4-5天进行接种或传代。此外，应使用低代次（2-5代）的原代细胞，以避免表型漂移。
	<ol>
		<li>在开始实验前20分钟，将绿色细胞示踪染料工作液加入hCMEC/D3细胞中。将hCMEC/D3细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于EBM-2基础培养基中（0小时时间点）。所用体积为45 µL细胞悬液和3.5 µL处理剂即 终浓度分别为 50 ng/mL、100 ng/mL 或 1,000 ng/mL 的 EGF（来自浓度高 20 倍的储备液）。</li>
		<li>在37 °C孵育3.5小时后，向人原代周细胞中加入蓝色细胞示踪染料工作液（EBM-2基础培养基中含10 µM细胞示踪蓝色染料）。在4小时时间点（即与细胞示踪染料孵育约30分钟时），轻柔地将每孔2,000个周细胞以每孔6 µL的体积加入含有hCMEC/D3细胞的培养板中。</li>
		<li>在额外孵育2.5小时后（从0小时时间点起总计6.5小时），向人原代星形胶质细胞中加入橙色细胞示踪染料工作液（10 µM CellTracker Orange 溶于EBM-2基础培养基）。在7小时时间点，以12 µL体积将10,000个星形胶质细胞/孔轻轻加入培养板中。因此，内皮细胞：周细胞：星形胶质细胞的总体细胞比例为5:1:5。此时体系总体积达到66.5 µL。</li>
		<li>4小时后加入oAβ（100 µM母液3.5 µL）（从0小时时间点起共11小时）。</li>
		<li>13小时后，用新配制的4%多聚甲醛PBS溶液固定细胞。 
		注意：操作多聚甲醛时应穿戴防护服、手套和护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 定量分析
<ol>
	<li>使用解剖显微镜，在1.6倍放大倍数下，以50%的最大功率和2秒的曝光时间，拍摄96孔板每个孔的完整荧光图像。 
	注意：可使用等效显微镜；但必须完整捕获整个孔，以进行全面分析。</li>
	<li>进行定量分析时，使用ImageJ血管生成分析插件22处理图像，以量化分支数量、网状结构数量和细胞总长度（这些指标由软件自动统计），具体操作如下所述。该步骤的详细可视化流程见图2。
	<ol>
		<li>单击软件图标，打开Fiji ImageJ。</li>
		<li>单击工具栏末端的双红色前进箭头，然后单击 &#34;Angiogenesis Analyzer&#34;。</li>
		<li>选择包含图像文件的文件夹，单击 &#34;Open&#34;。</li>
		<li>当出现 &#34;分析设置&#34;对话框时，单击 &#34;OK&#34;。</li>
		<li>当出现 &#34;正在处理图像&#34;对话框（显示待处理图像数量）时，单击 &#34;OK&#34;。</li>
		<li>当出现 &#34;批量处理进度窗口&#34;对话框时，将显示预计处理时间。在此期间，程序将对分支数量、网状结构数量和细胞总长度等输出指标进行量化。 
		注意：所有图像完成量化后，结果文件将以电子表格文档形式保存在原始图像文件夹中。</li>
		<li>选择包含结果的电子表格文件，比较各组之间的分支数、网状结构数和细胞总长度。 
		注意：在三重培养实验中，进一步使用ImageJ分析周细胞/星形胶质细胞覆盖面积和数量。由不知分组情况的实验人员对图像进行阈值设定，并使用 &#34;analyze particles&#34; 功能获取定量结果。固定后的细胞和管状结构也可针对Aβ17或其他标志物进行免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer%27s+Disease+and+Vascular+Dementia%3A+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方法可用于解决围绕脑血管覆盖的若干基本生物学问题24。具体而言，这些方法能够识别在血管生成、肿瘤组织中的血管覆盖以及与脑相关的外周内皮细胞中发挥作用的受体和信号通路。例如血管生成生长因子受体、一氧化氮、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和钙信号通路25,26,27。hCMEC/D3 细胞系和原代脑微血管内皮细胞（BECs）适用于基因敲低技术，以促进此类研究18。通过使用所述方法培养来自完全性或内皮细胞特异性关键蛋白敲低小鼠的脑内皮细胞，可获得机制层面的深入认识。此外，三重培养实验可实现对星形胶质细胞和周细胞影响脑内皮细胞功能的深入分析。例如，周细胞和星形胶质细胞可通过分泌可溶性介质（e.g. 血管生成素、细胞因子）以及提供结构支持，影响网状样血管结构的形成24。
<p class="jov...

脑部毛细血管的血脑屏障（BBB）是血液与大脑之间最大的接触界面，在中枢神经系统（CNS）的稳态维持中起核心作用1,2。BBB处的动态过程可阻止血液中不需要的分子进入，清除中枢神经系统的代谢废物，向中枢神经系统输送必需的营养物质和信号分子，并调节神经炎症1,2,3,4,5。BBB损伤在衰老过程以及多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、多发性硬化症和脑卒中）中普遍存在1,2,3,4,5,6。因此，BBB功能障碍可能在神经退行性疾病中发挥关键作用，并可作为潜在的治疗靶点。
维持血管覆盖对于血脑屏障（BBB）的稳态功能至关重要。然而，关于神经退行性疾病过程中是否导致BBB覆盖增加或减少，体内（in vivo）与体外（in vitro）的研究数据存在矛盾6,7,8,9,10,11,12,13，尤其是在阿尔茨海默病（AD）中。因此，有必要开发基于相关细胞类型的体外（in vitro）模型，以评估并更全面地理解BBB覆盖的动态变化。脑毛细血管由星形胶质细胞、周细胞和脑微血管内皮细胞（BECs）组成3。这些细胞类型通过提供结构支持以及分泌血管生成生长因子、细胞因子和趋化因子等效应分子，以旁分泌和自分泌样方式共同参与BBB的功能调控。然而，BBB的主要效应细胞是BECs3。通常，评估BBB功能的细胞培养技术包括在滤膜插件上培养细胞后进行通透性检测，或在施加应激因素后检测关键BEC蛋白的表达水平14,15,16。尽管这些检测方法具有重要意义，但它们并未聚焦于脑血管覆盖情况。
本文详细阐述了我们之前的方法17，用于评估脑微血管内皮细胞（BEC）的覆盖率及网状结构，所用模型包括永生化人源BEC单培养、原代小鼠BEC单培养，以及一种人源化的BBB三重培养模型（包含BECs、星形胶质细胞和周细胞）。研究目的是证明寡聚化Aβ（oAβ）——一种被认为在阿尔茨海默病（AD）进展中起重要作用的因素——对BEC覆盖率的有害影响。表皮生长因子（EGF）所表现出的保护作用，凸显了该技术作为药物筛选工具的潜力。该技术在基础与应用研究中具有广泛的应用前景，包括：1）阐明特定信号通路在血管生成和血管覆盖率中的作用；2）评估与疾病和衰老相关因素对血管生成和血管覆盖率的影响；3）发现潜在的药理学靶点。

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 细胞</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，含钙、含镁、不含酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙、无镁、不含酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>EBM2 培养基中 SingleQuot 生长因子添加剂的终浓度</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% 胎牛血清（FBS）</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% 抗坏血酸</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% 硫酸庆大霉素</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% 氢化可的松</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>所提供的生长因子体积的 1/4：成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>盐酸嘌呤霉素</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶细胞解离系统（木瓜蛋白酶和 DNase1）</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>人周细胞</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>周细胞基础培养基</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>周细胞生长添加剂</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>人星形胶质细胞</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>星形胶质细胞培养基</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>星形胶质细胞生长添加剂</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel 生长因子减量型）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>血管生成用 m-板（96 孔）</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 绿色荧光染料</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 橙色荧光染料</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 蓝色荧光染料</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（Poly-l-lysine）</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管条</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Stereo Discover V.8 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

血脑屏障（BBB）的覆盖在中枢神经系统（CNS）稳态中起着核心作用。BBB由星形胶质细胞、周细胞和脑微血管内皮细胞（BECs）动态维持。本文详细描述了利用永生化人源BEC单培养、原代小鼠BEC单培养，以及人源化三重培养模型（BECs、星形胶质细胞和周细胞）评估BBB覆盖的方法。为了突出这些检测方法在疾病状态下的适用性，我们阐述了寡聚态β-淀粉样蛋白（oAβ）对BBB覆盖的影响，oAβ是阿尔茨海默病（AD）进展的重要因素。此外，我们利用表皮生长因子（EGF）来展示这些技术在药物筛选中的潜力。我们的结果显示，在基础条件下，单培养和三重培养的BECs均能形成网状结构，而oAβ会破坏这种细胞网络的形成，并导致已形成的网状结构退化，但EGF可阻断这一破坏作用。因此，本文所述技术对于解析调控BBB覆盖的基本机制及与疾病相关的过程具有重要意义。

在单层培养中，hCMEC/D3 细胞（图 3A）和原代小鼠脑微血管内皮细胞（BECs）（图 3B）均在整个孔板内形成类似网状的结构。这些结构的特征是由相互连接的节点构成的网状网络（图 3）。在所描述的所有实验模型中（图 1），对照组在培养 24 小时后均表现出相似的网状结构，形成约 20 个网状结构，总细胞长度约为 10,000 像素。
为了突出这些方法在疾病相关应激因子中的适用性，将寡聚化Aβ（oAβ）以两种实验模式添加至hCMEC/D3细胞和原代小鼠脑微血管内皮细胞（BECs）中。在细胞网状结构形成受干扰的模式（模式1）中，oAβ与细胞同时接种；在预先形成的网状结构受干扰的模式（模式2）中，oAβ在细胞接种后4小...

维持血脑屏障的完整性对于中枢神经系统的稳态至关重要。本方案描述了 体外 阐明调节血脑屏障覆盖的基本及病理过程的技术。

血脑屏障（BBB）的完整性在中枢神经系统（CNS）稳态中起核心作用。血脑屏障由……动态维持。

本实验的目的是剖析与疾病相关的过程在血脑屏障覆盖破坏中的作用，明确其潜在机制，并在体外测试潜在的治疗方法。该方法可回答血脑屏障及神经退行性疾病领域中的关键基础与应用研究问题。例如，通过探究与疾病相关的应激是否破坏已形成的网络结构，并鉴定其背后的信号通路。通过进一步筛选，可识别出能够防止应激诱导的血脑屏障破坏的治疗方法，为后续的体内测试提供依据。由于血脑屏障在认知功能中的稳态作用至关重要，该技术的应用前景可延伸至对阿尔茨海默病的机制理解与治疗。尽管该方法可为阿尔茨海默病中血脑屏障功能障碍提供见解，也可应用于其他伴有血脑屏障功能障碍的神经退行性疾病，如脑卒中。首先，以1:5的比例传代hCMEC/D3永生化内皮细胞：将细胞层在不含钙和镁的HBSS中孵育3分钟。然后使用5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA消化5分钟使细胞脱落。加入5毫升EBM-2完全培养基中和胰蛋白酶。收集细胞，在4°C下以290 × g离心5分钟。离心后弃去上清液，将沉淀用EBM-2完全培养基重悬。然后以1:5的比例重新接种细胞。为制备小鼠脑源性内皮细胞，使用镊子从小鼠（共7只，已实施安乐死）中取出脑干和小脑。通过在纱布上轻轻滚动大脑以去除脑膜。将脑组织放入含有HEPES的最低必需培养基（MEM）的培养皿中，使用无菌剃刀片切碎剩余脑组织。然后将切碎的脑组织转移至15毫升锥形管中，在4°C下以290 × g离心5分钟。去除上清液后，加入木瓜蛋白酶和DNase溶液，在37°C水浴中孵育1小时以消化组织。孵育结束后，使用19号针头吹打匀浆，再用21号针头进一步吹打。吹打完成后，加入等体积的22%牛血清白蛋白（BSA）溶液。在4°C下以1,360 × g离心10分钟。将所得沉淀用1毫升EBM-2完全培养基重悬，然后在4°C下以290 × g离心5分钟。离心后，再次使用1毫升EBM-2完全培养基重悬细胞，并以每孔1毫升的量接种至胶原包被的6孔板中。24小时后，更换为含有4 µg/mL盐酸嘌呤霉素的EBM-2完全培养基，继续培养细胞直至达到完全汇合（每平方厘米1 × 10⁵个细胞）。最后，在实验前24小时，将完全汇合的脑内皮细胞置于EBM-2基础培养基中孵育。实验当天，向96孔板的每孔中加入10 µL基底膜基质，于37°C孵育1小时使其凝固。将冻干的绿色细胞示踪染料溶于10 µL DMSO中，配制10 mM的储存液。用EBM-2基础培养基将该溶液稀释至10 µM。吸除含脑内皮细胞的6孔板中的培养基，更换为含绿色细胞示踪染料的EBM-2基础培养基。在37°C孵育20至30分钟。孵育结束后，吸除含细胞示踪染料的培养基，洗涤细胞层，并用胰蛋白酶消化使细胞脱落。使用含10% FBS的EBM-2培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至离心管中。在4°C下以240 × g离心5分钟。离心后，将细胞沉淀用1毫升EBM-2基础培养基重

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

评估血脑屏障网状血管形成和破坏的体外测定

本视频介绍了一种利用荧光素钠分子评估体外血脑屏障通透性的通透性检测方法。...

血脑屏障模拟物通透性检测：一种用于评估示踪分子在血脑屏障模拟物中通透性的体外检测方法

本视频展示了一种在体外评估小鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻（TEER）的方法。较高的TEER值表明内皮细胞连接完整，而加入活化的T细胞后TEER值降低，反映出连接屏障的破坏。...

评估体外血脑屏障模型中的跨内皮细胞电阻

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外...

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

此处，我们描述了一种人源血脑屏障模型，可用于研究淋巴细胞向中枢神经系统的跨膜迁移 体外.

使用淋巴细胞外渗分析 体外 人源血脑屏障模型

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。...

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。...

一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。...

利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

本方案演示了一种 体外 内皮细胞转胞吞实验作为一种模型，通过检测人视网膜微血管内皮细胞在小窝介导的跨细胞转运过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力，评估内层血-视网膜屏障的通透性。...

内皮细胞转吞作用检测方法作为一种 体外 评估内层血-视网膜屏障通透性的模型

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

了解血脑屏障体外测定方法，用于研究屏障覆盖调控机制及病理条件下的破坏过程。该技术可揭示阿尔茨海默病等神经退行性疾病的病理机制，为开发治疗策略提供重要实验基础。

体外检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

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体外 检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

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