Name: 调整在海马Theta乐队体外:从孤立的啮齿动物皮下注射电路记录的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习从啮齿动物脑分离完整海马制备并记录θ振荡的方法，结合场电位、单细胞及全细胞膜片钳技术与光遗传学刺激，深入探究学习与记忆相关的神经环路机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大卫生研究院和自然科学研究院资助。

所有操作均根据麦吉尔大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会批准的方案和指南进行。
1. 急性海马 体外 准备
注意：分离完整的海马组织包括三个主要步骤：（1）溶液与设备的准备，（2）海马的解剖分离，（3）建立快速灌流系统，以产生内在的θ节律振荡。在本实验方案中，从解剖到记录各步骤的时间控制尤为关键，因为分离的海马组织结构致密而脆弱，需维持其功能连接的完整性。 体外 需要格外谨慎。提前准备好所有物品，可尽早确保充分的灌注水平，从而最大限度地减少细胞损伤并维持生理功能。
<ol>
	<li>基于蔗糖的人工脑脊液（aCSF）溶液
	<ol>
		<li>配制用于解剖及解剖后孵育的1X储存蔗糖溶液。将表1中列出的所有组分（除CaCl2外）加入1 L去离子水中，4 °C保存，最长可保存2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准aCSF溶液
	<ol>
		<li>配制用于电生理记录期间对离体海马进行高流速灌注的标准aCSF。配制浓缩（5X）储存液aCSF时，将表2中列出的所有组分（除CaCl2外）溶解于2 L去离子水中，并于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备设备
	<ol>
		<li>开始解剖前，在实验台上准备好装有冰块的塑料托盘（30&#160;x 20&#160;x 5 cm）、连接碳合气（carbogen）的管路以及三个玻璃培养皿（10 x 2 cm）（见图1）。</li>
		<li>将300 mL蔗糖溶液（1X储存液）加入500 mL烧杯中，用碳合气（95% O2，5% CO2）持续通气，并加入Ca2+至终浓度1.2 mM。</li>
		<li>将60 mL上述蔗糖溶液转移至一个玻璃培养皿中，置于室温下备用；将其余溶液放入4 °C冰箱中冷却10–15分钟。</li>
		<li>在整个解剖过程中，持续用碳合气对冰冻的蔗糖溶液进行通气。</li>
		<li>将第二个培养皿（低温保存室）装入4 °C的蔗糖溶液，并置于冰上。</li>
		<li>向50 mL烧杯中加入30 mL冰冻的蔗糖溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 全海马体解剖
注意：分离海马体的解剖方法基本与最初建立并描述的方法22相同，但在灌注速率和记录技术方面增加了更多细节和改进。
<ol>
	<li>脑组织解剖
	<ol>
		<li>在通风橱内，将浸有1 mL 100%异氟烷的小片滤纸放入小鼠笼中，对小鼠（P20 - 35）进行麻醉。</li>
		<li>对麻醉后的小鼠断头，并迅速将其头部浸入盛有冰冻蔗糖溶液的50 mL烧杯中（约5秒），然后转移至滤纸上。</li>
		<li>使用解剖刀从尾侧向头侧做正中皮肤切口，将皮肤向两侧推开以暴露颅骨。</li>
		<li>用小剪刀剪开颅骨，用解剖铲迅速取出脑组织并放入含有冰冻蔗糖溶液的培养皿中。让脑组织冷却1-2分钟。</li>
		<li>在脑组织恢复期间，将2 - 3 mL蔗糖溶液滴加到置于冰上的、铺有镜头纸的解剖培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离海马体
	<ol>
		<li>将脑组织直立放置于解剖培养皿中。</li>
		<li>使用刀片去除小脑和额叶皮层，沿正中矢状面将脑组织切成两半，并将两个分离的半脑放回孵育室。继续恢复1 - 2分钟。</li>
		<li>将单个半脑直立放置于解剖培养皿中。</li>
		<li>旋转培养皿，使正中矢状结构面向观察者，可见位于丘脑前方的隔区复合体呈薄的梨形组织轮廓。</li>
		<li>用微型解剖铲固定半脑，将聚四氟乙烯（PTFE）涂层解剖铲的小端紧贴隔区后方（尾侧）放置。</li>
		<li>将涂层解剖铲插入隔区下方，并将铲尖向下移动至接触解剖培养皿，切断隔区尾侧连接的纤维。沿隔区前缘重复相同操作，切断与脑前部相连的纤维。</li>
		<li>用解剖铲轻轻托住海马体上方皮层内侧部分并保持直立，使用微型解剖铲小心向下牵拉丘脑、下丘脑及残余脑干核团，再用解剖铲切断并移除被牵拉出的组织。</li>
		<li>将分离的半脑侧放，辨认海马体的轮廓。</li>
		<li>将涂层解剖铲插入侧脑室，置于背侧海马体前端下方。</li>
		<li>保持解剖铲与半脑正中矢状面水平对齐，沿脑室壁平滑滑动，直至铲尖从尾侧穿出。</li>
		<li>将解剖铲置于海马体下方，轻压连接纤维，位置位于海马体与覆盖皮层交界处的内层；在该层外侧使用微型解剖铲，与下方的涂层解剖铲相对滑动，切断连接纤维。</li>
		<li>完成提取时，旋转解剖培养皿，将涂层解剖铲插入腹侧海马体下方。用解剖铲轻托皮层褶皱内侧，同时以切割动作配合微型解剖铲切断内嗅区连接。 
		注：可通过将涂层解剖铲置于整个海马体下方，拉出其下方残余脑组织，从而完整移除整个隔-海马复合体。</li>
		<li>分离完成后，将海马体静置于培养皿中，并滴加一滴冰冻蔗糖溶液以保持低温。仔细修剪残留的皮层和纤维，并用刀片轻轻沿穹窿切开，将海马体与隔区分离。 
		注：若需对锥体细胞进行膜片钳记录（见第4.6节 光遗传学控制），可将分离的海马体以45°角进行横向切割，暴露CA1区的锥体细胞层（&#34;斜切&#34;制备），此操作不会破坏海马体剩余部分的局部神经网络回路。</li>
		<li>将制备好的组织转移至室温蔗糖溶液中，恢复15 - 30分钟后，再转移至记录室。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 建立快速灌流系统以记录离体海马
<ol>
	<li>建立重力驱动的灌流系统，以实现含氧人工脑脊液（aCSF）在 20 - 25 mL/min 范围内的持续高速流入。
	<ol>
		<li>提前准备好 aCSF (1X) 烧瓶，并在实验开始前至少 15 分钟将其浸入温水浴（约 30 °C）中。打开管路加热系统（30 °C）。</li>
		<li>使用连接至碳酰气（carbogen）气罐的水族箱气泡器和管路，在整个实验过程中对 aCSF 进行氧合，并在灌流开始前加入 CaCl2 [2 mM]。</li>
		<li>暂停 aCSF 流动，用玻璃移液管的宽口端将海马体转移至记录室。让蔗糖饱和的脑片自然下沉并稳定在底部。</li>
		<li>将脑片置于记录室中央（与进-出液轴对齐），使 CA1 和 SUB 区的平滑面朝上。用小重物在 septal 和 temporal 两端固定海马体，然后重新启动 aCSF 流动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 离体海马中的电生理学
<ol>
	<li>细胞外记录 体外 海马θ振荡
	<ol>
		<li>用于局部场电位（LFP）或单个神经元活动的细胞外记录监测 体外 分离的海马，使用充满人工脑脊液（aCSF）的玻璃微电极（1 - 3 MΩ）。采用增益为1000的膜片钳放大器记录低噪声交流耦合场电位信号，在线带通滤波设置为0.1 - 500 Hz，采样率为5 - 20 kHz。 
		注意：本方案中使用的定制显微镜配备低倍（2.5X）和高倍（40X）物镜，用于海马体的低倍视野观察，同时具备红外视频显微成像和落射荧光功能，以实现单细胞识别。该系统组件包括直立式荧光显微镜、荧光滤光片组、模拟视频相机、配备成像软件的数字图像采集卡，以及置于载物台上的定制灌流腔室（图2A，插图i）用于神经元记录和光纤定位的高精度微操作器。</li>
		<li>使用安装在显微镜上并连接至计算机显示器的相机，在低倍放大（2.5倍）下检查海马组织切片，快速确认是否存在切割不足或组织外表面损伤。应能观察到沿CA1区光滑表面呈对角线走向的束层纤维。图2A，插图ii）在透过海马体照射透射光时。</li>
		<li>使用低倍广视野物镜观察分离的海马体以及局部场电位电极在特定记录位置的放置情况。 
		注意：图中展示了在不同记录位置放置了多个电极的离体海马组织制备示意图 图2A.</li>
		<li>将LFP电极缓慢放入浴液中，直至接触CA1区表面（alveus）。 
		注意：这通常会在交流耦合记录中产生一个快速的瞬时信号，类似于电极接触记录介质时发生的情况。在此步骤之后，可使用音频监视器监听LFP通道信号。 
		注意：通常情况下，早期电活动信号在10至15分钟后才会出现，因此在制备过程中不宜过快推进。若经过该时间段后，表面LFP电极仍未记录到任何活动信号，可进一步缓慢穿过 oriens 层，并在推进过程中周期性暂停，观察在接近主细胞层时是否出现任何类型的电活动。若再经过5至10分钟仍无信号被检测到，应小心回撤电极，并将其重新放置于同一区域的其他位置。</li>
		<li>将LFP电极推进至锥体细胞层。观察到随着单个神经元（主要是锥体细胞和抑制性篮状细胞）的放电被检测到，细胞外锋电位活动最初增加。继续降低电极，当电极尖端进入辐射层时，锋电位活动开始再次减弱。当记录位置穿过辐射层下行时，可观察到清晰可见的theta频段（4 - 12 Hz）网络振荡逐渐显现，并达到最大振幅（约100 - 300 µV）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单个脑区内的θ振荡
	<ol>
		<li>为检测CA1区自发θ振荡的空间特性，将参考LFP电极尖端置于内侧CA1位点（位于纵向隔颞轴的内侧），并如前所述将其缓慢插入辐射层。</li>
		<li>将第二个LFP电极置入CA1区域（距第一个LFP电极200–800 µm的隔侧或颞侧位置），观察CA1θ振荡可在相对较远距离上实现同步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>跨层的θ振荡
	<ol>
		<li>为检测海马各层中θ振荡的特性，将一个参考LFP电极留置于CA1辐射层位点。从最靠近锥体细胞层的最上层（stratum oriens）开始，将第二个电极向下插入锥体细胞层，并继续穿过辐射层。观察LFP信号在锥体细胞层上下逐渐发生的反转现象（相对相位反转）。

关键词：θ振荡，海马，LFP，锥体细胞层，辐射层，stratum oriens，相位反转 
		注意：有关此类活动的代表性示例，请参见 图2B之前已发表过展示分离海马体中相位反转位点的层流/深度分布图及电流源密度（CSD）分析示例。23,24,25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完整海马体中的伽马振荡及theta-伽马耦合
	<ol>
		<li>将场电极置于CA1/SUB边界处，并缓慢下放，直至其位于锥体细胞层与分子层之间的界面。在此位置可记录到场电位，其表现出清晰的伽马振荡，且振幅变化与局部θ节律呈相位锁定关系。24调整比例以观察theta-γ耦合的慢时间尺度。注意，γ爆发出现在两个不同的频带中，可通过在慢γ（25 - 50 Hz）和快γ（150 - 250 Hz）范围内对持续的局部场电位（LFP）信号进行带通滤波来揭示（参见 图 2C 用于代表性过滤后轨迹图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞膜片钳记录期间 体外 海马θ振荡 
	注意：在本实验步骤中，目标是通过对表达荧光蛋白tdTomato的转基因PV-TOM小鼠的离体海马组织进行记录，获得视觉引导下的鉴定型中间神经元全细胞膜片钳记录。该小鼠中tdTomato的表达受PV启动子调控（更多细节参见材料部分及参考文献）。 26).
	<ol>
		<li>使用荧光视频显微镜，以低倍（2.5X）和高倍（40X）放大观察来自PV-TOM小鼠的海马组织切片表面附近的tdTomato阳性中间神经元图3）。需要注意的是，虽然PV-TOM神经元可以通过alveus层成功地进行荧光标记和膜片钳靶向（深度可达100 µm），但在采用斜切法（angled-cut technique）制备海马组织时（见第2.2.14节注释），非荧光的锥体细胞也能够相对容易地被触及。</li>
		<li>在低倍镜下观察海马体，将LFP电极置于CA1/SUB区域以监测theta振荡，同时准备进行膜片钳实验。</li>
		<li>切换至40倍放大倍数，将物镜浸入目标区域上方；缓慢降低物镜直至顶层结构可见。调整显微镜位置，确保对侧有足够开放空间以便膜片钳电极从对侧接近。</li>
		<li>在荧光显微镜下，选择一个荧光标记的 PV-TOM 细胞，并用充满标准细胞内溶液的膜片钳电极（2 - 3 MΩ）接近该细胞。</li>
		<li>使用吹嘴对移液管施加轻微的正压，并在将电极降低至细胞表面时监测电阻变化。当移液管尖端接触目标细胞时，移液管电阻升高，同时由于正压作用于细胞膜而出现明显的凹陷。释放正压，观察电流脉冲是否变平，以确认封接开始形成。立即钳制至超极化电位（-70 mV），当达到吉欧姆（GΩ）级封接后，通过移液管持夹施加少量负压以破裂细胞膜。</li>
		<li>形成全细胞记录构型后，检测鉴定出的PV细胞在海马区自发振荡期间的生理特性（图3B).</li>
		<li>观察到PV细胞的细胞内膜电位记录表现出快速放电特性，且动作电位簇与持续存在的CA1/SUB θ节律同步。</li>
		<li>切换至电压钳模式，将细胞钳制在不同的膜电位，以表征由内在节律性活动产生的兴奋性与抑制性突触电流的比值。下图显示了来自锥体细胞的膜片钳记录示例。 图3A 用于比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离体海马中的光遗传学控制 
	注意：为实现对海马神经网络活动的光遗传学控制，此处采用一种细胞类型特异性的策略，即对含PV的GABA能细胞进行节律性激活，因为这些细胞在离体海马中被证明对主神经元群体的同步化起着重要作用。25通过将PV-Cre小鼠品系与组成型Cre依赖性表达通道视紫红质-2（ChR2）的小鼠（Ai32）杂交，可实现ChR2在PV细胞中的特异性表达，从而获得PV-ChY小鼠。 Alternatively, viral vector constructs (例如，可将 AAVdj-ChETA-eYFP 注射至 PV-Cre 或 PV-TOM 小鼠（P15–16）的海马体，以驱动 CA1/SUB 中间神经元中兴奋性视蛋白的表达（图 4A). 
	注意：该策略此前已有描述25.
	<ol>
		<li>在表达蓝光敏感型兴奋性视蛋白ChR2的PV中间神经元小鼠的离体海马中，将LFP电极置于CA1/SUB区域，并对附近的一个锥体细胞进行膜片钳记录。</li>
		<li>将光纤导光束（直径0.2 - 1 mm）置于海马组织制备物上方，并使其对准记录区域。使用LED光源发出的蓝光（473 nm）进行光遗传学刺激，刺激方式包括光脉冲（10 - 20 ms，由晶体管-晶体管逻辑信号触发）或在θ频率范围（4 - 12 Hz）内施加的正弦波电压指令。 
		注意：基于LED的定制光刺激装置已在其他地方描述过25.</li>
		<li>切换到电流钳模式，表征锥体细胞在自发θ振荡期间的活动特性。</li>
		<li>启动刺激程序并记录光反应。观察到在光遗传学刺激过程中，所记录神经元的场振荡和突触活动逐渐趋于同步，且对PV细胞进行节律性驱动可有效调控theta振荡的频率和功率。图4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid+Cells+and+Place+Cells%3A+An+Integrated+View+of+their+Navigational+and+Memory+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function.</a> Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).</li>
<li>O'Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Winson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+hippocampal+theta+rhythm+results+in+spatial+memory+deficit+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat.</a> Science. 201 (4351), 160-163 (1978).</li>
<li>M'Harzi, M., Jarrard, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+selection+in+a+task+with+spatial+and+nonspatial+components%3A+effects+of+fimbria-fornix+lesions+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neural+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats.</a> Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).</li>
<li>Osipova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+and+gamma+oscillations+predict+encoding+and+retrieval+of+declarative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory.</a> J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).</li>
<li>Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+the+rabbit%27s+septum+as+a+relay+station+between+the+midbrain+and+the+hippocampus.+II.+The+differential+influence+of+drugs+upon+both+the+septal+cell+firing+pattern+and+the+hippocampus+theta+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).</li>
<li>Mitchell, S. J., Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+theta+rhythm+in+medial+entorhinal+cortex+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats.</a> Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).</li>
<li>Alonso, A., Garcia-Austt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+theta+rhythm+in+the+entorhinal+cortex+of+the+rat.+I.+Laminar+distribution+of+theta+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials.</a> Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).</li>
<li>Vertes, R. P., Kocsis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem-diencephalo-septohippocampal+systems+controlling+the+theta+rhythm+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus.</a> Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).</li>
<li>Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+records+of+carbachol-induced+theta+rhythm+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices.</a> Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).</li>
<li>Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+neuronal+activity+in+hippocampus+by+individual+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons.</a> Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).</li>
<li>Williams, J. H., Kauer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+carbachol-induced+oscillatory+activity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus.</a> J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).</li>
<li>Chapman, C. A., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+theta-frequency+oscillations+in+hippocampal+inhibitory+interneurons+and+pacing+of+pyramidal+cell+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing.</a> J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).</li>
<li>Strata, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillations+in+CA3+hippocampal+pyramids%3A+physiological+relevance+to+theta+rhythm+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation.</a> Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).</li>
<li>Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+multiple+theta+generators+in+the+hippocampus%3A+a+partial+coherence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis.</a> J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).</li>
<li>Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+oscillations+in+the+hippocampal+slice+in+the+slow+%280.5-2+Hz%29%2C+theta+%285-12+Hz%29%2C+and+gamma+%2835-70+Hz%29+bands%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands.</a> Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).</li>
<li>Gillies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+atropine-resistant+theta+oscillations+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1.</a> J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands%3A+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li>
<li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li>
<li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li>
<li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li>
<li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens%2FAlveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li>
<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
<li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations%3A+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性的商业或财务利益。

尽管对急性海马脑片进行电生理记录是一种标准的体外技术，但本文所介绍的方法与经典方法存在显著差异。与能够直接观察表面特定细胞层的薄切片制备不同，完整的海马制备更接近于体内结构，电极需穿过各个细胞层，逐步插入目标脑区。该方法在保留海马完整性的同时，也维持了局部神经元群体的功能连接性和生理特性，从而为研究海马中小规模和大规模神经网络振荡提供了一个复杂而有力的工具。例如，网络中预设的环路结构与特定细胞类型的特性共同作用，可自发产生内在的θ波和γ波节律性振荡，模拟了海马体内活动的重要特征。通过本实验方案所述方法，可快速从啮齿类动物脑中分离海马组织，并在快速灌流的人工脑脊液（aCSF）环境中维持数小时的活性。研究人员可直接应用基础电生理技术，探究特定神经元类型的同步活动和突触功能如何影响海马网络的动力学行为。
我们的实验程序首次提供了系统研究海马体全段隔颞（背腹）轴上局部场电位振荡动态特性的机会 in vitro（参见参考文献22,<sup class=...

海马θ振荡（4 - 12 Hz）是哺乳动物大脑中最显著的节律性活动形式之一，被认为在认知功能中发挥关键作用，例如时空信息的处理以及情景记忆的形成1,2,3. 尽管有几种 体内 强调theta调制的位置细胞与空间导航之间关系的研究、损毁研究以及临床证据均支持海马theta振荡参与记忆形成的观点4,5,6，与海马theta振荡产生相关的机制仍未完全阐明。早期 体内 研究表明，θ活动主要依赖于外在振荡器，特别是来自隔区和内嗅皮层等传入脑结构的节律性输入7,8,9,10内在因素的作用——即海马神经网络的内部连接性以及海马神经元的特性——也被推测可能参与其中，其依据来源于 体外 观察11,12,13,14,15,16,17,18然而，除了少数几项具有里程碑意义的研究外19,20,21，开发能够模拟生理条件下真实群体活动的简单方法存在困难 体外 脑片制备长期以来阻碍了对海马体及相关区域内在自我生成能力的更深入实验研究&#160;θ振荡
标准方法的一个重要缺点 体外 薄片实验条件的一个局限在于，脑结构的三维细胞与突触组织通常会受到破坏。这意味着，基于空间分布的细胞集群所介导的多种协同性网络活动将受到影响，这些活动的范围从小范围的局部集群（≤1毫米半径）到跨一个或多个脑区的神经元群体均包括在内。&#62;1 毫米）的支持。鉴于这些因素，需要采用一种不同的方法来研究海马体中θ振荡的产生机制及其向相关皮层和皮层下输出区域的传播方式&#160;结构
近年来，初步开发的 &#34;完全的隔-海马&#34; 用于研究两个结构之间双向相互作用的制备方法22，以及随之而来的演化 &#34;分离的海马体&#34; 制备过程中，已发现海马体内在θ振荡可在缺乏外部节律性输入的情况下自发产生23这些方法的价值在于最初的洞察：为了发挥theta节律发生器的功能，这些区域的整体功能结构必须得以保留 体外22.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; - 磷酸二氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>脑组织提取</td></tr><tr><td>4号手术刀柄，14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>脑组织提取</td></tr><tr><td>平头直镊（11 cm）</td><td>WPI</td><td>500456</td><td>脑组织提取</td></tr><tr><td>Paragon 不锈钢手术刀片 #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>脑组织提取</td></tr><tr><td>精细弯头解剖剪刀</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>脑组织提取</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）涂层薄刮刀</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>Hayman 型微型刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>实验室小勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>滴管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>镜头纸（4 x 6&quot;）</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>玻璃培养皿（100 x 20 mm）</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>冰用塑料托盘；尺寸 30 x 20 x 5 cm</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>海马组织制备</td></tr><tr><td>单通道串联溶液加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>水族箱用曝气石</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 管（内径 1/16，外径 1/8）</td><td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>电热锅</td><td>Black &amp;amp; Decker</td><td>n.a.</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体混合物（碳合气）&amp;nbsp;</td><td>Vitalaire</td><td>SG466204A</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>玻璃瓶/烧瓶（4 x 1 L）</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>灌流系统</td></tr><tr><td>浸没式记录室</td><td>定制设计（FM）</td><td>n.a.</td><td>可使用商用替代品</td></tr><tr><td>玻璃移液管（1.5/0.84 外径/内径（mm））</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz 噪声消除器</td><td>Quest Scientific</td><td>Q-Humbug</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 膜片钳放大器</td><td>Molecular devices</td><td>MULTICLAMP</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Commander 程序</td><td>Molecular devices</td><td>MULTICLAMP</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>数模转换器</td><td>Molecular devices</td><td>DDI440</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Molecular devices</td><td>PCLAMP10</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>防震台&amp;nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>显微操作器（手动）</td><td>Siskiyou&amp;nbsp;</td><td>MX130</td><td>电生理学（LFP）</td></tr><tr><td>显微操作器（自动）</td><td>Siskiyou&amp;nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>电生理学（膜片钳）</td></tr><tr><td>音频监测器&amp;nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3300</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>微移液管/膜片钳移液管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>电生理学</td></tr><tr><td>定制直立式荧光显微镜</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.</td><td>成像</td></tr><tr><td>模拟视频摄像机</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>成像</td></tr><tr><td>带成像软件的数字图像采集卡</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>成像</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X 物镜</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>成像</td></tr><tr><td>Olympus 40X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>成像</td></tr><tr><td>定制LED光源系统&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td>n.a.</td><td>光遗传学刺激（Amhilon et al., 2015）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 008069</td><td>允许&amp;nbsp;在PV中间神经元中进行Cre介导的基因表达</td></tr><tr><td>组成型-条件型 Ai9 小鼠（R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)）</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock number 007905</td><td>在Cre介导的重组后表达TdTomato</td></tr><tr><td>Ai32 小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock&lt;br/&gt; number 012569</td><td>在Cre重组酶作用后表达改良的通道视紫红质-2/EYFP融合蛋白</td></tr><tr><td>PVChY 小鼠</td><td>本实验室繁育</td><td>n.a.</td><td>通过将PV-Cre品系与Ai32小鼠（R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP）杂交获得的后代</td></tr></tbody></table>

调节海马θ节律频段 体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

本方案概述了制备和记录野生型及转基因小鼠离体全海马组织的实验步骤，以及近期在方法学和θ振荡研究应用方面的改进。本文介绍了一种简单的离体海马组织表征方法，通过该方法可同时研究海马内部θ振荡发生器之间的关系，以及齿状回-1区（CA1）和下托（SUB）区域锥体细胞与GABA能中间神经元的活动。总体而言，我们证明离体海马组织能够在体外（in vitro）产生内在的θ振荡，并且可通过光遗传学刺激小清蛋白阳性（PV）中间神经元，精确调控海马内产生的节律性活动。in vitro离体海马制备技术为同时进行场电位记录和全细胞膜片钳记录提供了独特的机会，结合视觉识别的神经元，有助于深入理解θ节律生成的潜在机制。

本部分展示了通过研究小鼠离体海马组织中θ振荡所能获得的结果示例 体外分离海马体的解剖操作步骤如图所示 图1利用该制备方法，可在放置多个场电极的同时检测离体海马不同区域和层次神经元群体的整体活动以及同步突触输入，从而研究内在的θ振荡图2). 同时进行的全细胞膜片钳与细胞外记录的代表性结果被用于表征特定细胞类型在海马区自发θ振荡期间的放电特性及突触特性图3），以及在对节律性活动进行光遗传学操控期间（图4).
<img alt="解剖过程、手术工具使用；实验室设置、实验操作；组织学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55851/55851fig1.jpg...

本文介绍了一种从离体全海马组织中记录节律性神经元网络theta和gamma振荡的实验方案。我们详细描述了从海马提取到局部场电位、单细胞单位放电以及全细胞膜片钳记录的实验步骤，同时涵盖了theta节律的光遗传学调控方法。

本方案概述了从野生型和转基因小鼠分离的完整海马体进行制备和记录的实验步骤，以及近期……

本方案的总体目标是介绍提取完整海马组织并利用场电位记录、单细胞记录和膜片钳记录以及光遗传学刺激来研究神经元网络节律性活动产生机制的操作步骤。该方法通过显著促进对海马节律性振荡所依赖的细胞和突触机制的研究，有助于解答学习与记忆神经科学领域的关键问题。该技术的主要优势在于采用优化的制备方法，以深入研究在依赖海马的记忆信息处理中起关键作用的精细振荡回路。开始此操作时，将脑组织以直立位置放置在解剖皿中，用剃刀片去除小脑，然后沿正中矢状面将脑组织切成两半，并将分离出的两个半脑重新放回孵育腔室中。接着，将单侧半切脑组织直立放置于解剖皿上。旋转解剖皿，使正中矢状结构面向实验操作者，并使位于丘脑内侧的隔区复合体轮廓清晰可见，呈现为一层薄的梨形组织结构。然后，将涂覆过的解剖刀插入隔膜下方，刀尖向下移动直至触及解剖皿，温和切断连接隔区的纤维。接着，沿隔膜前缘重复相同操作，切断与大脑额叶部分相连的纤维。用解剖刀轻轻托住海马上方皮层内侧区域，使其保持直立位置，再使用显微解剖刀小心向下牵拉丘脑、下丘脑及残留的脑干核团。随后，使用刮铲切断并移除牵拉出的组织。接着，将涂覆过的刮铲插入背侧海马体前端下方的侧脑室。保持刮铲水平，与半脑的正中矢状面齐平，并沿脑室壁的平滑轮廓推进，直至刮铲尖端顺利露出。将解剖刀置于海马下方，轻轻按压海马与覆盖皮层连接处的内侧纤维层；随后，将微型解剖刀置于该层外侧，紧贴已涂覆的解剖刀进行推切，以切断连接纤维。为完成提取，旋转解剖皿，将涂覆的解剖刀插入腹侧海马下方。用解剖刀轻托海马，以推切动作沿解剖刀边缘切断内分泌连接。分离完成后，将海马体置于培养皿上静置，并滴加一滴冰冷的蔗糖溶液以保持低温。仔细修剪掉残留的皮层和纤维，并用刀片轻轻沿穹窿部位将海马体与隔区分离。随后，将组织转移至室温蔗糖溶液中，静置恢复15至30分钟，再移入记录舱。在此步骤中，搭建重力灌注系统，以实现含氧人工脑脊液（ACSF）的持续高速流入。接着，停止ACSF流动，使用玻璃移液管的宽口端将海马转移至记录室。让蔗糖饱和的制备物自然沉降至底部并稳定下来。将制备好的脑片置于记录室中央，使CA1区和下托的光滑表面朝上。用小重量夹子固定海马的隔端和颞端，并重新启动人工脑脊液（ACSF）灌流。在此步骤中，将局部场电位（LFP）电极缓慢下降至海马表面。将LFP电极穿过参数层，观察到细胞外放电活动增加，表现为检测到单个神经元的单细胞放电。继续降低电极，当电极尖端进入辐射层时，放电活动再次逐渐减弱。随着记录位置在辐射层中进一步降低，可观察到清晰可见的、处于theta频率范围的网络振荡，其振幅逐渐增大并达到最大值。为了检测CA1区自发θ振荡的空间特性，将第二个局部场电位（LFP）电极置入CA1区域的另一位置，并观察CA1区θ振荡在大范围距离上的同步性。为了检测海马各层之间θ振荡的特性，将一个参考LFP电极保留在CA1辐射层（radiatum）位置。从最上层的锥体细胞层（stratum oriens）上方开始，将第二个电极逐步下移，穿过锥体细胞层，并继续穿过辐射层。观察局部场电位信号在颗粒层中的逐渐反转现象。为了检测完整海马体中的伽马振荡及theta-gamma耦合，将场电极置于CA1区与下托交界处，并缓慢下放，直至其位于颗粒层与分子层之间的界面。在此位置，可记录到表现出清晰伽马振荡的场电位，其振幅变化与局部theta节律相位锁定。然后，调整比例以观察theta-gamma耦合的慢时间尺度。注意，gamma爆发出现在两个不同的频带，可通过在慢gamma和快gamma范围内对持续的局部场电位（LFP）信号进行频带分析揭示。在体外海马theta振荡期间进行全细胞膜片钳记录时，应使用荧光视频显微镜结合低倍和高倍放大，以观察位于PV tom小鼠海马组织切片表面附近的tdTomato阳性中间神经元。在低倍镜下观察海马体，将LFP电极置于CA1下托区以监测theta振荡，同时准备进行膜片钳实验。随后切换至40倍物镜，将物镜浸入目标区域上方，缓慢下降直至在荧光显微镜下可见表层结构，选择发出荧光的PV汤姆细胞，并用内含标准细胞内液的膜片钳移液管接近该细胞。形成全细胞记录构型后，在海马区自发振荡期间检测所鉴定的PV细胞的生理特性。观察来自PV细胞的细胞内膜电位记录，这些细胞表现出快速放电特征，并且其动作电位簇与持续的CA1下托区θ节律同步。在此操作中，将局部场电位（LFP）电极放置于小鼠离体海马CA1下托区域，同时对附近表达蓝光敏感性兴奋性视蛋白CHR2的PV中间神经元进行膜片钳记录。将光纤导光管置于海马组织制备物上方，并使其对准记录区域。使用LED光源发出的蓝光进行光遗传学刺激，刺激参数为持续10至20毫秒的光脉冲或以θ频率递送的正弦波电压指令。在电流钳模式下，表征记录细胞在自发θ振荡期间的活动特性。然后，启动刺激程序并记录光反应。观察到在光遗传学刺激过程中，场振荡、突触活动以及记录到的神经元逐渐趋于同步，且对PV细胞进行节律性刺激可有效调控theta振荡的频率和功率。此处展示的是在theta振荡期间从一个颗粒细胞记录到的电生理活动。电流钳记录显示，静息状态下存在自发但非节律性的放电活动，以及抑制性突触后电位，这些电位与缓慢出现的局部场电位振荡未表现出明显的同步性。电压钳记录表明，相应的抑制性突触后电流的反转电位约为负70毫伏。此处为在θ振荡期间记录到的快速放电型荧光标记PV中间神经元的电生理活动。在电流钳模式下，该细胞在静息状态下可自发放电，并受到与稳定的局部场电位（LFP）振荡相位锁定的节律性兴奋性突触后电位的强烈驱动。在电压钳记录中，兴奋性突触后电流的反转电位约为0毫伏。一旦掌握该技术，可在两到三小时内完成操作；在进行该实验时，务必注意对溶液进行充分氧合，并在电生理记录期间使用灌流系统，使加氧人工脑脊液（ACSF）以高速但稳定的方式流经组织标本。在完成该操作后，可结合其他方法，例如对特定细胞类型群体进行光遗传学刺激或抑制，以回答更多科学问题，如鉴定海马中形成θ振荡器的细胞亚型。该技术建立后，为神经科学研究领域的学者提供了在体外系统性探究海马沿隔颞轴向θ振荡动态特性的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备完整的海马组织，以便通过场电位记录、单细胞单位放电记录和膜片钳记录，结合光遗传学刺激，深入研究节律性神经网络的功能。

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

调整在海马Theta乐队<em&gt;体外</em&gt;：从孤立的啮齿动物皮下注射电路记录的方法

本视频展示了一种在遗传工程小鼠模型中通过光敏离子通道调控其GABA能内侧隔核神经元θ振荡的实验方案。通过向海马体传递光脉冲，该方案旨在同步神经元活动并产生θ振荡，并以局部场电位的形式进行记录。...

选择性调控小鼠模型中的θ振荡

本视频演示了一种在大鼠海马脑片上记录CA3-CA1突触反应的方法。该方法概述了将刺激电极和记录电极放置于海马脑片上的步骤，并通过测量场兴奋性突触后电位（fEPSP）来评估突触反应强度。...

记录大鼠海马脑片中CA3-CA1突触反应

本视频展示了在小鼠模型的海马体中进行立体定位植入金属丝电极阵列和光学纤维的操作过程。...

将电极阵列和光纤植入小鼠海马体

本视频展示了在离体海马组织中记录节律性神经元网络活动（也称为θ振荡）的方法。通过将电极插入不同的层次和空间位置，以检测和分析θ振荡，从而揭示海马不同层次中神经元组成的特异性以及神经网络之间的连接性。...

小鼠海马体中θ振荡的体外记录

本视频展示了利用光遗传学方法，通过激活小鼠脑切片中经基因改造的光敏感性中间神经元，调控海马网络动态，增强θ振荡同步性，并研究神经环路行为的技术流程。...

光遗传学调控海马网络动态

海马体中的θ活动与特定的认知和行为阶段相关。本文介绍一种利用时频分析方法检测海马体内高度有序θ振荡的分析技术。即，...

小鼠脑电图中高度有序θ振荡的自动检测

我们描述了在行为小鼠中利用光遗传学和电生理记录技术选择性操控海马θ振荡（5-10...

行为小鼠中海马θ振荡的光遗传学同步

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。...

使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

本方案描述了使用多叉线性硅探针记录局部场电位的方法。通过电流源密度分析对信号进行转换，可重建小鼠海马中的局部电活动。利用该技术，可在自由活动的小鼠中研究空间受限的脑节律振荡。...

记录行为小鼠海马中空间限制性振荡

我们在海马脑片中使用记录和刺激电极，并在活体背侧海马中纵向放置记录和刺激电极，以诱发细胞外突触后电位，并证明沿纵向跨层CA1区的长时程突触可塑性。...

通过电生理场电位记录研究海马CA1区跨层间的长期突触可塑性

本方案概述了使用定制设计的记录装置和电极来记录小鼠海马和前额叶皮层局部场电位，并研究信息流向的方法。...

小鼠海马与前额叶皮层的双细胞外记录

学习从啮齿动物脑分离完整海马制备并记录θ振荡的方法，结合场电位、单细胞及全细胞膜片钳技术与光遗传学刺激，深入探究学习与记忆相关的神经环路机制。

调节海马θ节律频段体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法

探索更多视频

调节海马θ节律频段 体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法

探索更多视频

调节海马θ节律频段体外：记录离体啮齿类动物隔-海马环路的方法