调整在海马Theta乐队体外:从孤立的啮齿动物皮下注射电路记录的方法

在这里，我们提出了从孤立的整个海马制剂记录节律神经元网络theta和γ振荡的协议。我们描述从海马提取到场，单元和全细胞膜片钳记录的细节以及θ节律的光起搏的实验步骤。

该协议的总体目标是提出提取整个海马准备物的程序，并使用场、单一和膜片钳记录以及光遗传学刺激来探索节律神经元网络的生成。这种方法可以通过极大地促进对海马体节律性振荡基础的细胞和突触机制的研究，帮助回答学习和记忆神经科学领域的关键问题。该技术的主要优点是它使用优化的准备来研究详细振荡中的回路，这在海马依赖性记忆信息中起着至关重要的作用。

要开始此过程，请将大脑以直立位置放在解剖皿上，用剃须刀片取出小脑，然后沿中矢状面将大脑切成两半，并将两个孤立的半球放回保持室。接下来，将单个半切开的大脑直立放在解剖皿上。旋转培养皿，直到中矢状结构面向实验者，并且隔膜复合体的嵌入轮廓可见为丘脑内部的薄梨形组织层。

然后，将涂层刮刀插入隔膜下方并向下移动尖端，直到到达解剖皿，切断连接隔膜区域的纤维。现在，沿着隔膜的前缘重复相同的作，并切断连接到大脑额叶的纤维。用刮刀轻轻地将海马体上方的皮层内部保持在直立位置，使用微刮刀小心地拉下丘脑、下丘脑和剩余的脑干核。

随后，用刮刀切下并去除拉出的组织。之后，将涂层刮刀插入背侧海马体喙端下方的侧脑室中。水平握住刮刀，与半切大脑的中矢状面对齐，然后将其滑过脑室壁的光滑轮廓，直到尖端亲切地出现。

将刮刀放在海马体下方，沿着海马体与上覆皮层连接的内层轻轻按压到连接纤维上，然后将微刮刀应用在该层的外侧，并将其压在涂层刮刀上以切开连接纤维。要完成提取，请旋转解剖皿并将涂层刮刀插入腹侧海马体下方。用刮刀轻轻握住海马体，然后对刮刀进行切片动作切开内分泌连接。

隔离完成后，将海马体放在培养皿上，并加入一滴冰冷的蔗糖溶液以保持凉爽。小心修剪掉任何残留的皮质和纤维，并通过轻轻地将剃须刀片涂抹在穹窿上，将海马体与隔膜分开。之后，将制剂转移到室温蔗糖溶液中，让它恢复 15 到 30 分钟，然后再转移到记录室中。

在此步骤中，设置重力进料灌注系统，以实现含氧 ACSF 的连续高速流动。接下来，停止 ACSF 流并使用玻璃移液器的宽端将海马体转移到记录室。让蔗糖饱和制剂沉入底部并沉淀。

将制剂放在记录室的中央，将 CA1 和皮下的光滑表面放在顶部。用小重量的间隔和颞肢稳定海马体，然后重新启动 ACSF 流。在此过程中，将 LFP 电极降低到海马体表面。

将 LFP 电极推进通过参数层，并在检测到单个神经元的单个单位放电时观察细胞外尖峰活性的增加。进一步降低电极，并注意当尖端穿过辐射原子时，尖峰再次开始消失。观察 theta 频率范围内清晰可见的网络振荡变得明显，并随着记录位置通过辐射原子降低而达到最大振幅。

为了测试整个 CA1 区域的自发 θ 振荡的空间特性，将第二个 LFP 电极放入 CA1 位点，并观察 CA1 θ 振荡在远距离上同步。为了测试跨海马层的 θ 振荡的特性，请在 CA1 辐射原子位点留下一个参考 LFP 电极。从层口上方开始，将第二个电极降低到参数池层中并穿过辐射原子。

观察 LFP 信号在参数层上的逐渐反转。为了测试完整海马体中的 γ 振荡和 θ γ 耦合，在 CA1 下边界放置一个场电极并将其降低，直到它位于参数层和分子层之间的界面上。在这个水平上，可以记录一个场电位，显示清晰的伽马振荡，其相位锁定到局部 θ 节律的振幅变化。

然后，调整缩放以观察 θ 伽马耦合的慢速时间尺度。请注意，伽马脉冲发生在两个不同的频带中，在持续的 LFP 信号期间，在慢速和快速伽马范围内，可以通过频带显示。对于体外海马 θ 振荡期间的全细胞膜片钳记录，使用低倍和高功率放大倍率的荧光视频显微镜来可视化位于 PV tom 小鼠海马制剂表面附近的 tdTomato 阳性中间神经元。

在海马体的低放大倍率视图下，将 LFP 电极置于 CA1 皮下以监测 θ 振荡，同时准备膜片钳实验。然后，切换到 40 倍放大倍率并将物镜浸入目标区域。降低它直到顶层变得可见，在荧光显微镜下，选择荧光 PV tom 细胞并用装满标准细胞间溶液的贴片移液器接近。

一旦进入全细胞配置，检查自发性海马振荡期间已识别的 PV 细胞的生理特性。观察来自 PV 细胞的细胞内膜电位记录，其特征是快速尖峰行为和与正在进行的 CA1 subiculum θ 节律同步的动作电位爆发。在此过程中，将 LFP 电极放置在 CA1 下区域，并在小鼠的离体海马体中修补附近的参数细胞，在 PV 中间神经元中表达蓝光敏感的兴奋性 opcin，CHR2。

将光纤光导放在海马准备物上方，并将其置于记录区域的中心。使用来自 LED 光源的蓝光进行光学遗传刺激，包括 10 到 20 毫秒的光脉冲或以 θ 频率传递的正弦波电压命令。在电流钳中，表征自发 θ 振荡期间记录的细胞的活动。

然后，启动刺激协议并记录光响应。观察到场振荡和突触活动以及记录的神经元在光遗传学刺激过程中变得越来越同步，并且 PV 细胞的节律性起搏导致对 θ 振荡的频率和功率的稳健控制。这里显示的是 θ 振荡期间参数单元记录的电生理活性。

电流钳形轨迹显示静息时自发但不有节奏的放电和抑制性突触后电位，与缓慢出现的 LFP 振荡不明显同步。电压钳记录显示，相应的抑制性突触后电流在负 70 毫伏左右具有反转电位。这里是 θ 振荡期间快速尖峰荧光 PV 中间神经元记录的电生理活性。

在电流钳中，该细胞在静止时自发放电，并受到有节奏的兴奋性突触后电位的强烈驱动，这些电位被稳定的 LFP 振荡相锁定。在电压钳记录中，兴奋性突触后电流反转电位大约为零毫伏。一旦掌握，这项技术可以在两到三个小时内完成，在尝试此程序时，重要的是要记住对溶液进行剧烈充氧并使用灌注系统，以便在电生理记录期间高速但稳定地在制备过程中使武装 ACSF 流过制备物。

在此程序之后，可以使用其他方法，例如光遗传学刺激或特定细胞类型群体的沉默，以回答其他问题，例如识别在海马体中形成 θ 振荡器的细胞亚型。该技术发展后，为神经科学领域的研究人员在体外系统地探索海马体隔膜颞轴上 θ 振荡的动力学铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何提取整个海马体准备有一个很好的了解，以便使用场、单元和膜片钳记录以及光遗传学刺激来探索节律神经元网络的功能。