用于阵列发育和 HIV 抗体分析的糖的化学酶法合成

该方法的总体目标是通过在氧化铝包被的载玻片上构建新的聚糖微阵列来开发一种模块化的化学酶方法来合成 N-聚糖，以检测 HIV 抗体的异聚糖结合。这种方法可以帮助回答糖生物学中的关键问题，以鉴定细胞病毒特异性聚糖以进行大量发育。这种方法的主要优点是检测弱结合并鉴定与蛋白质结合的糖混合物，例如来自 HIV 患者的抗体。

该技术的意义延伸到流感感染的诊断，因为唾液分解代谢者在人气道上皮细胞上表达，问题很常见，而症状。因此，糖阵列将是确定野生亚型特异性的理想工具。虽然这种方法可以提供 HIV 抗体的聚糖特异性，但它也可以应用于其他系统，例如，根据人血清抗体与印在表面的人特异性血清抗原的结合模式来诊断各种癌症。

要开始此过程，请添加 2-5 μml 先前制备的游离寡糖和一个 5 mL 圆底烧瓶。在培养瓶中加入磁力搅拌棒，并用橡胶隔膜盖住。向培养瓶中加入 400 微升新鲜干燥的 DMF 和 10-25 微摩尔的膦酸接头。

然后，以 800 rpm 的速度搅拌反应混合物 5 小时。反应完成后，使用旋转蒸发仪在 5 至 10 毫巴真空压力和 40 摄氏度下蒸发溶剂。然后，溶解干燥的反应混合物和 0.5 毫升水，并加载到聚丙烯酰胺凝胶床的顶部。

用水洗脱产物并收集 1 至 2 mL 馏分。为了通过 TLC 检查收集的级分，请在 TLC 板上点样每个级分，并将板浸入 0.25 摩尔钼酸铈铵中。用热板加热染色板以观察产品。

混合含有馏分的产品并冷冻溶液后，生物溶污以获得所需的白色粉末产品。接下来，将干燥产物溶于两毫升水中，并加入氢氧化钯。将含氢球体连接到烧瓶上，并在氢气气氛下以 800 rpm 的速度搅拌反应混合物 15 小时。

反应完成后，通过 Celite Bed 过滤混合物，并用 2 毫升甲醇和 2 毫升蒸馏去离子水洗涤。然后，使用旋转蒸发仪在 300 毫巴真空压力和 40 摄氏度下蒸发溶剂。然后，将污泥混合物溶解在大约 1 毫升水中，并将其加载到聚丙烯酰胺凝胶床上。

用水洗脱产品并收集 1 至 2 mL 馏分。混合含有馏分的产品并冷冻溶液后，生物溶污以获得所需的白色粉末产品。产品干燥后，使用氧化氘作为溶剂，通过 Enimar 和质谱对其进行表征。

对于表面阳极氧化，将温控培养箱设置为 4 摄氏度。然后将先前制备的 0.3 摩尔草酸水溶液转移到装有磁力搅拌棒的 500 毫升烧杯中。将一根 10 厘米长的铂棒作为阴极放入溶液中。

在整个阳极氧化过程中，以 300 rpm 的速度不断搅拌草酸。在实验室示踪软件中，单击设置按钮，然后单击功能选择扫描电压。将启动和停止电压设置为 25.8 伏。

点数为 100，合规性为 1，扫描延迟为 1200 毫秒。然后，单击 Ok.夹住面向阴极的镀铝载玻片。

单击 run test 按钮并观察当前测量值。表面阳极氧化后，用双蒸水彻底清洗载玻片，并用氮气吹扫。将载玻片存放在 30% 相对湿度的试验箱中，直到进一步使用。

对于制造，在 10 毫摩尔浓度的乙醇乙二醇中制备 100 μL 所有单价糖的溶液。用打印缓冲液稀释聚糖溶液，制成 100 微摩尔溶液。对于异源配体研究，将 5 μL MAN-5 糖基添加到 5 μL 每种糖基溶液中。

将制备好的游离寡糖转移到 384 孔微孔板中，用于微阵列打印步骤。在打印机阵列技术上插入微孔板后，通过将 0.6 纳升聚糖溶液沉积到每个铝涂层载玻片上，通过机器人针打印微阵列。接下来准备 70 微升一抗 PG-9 和含有 3% BSA 的 PTSB 缓冲液。

然后在黑暗中制备 120 微升二抗荧光标签抗体 Donkey 和含有 3% BSA 的抗人免疫球蛋白 G 和 PBST 缓冲液。以 1：1 的比例混合 PG9 和二抗荧光标签抗体。然后将预混抗体在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育后，将铝涂层玻璃载玻片装入载玻片孵育室，该培养室分为 16 个孔。将 100 μL 预混抗体转移至游离寡糖阵列中。在 4 摄氏度下孵育 16 小时后，用移液管从聚糖阵列中取出预混抗体，然后取出载玻片孵育室。

在 PBST 缓冲液和去离子水中清洗载玻片。然后在 2000 倍重力下甩干载玻片。接下来，打开微阵列图像分析软件。

将玻璃干燥的玻片插入阵列扫描仪中，阵列特征朝下。点击设置菜单。将图像分辨率设置为每像素 5 微米。

并使用 PMT 635 将波长设置为 450 纳米，功率为 100%单击扫描按钮开始对载玻片进行成像。最后，单击文件图标将扫描图像保存为 TIF 格式以进行图像分析。在本研究中，使用模块化化疗酶策略合成了多种 N-糖。

为了证明该策略的有效性，通过化学酶方法合成了双天线等距结构。二糖 1 的酶促半乳糖基化，然后是三糖 2 的岩藻糖基化，得到所需的四糖 3。每个饱和化和减少构建块 2 和 3 的末端修饰，得到所需的分子 4 和 5。

立体选择性 3 的 3 O-糖基化 3 的模块 6 提供六糖 7。模块 5 之前的去保护和反应得到脱十糖 9。全局检测得到游离寡糖 10，其特征是通过 Enimar 和质谱法表征的。

用膦酸接头修饰还原端含有戊胺尾部的聚糖，并通过磷化物化学连接到铝玻璃涂层表面。使用同源和异聚糖阵列筛选 HIV-1 广泛中和抗体 PG9 的聚糖特异性，以首次证明它与 HIV1 PG120 表面 V1/V2 环中相邻的杂聚糖发生非结合。一旦掌握，如果作得当，该技术可以在从聚糖固定到 β 分析的 24 小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住为聚糖 10 使用新阳极氧化的铝涂层载玻片。用于铺设此程序的是 med techs 幻灯片。可以进行体常数的测定，以量化碳水化合物和目标蛋白质之间的结合相互作用。

这项技术开发后，它为研究人员更好地了解碳水化合物在肯尼亚传染病中的作用并帮助开发针对疾病的新疗法铺平了道路。不要忘记，使用有毒物质可能非常危险，因此在进行实验时应始终采取预防措施，例如穿着衣服、戴眼镜和戴口罩。