脊髓神经元从新生小鼠中分离和培养
July 11th, 2017
这项研究提出了一种从WT新生小鼠中分离神经元的技术。它需要从新生小鼠中仔细地解剖脊髓，然后通过机械和酶切割将脊髓组织中的神经元分离出来。
该程序的总体目标是能够反复和一致地分离可用于各种实验的脊髓神经元。这种方法可以让我们更好地了解脊髓神经元的生物学特性，并希望了解它们对各种压力源的反应。该技术的主要优点是，它允许分离大量神经元，允许这些神经元用于各种实验。
这种方法的视觉演示至关重要，因为神经元从组织中机械分离的研磨步骤需要一些时间来掌握，以确保健康的神经元分离，而不会杀死它们。要开始此过程，请使用剪刀将安乐死的小鼠幼崽的头部与身体分开。接下来，将尾巴和手臂稳定在手术台上，使背侧朝上。
然后，使用弯曲的虹膜剪刀剪掉皮肤。之后，从臀部上方的腰部区域切开脊髓，然后切开胸部的两侧，将其与身体分开。在三个 10 cm 培养皿中依次洗涤样品，每个培养皿含有 5 mL 灭菌 PBS，每次 10 秒，以去除多余的组织。
随后，将装有 5 毫升消毒 PBS 的 22 号针头和注射器插入脊柱的尾端并颅部冲洗，使脊髓流出到第四个培养皿中。将脊髓移植到 15 毫升的试管中，在冰上加入 5 毫升 HABG。避免压碎脊髓，并对其余幼崽重复这些程序。
理想情况下，一组幼崽的此过程不应超过 30 分钟，以确保神经元隔离。为了制备密度梯度，将四层中的每一层都放在四个 15 毫升的试管中。然后，将每层 1 毫升加入新的 15 毫升试管中。
从底部的第 1 层开始，然后按顺序添加，直到到达顶部的第 4 层。添加时避免干扰各层和任何可能导致混合的剧烈运动。接下来，将消化培养基添加到切碎的组织中。
将样品放入 30 摄氏度水浴中的摇床中。然后，从水浴中取出组织并让它沉淀几分钟。要进行研磨，请吸出多余的消化培养基。
使用窄口径移液器将组织悬浮在 2 毫升 HABG 中，在 45 秒内研磨 10 次，并避免引入空气，因为这会显着降低活产率。研磨是该程序中最关键的步骤之一，应小心地将组织吸入并从火焰抛光的移液管中清空，避免过度的活力导致神经元死亡或过于温和，从而导致产量低。之后，吸出顶部两毫升的上清液，并将其转移到一个新的 15 毫升试管中，并标有
再重复收集程序两次，得到 6 毫升的上清液。接下来，将收集管内容物缓慢转移到先前制备的梯度管中。避免梯度的中断。
为了纯化神经元，在 22 摄氏度下以 800 倍 G 离心梯度管 15 分钟。收集所需的层并将其转移到新的 15 毫升试管中。为了获得最高纯度的神经元分离，请收集第 3 层。
为了获得更高的产量和更低的纯度，请收集第 2 至 3 层。接下来，通过向新收集的层中加入 5 毫升 HABG 来稀释密度梯度。将其以 200 倍 G 的速度在 22 摄氏度下离心 2 分钟。
两分钟后，弃去上清液，轻弹上颚，将细胞重新悬浮在 5 毫升 HABG 中。随后，再次在 22 摄氏度下以 200 倍 G 离心样品 2 分钟。然后，弃去上清液，轻弹上颚，将细胞重悬于 3 mL Neurobasal 培养基中。
之后，使用细胞计数器测定细胞密度，然后将悬浮液稀释至每 1 毫升 Neurobasal 培养基 300， 000 个细胞。轻轻摇晃以分散细胞和溶液，并向编码的 24 孔板中的每个孔中加入 1 毫升样品。这里显示的是培养中神经元在接种到孔上的时间过程。
细胞通常会在最初的几个小时内开始粘附在表面。轴突将在最初的 24 到 48 小时内开始发芽，各种神经元与培养物之间的连接通常在 7 天达到成熟，此时，通常会对神经元进行实验。在该图中，核染色以蓝色显示，细胞质染色为绿色，在这里，神经元循环骨骼蛋白微管相关蛋白 2 被染色，显示培养一周后神经元的轮廓和轴突投影。
合并图像被组合，显示神经元的相对丰度。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。发展之后，这项技术为研究人员铺平了道路，研究脊髓生理学和病理学，探索脊髓神经元在正常条件下的行为，以及响应药物或压力源，如氧气和葡萄糖剥夺，只是模仿我们的外科手术。
在进行此程序时，重要的是要避免延迟或延长任何步骤以防止分离不健康的神经元。观看此视频后，您应该对如何从可以在无血清培养基中培养的新生小鼠脊髓中分离出健康和有活力的神经元有一个很好的了解。
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概述
本研究提出了一种从WT新生小鼠中分离神经元的技术，重点是通过机械和酶解方法进行脊髓解剖和神经元分离。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生物学技术
背景
- 脊髓神经元的分离对各种实验应用至关重要。
- 了解神经元生物学可以提供对其对压力源反应的洞察。
- 掌握碾碎步骤对于健康的神经元分离至关重要。
- 视觉演示增强了这种复杂技术的学习。
研究目的
- 开发一种可靠的脊髓神经元分离方法。
- 促进研究神经元生物学的实验。
- 提高对不同压力源的神经元反应的理解。
使用的方法
- 从新生小鼠中解剖脊髓。
- 机械和酶解分离神经元。
- 谨慎处理以确保神经元活力。
- 视觉辅助来展示碾碎过程。
主要结果
- 使用这种技术可以分离出大量神经元。
- 该方法允许一致和可重复的神经元分离。
- 可以获得健康的神经元用于各种实验用途。
- 视觉演示有助于掌握这种技术。
结论
- 开发的技术对于分离脊髓神经元是有效的。
- 它为进一步研究神经元生物学提供了基础。
- 掌握这种方法可以导致改善实验结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of spinal cord neurons from neonatal mice enables high-fidelity in vitro models for early neurobiology discovery and mechanistic de-risking. This capability supports predictive confidence in target validation and functional screening for neurodegenerative and neuroregenerative research portfolios. Consistent neuron yield and viability underpin scalable assay development and translational continuity across preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal response to pharmacological agents and stressors in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary neuron cultures for pathway analysis.
- Facilitates functional target validation through reproducible neuron isolation and culture.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-yield neuron preparations for quantitative assay development.
- Ensures reproducibility and scalability for compound screening and phenotypic analysis.
- Delivers validated neuronal systems suitable for downstream high-content or functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant neuronal responses to injury or deprivation in vitro.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo preclinical models for translational biomarker exploration.
- Reduces biological risk by providing continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This neuron isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuronal pathways and stress responses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of neuronal viability, maturation, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with in vivo preclinical models when aligned with disease context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and pharmacology studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible neuron preparations for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal dissection and trituration for optimal neuron viability.
- Needs access to sterile instrumentation, density gradient materials, and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of isolation and culture steps for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to timing and handling, impacting downstream assay reliability.
