Name: 用于阵列发育和 HIV 抗体分析的糖的化学酶法合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习化学酶法合成N-聚糖用于糖微阵列技术，在氧化铝包被玻璃片上构建阵列以检测HIV抗体结合。该方法可识别弱相互作用，为糖生物学研究和传染病诊断提供新工具。

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作者感谢中国台湾新竹科学园区仪器科技研究中心（ITRC）薄膜技术部及国家实验研究院的大力支持。本研究工作得到台湾科技主管部门（项目编号：MOST 105-0210-01-13-01）和中国台湾“中央研究院”的资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一类包括 PG9、PG16 以及 PGT128、PGT141–145 的 HIV-1 广谱中和抗体被报道具有高效中和 70%–80% 流行性 HIV-1 分离株的能力。这些广谱中和抗体的表位在 HIV-1 M 组所有变异株中高度保守，因此可能为设计有效的 HIV 疫苗免疫原以诱导中和抗体提供指导。23,24,25作为我们持续研究HIV-1广谱中和抗体糖链表位的一部分，我们报道了通过化学与酶法合成一系列高甘露糖型、杂合型和复杂型寡糖，以构建糖芯片阵列21,22然而，常用的聚糖芯片在 N羟基琥珀酰亚胺包被（NHS）玻片无法检测低亲和力的碳水化合物-蛋白质相互作用，可能是由于活性基团水解导致聚糖分布不均所致 N-羟基琥珀酰亚胺功能基团。为克服传统芯片阵列格式的局限性，我们开发了一种基于氧化铝涂层玻璃（ACG...

N-糖蛋白上的聚糖共价连接到共识序列 Asn-Xxx-Ser/Thr 中的天冬酰胺（Asn）残基，影响多种生物学过程，如蛋白质构象、抗原性、溶解性和凝集素识别1,2。N-连接寡糖的化学合成由于其高度的结构微异质性和高度分支的结构，构成了重大的合成挑战。精确选择保护基以调节砌块的反应性、实现异头中心的选择性，以及正确使用促进剂/活化剂，是合成复杂寡糖的关键要素。为应对这一复杂性问题，近年来已有大量研究推动了N-聚糖的合成进展3,4。尽管这些方法已相当成熟，开发一种能够高效制备多种N-聚糖（约20,000种）的方法仍是当前面临的主要挑战。
HIV-1 快速的突变率导致其具有广泛的遗传多样性，并能够逃逸中和抗体反应，这是开发安全有效的HIV-1预防性疫苗所面临的主要挑战之一5,6,7。HIV逃避宿主免疫反应的一种有效策略是对包膜糖蛋白gp120进行翻译后糖基化，形成多种来源于宿主糖基化机制的N-连接聚糖8,9。最近一项关于人胚胎肾（HEK）293T细胞中重组单体HIV-1 gp120糖基化的精确分析表明，其存在结构微不均一性，并具有特征性的细胞特异性模式10,11,12。因此，要理解HIV-1广谱中和抗体（bNAbs）对糖链的特异性，就需要获得足够数量且经过充分表征的gp120相关N-聚糖结构用于分析。
聚糖微阵列技术的发现为高通量研究多种碳水化合物结合蛋白、病毒/细菌黏附素、毒素、抗体和凝集素的特异性提供了可能13,14。通过将聚糖系统性地排列在芯片上，以多价展示方式可有效检测难以识别的低亲和力蛋白-聚糖相互作用15,16,17,18。这种基于芯片的聚糖排列方式能够有效模拟细胞-细胞界面。为了进一步提升该技术性能并克服传统阵列格式中信号不均的问题，我们课题组近期开发了一种基于氧化铝涂层玻璃（ACG）载片的聚糖阵列，利用磷酸化末端的聚糖分子显著增强了信号强度、均一性和检测灵敏度19,20。
为了加深对新分离的 HIV-1 广谱中和抗体（bNAbs）糖链表位的当前认知，我们开发了一种高效且模块化的策略，用于制备多种 N-连接糖链21,22，并将其点样至 ACG 芯片上（见图1）。在 ACG 芯片上对 HIV-1 bNAbs 进行特异性分析的研究中，意外发现了强效 bNAb PG9 存在异源糖链结合行为，该抗体分离自 HIV 感染个体23,24,25。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>三氟化硼乙醚络合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109637</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P2 聚丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>二氯双(环戊二烯基)铪(IV)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-1,4-半乳糖基转移酶（来自牛乳）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>采用机器人针 SMP3（Stealth Micro Spotting Pins）的 BioDot 笛卡尔点样技术</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钼酸铈铵</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铈铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>洁净载玻片&amp;nbsp;</td><td>Schott&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&amp;prime;-单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>驴抗人IgG（Alexa Fluor647标记）</td><td>Jackson Immuno Research, USA</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>二乙基氨基硫三氟化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Acros Organic</td><td>107211</td><td></td></tr><tr><td>FAST frame 载玻片孵育室</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-二磷酸鸟苷-b-L-岩藻糖二钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer 2.0 软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>方案第4节</td></tr><tr><td>GenePix Pro 4300A 读板仪（微阵列图像分析）</td><td>moleculardevices</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件（图像处理）</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr><tr><td>氢氧化锂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>草酸</td><td>Acros Organic</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>对甲苯磺酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>三氟甲磺酸银</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2923286</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>甲醇钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>甲苯&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>N/A</td><td>超纯级</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Amresco</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

用于芯片开发与hiv抗体谱型分析的n-聚糖化学-酶法合成

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

我们提出一种高效的方法，用于快速制备多种多样的 N连接的寡糖（估计结构超过20,000种），这些寡糖常见于人类糖蛋白上。为实现所需的结构多样性，该策略首先通过化学-酶法合成三种寡糖基氟化物模块，随后在3-位进行逐步的α-选择性糖基化反应O 和 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的关键β-甘露糖苷键位置。我们进一步连接了 N-glycans 固定到氧化铝涂层玻璃（ACG）载玻片表面，以构建共价混合微阵列，用于分析异源配体与HIV抗体的相互作用。特别是，研究新近分离的HIV-1广谱中和抗体（bNAb）PG9与空间排列紧密的甘露糖混合物的结合行为5GlcNAc2 （男性5以及双唾液酸化的双天线复合型 N-糖链（SCT）在ACG芯片上的研究为HIV疫苗开发中有效免疫原的设计提供了新途径。此外，我们的ACG芯片是研究其他HIV抗体异源配体结合行为的有力工具。

一种模块化的化学-酶法策略用于合成多种多样的 N-糖类的展示如下 图1该策略基于以下事实：可通过化学-酶法合成三个重要模块，在起始阶段即构建多样性，随后在3位进行α特异性的甘露糖基化O 和/或 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的位置 N-糖链。考虑到双、三和四触角复合型结构的多样性 N-糖链结构，我们认为，一组寡糖基供体与带有预先安装烷基手柄的核心三糖受体可作为起始材料，用于构建目标结构多样性（图1）。先前已证明糖基氟化物供体在构建复杂聚糖库中的适用性21.
为了验证本策略的有效性，选择了一个双天线异构体结构（10，图3</...

一种模块化的合成方法 N已开发出一种将糖链固定于氧化铝涂层玻璃载片（ACG载片）以构建糖芯片的技术，并已验证其在HIV广谱中和抗体谱型分析中的应用。

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

我们提出了一种高效的方法，可快速制备多种N-连接寡糖（估计结构超过20,000种），这些寡糖...

本方法的总体目标是通过在氧化铝涂层玻片上构建新型聚糖微阵列，建立一种模块化的化学-酶法合成N-聚糖的方法，用于检测HIV抗体对异源聚糖的结合。该方法有助于解答糖生物学中的关键问题，推动针对细胞病毒特异性聚糖的鉴定及相关应用开发。该方法的主要优势在于能够检测弱结合相互作用，并鉴定出与蛋白质（例如来自HIV患者的抗体）结合的糖类混合物。该技术的应用意义延伸至流感感染的诊断，因为唾液酸代谢物表达于人体呼吸道上皮细胞，且相关组织在症状出现时常受累及。因此，糖芯片将成为确定野生型病毒亚型特异性的理想工具。尽管该方法可深入揭示HIV抗体对糖类的特异性，也可应用于其他系统，例如基于人血清抗体与固定于表面的人特异性血清抗原结合模式来诊断多种癌症。开始此操作时，将2-5微摩尔预先制备好的糖链加入5毫升圆底烧瓶中。向烧瓶中加入一个磁力搅拌子，并用橡胶隔垫封口。随后向烧瓶中加入400微升新近干燥的DMF以及10-25微摩尔的膦酸连接剂。然后，以800 rpm的转速搅拌反应混合物五小时。反应完成后，在5至10毫巴的真空压力及40摄氏度条件下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。随后，将干燥的反应混合物溶于0.5毫升水中，并加样至聚丙烯酰胺凝胶层上方。用水洗脱产物，并收集一到两毫升的组分。通过薄层色谱（TLC）检测所收集的组分：将每份组分点样于TLC板上，然后将板浸入0.25 mol的钼酸铈铵溶液中。使用加热板加热染色后的TLC板以显色并观察产物。合并含有产物的馏分后，将溶液冷冻干燥，得到白色粉末状的目标产物。接下来，将干燥产物溶于2毫升水中，并加入氢氧化钯。将一个充满氢气的气球连接到反应瓶上，在氢气氛围下以800 rpm的转速搅拌反应混合物15小时。反应完成后，将混合物通过硅藻土层进行过滤，并用两毫升甲醇和两毫升去离子蒸馏水洗涤。然后，在300毫巴真空压力和40°C条件下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。随后，将粗产物混合物溶于约一毫升水中，并加样至聚丙烯酰胺凝胶层顶部。用水洗脱产物，并收集一到两毫升的馏分。合并含有产物的馏分后，冷冻溶液并进行冻干，以获得白色粉末状的目标产物。产物干燥后，使用重水作为溶剂，通过核磁共振和质谱法对其进行表征。进行表面阳极氧化时，将温度可控的培养箱设定为 4 摄氏度。然后将预先配制的 0.3 摩尔水溶液草酸转移至含有磁力搅拌子的 500 毫升烧杯中。将一根 10 厘米长的铂棒作为阴极放入溶液中。在整个阳极氧化过程中，以 300 rpm 的速度持续搅拌草酸。在实验室示踪软件中，单击设置按钮，然后单击功能选择“扫描电压”。将起始电压和终止电压均设为 25.8 伏特。将点数设为100，合规性设为1，扫描延迟设为1200毫秒，然后点击确定。夹持一片铝涂层面向阴极的玻璃载片。点击运行测试按钮，观察当前测量结果。表面阳极氧化后，用双蒸水彻底清洗载玻片，并用氮气吹干。将载玻片存放在相对湿度为30%的环境中，待后续使用。制备时，将所有单价糖链在乙二醇中配制成10毫摩尔浓度的100微升溶液。用打印缓冲液稀释糖链溶液，得到100微摩尔的溶液。对于异源配体研究，将5微升MAN-5糖链加入到每种糖链溶液的5微升中。将制备好的糖链转移至384孔微孔板中，用于微阵列点样步骤。将微孔板插入Array Tech打印机后，通过机器人针头将每种糖链溶液0.6纳升点样到每个铝涂层玻片上，完成微阵列的打印。随后，配制70微升含3%BSA的初级抗体PG-9和PTSB缓冲液。然后在避光条件下，配制含有3% BSA的120微升二抗荧光标记抗体（驴抗人免疫球蛋白G）与PBST缓冲液。将PG9与二抗荧光标记抗体按1:1比例混合。随后将预混的抗体溶液在4摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，将一片镀铝玻璃载玻片放入分为16个孔的载玻片孵育腔中。向糖芯片中加入100 µL预混抗体溶液。在4 °C孵育16小时后，用移液器从糖芯片上移除预混抗体，然后取下载玻片孵育腔。用PBST缓冲液和去离子水清洗玻片，然后在2000 × g条件下离心干燥玻片。接着，打开微阵列图像分析软件。将玻璃干燥载玻片插入阵列扫描仪中，使点阵面朝下。点击设置菜单，将图像分辨率设为每像素5微米。将波长设置为635纳米，PMT 450，功率设置为100%。单击扫描按钮以开始对切片进行成像。最后单击文件图标，将扫描图像以TIF格式保存用于图像分析。在本研究中，采用模块化的化学-酶法策略合成了多种N-聚糖。为了验证该策略的有效性，通过化学-酶法合成了一个双天线等轴结构。二糖1经酶法半乳糖基化，随后三糖2进行岩藻糖基化，得到目标四糖3。对构筑单元二和三进行完全硫酸化以及还原端修饰，得到目标分子四和五。六糖七通过三糖单元六的模块四发生立体选择性三次O-糖基化反应制得。去保护并经与模块五反应后得到十一糖九。经全局去保护得到糖链10，其结构通过核磁共振和质谱分析表征。在还原端带有戊胺尾链的糖类通过膦酸连接臂进行修饰，并利用膦化物化学法固定在铝镀膜玻璃表面。使用同源和异源糖阵列筛选 HIV-1 广谱中和抗体 PG9 的糖链特异性，首次证明了其与 HIV-1 PG120 表面 V1/V2 环区相邻异源糖链的相互作用。一旦掌握该技术，若操作正确，从糖链固定到β分析可在 24 小时内完成。在进行该实验操作时，需要注意使用新近阳极氧化的铝涂层玻璃载玻片用于Glycan 10。该操作所用的载玻片为医学技术人员所使用的类型。可通过测定体常数来量化目标糖类与蛋白质之间的结合相互作用。该技术问世后，为研究人员深入理解碳水化合物在肯尼亚传染病中的作用铺平了道路，并有助于开发针对疾病的新型疗法。切记，操作有毒试剂时可能存在极高风险，进行实验时必须始终采取预防措施，例如穿戴防护服、护目镜和口罩。

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

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用于阵列发育和 HIV 抗体分析的糖的化学酶法合成

通过RNA文库筛选分离出多个针对HIV-1Ba-L gp120、具有纳摩尔亲和力的2’-氟代RNA适配体 体外 SELEX 流程。一种新型双抑制功能抗 gp120 适配体-siRNA 嵌合体被成功构建，在全身性抗 HIV...

细胞类型特异性抗HIV gp120适配体的开发及其用于siRNA递送

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本视频展示了用于分析小鼠血清中循环抗糖抗体的打印糖阵列技术。血清中的抗体与芯片上的特定糖类发生相互作用，通过免疫染色后进行荧光扫描来确认该相互作用。...

利用打印的聚糖芯片检测循环抗聚糖抗体

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1...

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

采用打印的聚糖微阵列策略，将传统的96孔板检测方法微型化，用于分析甲型流感病毒血凝素对含唾液酸受体的结合强度和特异性。...

一种用于评估甲型流感病毒血凝素亲和力与特异性的微型化聚糖微阵列检测方法

唾液酸聚糖微阵列检测可用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，因此有望成为一种用于癌症及其他慢性炎症介导的人类疾病的高通量诊断检测方法。...

利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。...

打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD...

设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

抗体的糖基化模式决定了其临床表现，因此工业界和学术界一直在努力控制糖基化过程。由于典型的糖基工程实验耗时且劳动密集，建立一种通过瞬时沉默技术快速表征糖基化相关基因影响的实验方案将具有重要意义。...

中国仓鼠卵巢细胞中快速抗体糖工程改造

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。...

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

学习化学酶法合成N-聚糖用于糖微阵列技术，在氧化铝包被玻璃片上构建阵列以检测HIV抗体结合。该方法可识别弱相互作用，为糖生物学研究和传染病诊断提供新工具。

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

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