Name: 来自新世界Zika病毒感染性克隆的重组病毒的救援和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习利用双质粒感染性cDNA克隆系统拯救寨卡病毒重组毒株的方法。该技术适用于黄病毒学研究，可助力疫苗开发、致病机制探索及病毒进化分析，并推广至其他难以克隆的病毒系统。

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作者感谢Kristen Bullard-Feibelman、Milena Veselinovic和Claudia Rückert在克隆来源病毒的表征工作中提供的帮助。本研究部分得到了美国国立过敏与传染病研究所（NIH）资助项目AI114675（BJG）和AI067380（GDE）的支持。

1. 感染性克隆质粒的转化与回收
<ol>
	<li>分别使用商业转化试剂盒对两个质粒进行转化（各自独立转化）例如，NEB 5分钟转化方案）并进行部分修改。两种质粒均含有编码氨苄青霉素抗性的基因，因此可使用氨苄青霉素或羧苄青霉素进行筛选。推荐使用羧苄青霉素，因其更为稳定。
	<ol>
		<li>从 -80 °C 中取出细胞（参见材料表） &#176;C 冰箱中冷冻，并在冰上解冻 5-10 分钟。预热含 10 g/L NaCl 和 25 &#181;g/mL 羧苄青霉素；称为 LB-carb）平板以及含有分解代谢抑制物的肉汤（SOC（不含抗生素）——随细胞提供）中，于 37 °C 培养 &#176;C.</li>
		<li>加入 100 pg–10 ng 至 1 &#181;L 质粒 DNA 加入含有 50 的离心管中 &#181;L 感受态细胞；轻轻弹击离心管混匀。</li>
		<li>将离心管置于冰上孵育5分钟。</li>
		<li>42℃热激试管 &#176;30秒，水浴。热激后立即放回冰上2分钟。</li>
		<li>移液 950 &#181;将1毫升室温的SOC加入每根试管中，用移液器吹打混匀。取100微升涂布于平板 &#181;将细菌混合物的 L 接种至 LB-羧苄青霉素平板上，37℃过夜培养 &#176;C（约12-14小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从37℃移除培养板 &#176;37°C 培养箱中培养 12-14 小时后，将平板置于室温下的避光抽屉中，使菌落继续生长（约 8-9 小时）。</li>
	<li>使用 5 mL 的优质肉汤（TB，含有 25 &#181;g/mL 羧苄青霉素（称为 TB-carb），在 30℃ 下过夜培养每个质粒的 5–10 个小型菌落 &#176;在细菌摇床中于37°C培养（约14–16小时）。 
	注意：菌落较小是质粒完整的标志；含有缺失、重排或突变（以下简称不稳定性事件）的质粒菌落生长较快，因而体积更大。因此，应尽量挑选平板上最小的菌落，避免选择最大的菌落。为确保全面性，也可挑选部分中等大小的菌落。采用较低温度培养可降低细胞过度生长（OD600 大于 0.6-0.8）。由于大多数研究人员进行过夜培养，这有助于更好地控制并降低过度生长的可能性。</li>
	<li>检查液体培养物的浑浊度（大致 OD600 0.6–0.8）的菌液。将任何浑浊的试管置于 4℃ &#176;C，并让其他试管继续培养更长时间以使其变浑浊。 
	注意：不要将细菌培养至 OD600 高于推荐值可能导致质粒不稳定事件发生。</li>
	<li>使用商业质粒小提试剂盒从细菌中提取质粒DNA（参见材料表）。用15 μL洗脱液洗脱。 &#181;预热至 70 ℃ 的 L &#176;在加热块中）洗脱缓冲液。将洗脱缓冲液在柱上孵育5分钟，然后进行离心。 
	注意：将此初始培养物保留至少 1 mL 于 4 &#176;C 用于下一步的进一步使用。</li>
	<li>消化 10 &#181;通过培养过程中回收质粒的 L 值评估质粒不稳定事件是否发生。 
	注意：在37℃下用SalI/NheI酶切p1，用BamHI/HindIII酶切p2 &#176;C孵育1小时。消化后确认出现正确条带图2a) 通过凝胶电泳进行检测，并进入步骤2。若采用滚环扩增（RCA）方法制备质粒DNA，需保留部分微量提取洗脱液作为模板。</li>
</ol>
2. 准备足量的质粒 DNA 用于连接
注意：连接反应及后续的电穿孔实验需要足量的质粒 DNA，该 DNA 必须通过大提（maxiprep）或滚环扩增（RCA）方法制备。虽然大提是传统常用的方法，但 RCA 的优势在于无需使用细菌，从而避免了质粒在细菌中可能引发的毒性问题，防止由此导致的质粒不稳定事件。
<ol>
	<li>执行以下大提物质粒提取操作。
	<ol>
		<li>针对前一步骤中经限制性内切酶消化验证正确的每个质粒，取500 µL起始培养物加入1 L含羧苄青霉素（25 µg/mL）的TB培养基中，于30 °C下振荡培养过夜（约14–16小时，OD600约为0.6–0.8）。 
		注意：切勿使培养物OD600超过此范围，否则可能导致质粒不稳定事件。</li>
		<li>收集细菌，并按照生产商说明书进行大提物质粒提取（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用步骤1.6中保存的小提物质粒样本，执行以下滚环扩增（RCA）操作。
	<ol>
		<li>将1 µL质粒DNA转移至含有50 µL样本缓冲液的离心管中。</li>
		<li>于95 °C加热变性3分钟，随后置于4 °C待用。</li>
		<li>配制商用扩增预混液（参见材料表）。在冰上将50 µL反应缓冲液与2 µL酶混合液混合。 
		注意：扩增预混液应始终置于冰上直至使用。建议根据所需扩增反应数量配制足量的主混合液。未使用的预混液必须弃去。</li>
		<li>将50 µL已配制的扩增预混液加入变性后的样本中。</li>
		<li>将反应管于30 °C孵育18小时。</li>
		<li>将反应管于65 °C孵育10分钟，以灭活ø29 DNA聚合酶。</li>
		<li>将反应管储存于4 °C或-20 °C待用。 
		注意：此时，两种方法制备的质粒DNA均应定量（通过260 nm吸光度测定），并对完整的ZIKV基因组进行Sanger测序，以确认在制备过程中未发生任何不稳定事件（如缺失或重排）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列（5' - 3'）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV PRVABC59 1For</td>
			<td>AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 632For</td>
			<td>GCCCTATGCTGGATGAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 692反向</td>
			<td>GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 1313Rev</td>
			<td>CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 1201For</td>
			<td>CCAACACAAGGTGAAGCCTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 1663For</td>
			<td>GCAGACACCGGAACTCCACACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 2008For</td>
			<td>CAGATGGCGGTGGACATGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 2350Rev</td>
			<td>GTGAGAACCAGGACATTCCTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 2605For</td>
			<td>TACAAGTACCATCCTGACTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 3499反向</td>
			<td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 3961Rev.</td>
			<td>TTGCCAACCAGGCCAAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 4132For</td>
			<td>CATTTGTCATGGCCCTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 4561反向引物</td>
			<td>CTATTGGGTTCATGCCACAGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 4665For</td>
			<td>GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 5189Rev</td>
			<td>AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 5219For</td>
			<td>GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 6086反向引物</td>
			<td>CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 6119For</td>
			<td>GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守位点 6721反向引物</td>
			<td>CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 6769For</td>
			<td>CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 7209反向</td>
			<td>ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 7343For</td>
			<td>GTTGTGGATGGAATAGTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 8243For</td>
			<td>TGCCCATACACCAGCACTATGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV PRVABC59 8893Rev.</td>
			<td>TGCATTGCTACGAACCTTGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 9133For</td>
			<td>AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV PRVABC59 9673Rev.</td>
			<td>AACGCAATCATCTCCACTGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 9686For</td>
			<td>GATGATAGGTTTGCACATGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 10321反向</td>
			<td>GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 10455For</td>
			<td>CAGGAGAAGCTGGGAAACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV 保守序列 10621反向引物</td>
			<td>CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：cDNA克隆测序引物。 所列引物可用于对质粒进行全序列测序。标记为“保守”的引物表示其可能能够对所有ZIKV基因型进行测序/扩增。标注为“PRVABC59”的引物特异于该毒株，但可能也适用于其他亚洲基因型毒株，甚至可能适用于其他基因型。
3. 准备 体外 转录的RNA
<ol>
	<li>准备对质粒大量提取物（maxiprep）或滚环扩增（RCA）制备的DNA进行消化反应。
	<ol>
		<li>对于 p1 消化，混合 10 &#181;L 的 10 倍反应缓冲液，3 &#181;ApaLI 的 L，3 &#181;BamHI-HF 3 L &#181;rSAP 或 CIP 的 L，以及 3.3 &#181;克隆的 p1 DNA。加入 ddH₂O20 到 100 &#181;L.</li>
		<li>用于 p2 消化，混合 10 &#181;10倍反应缓冲液，3升 &#181;ApaLI 3 L &#181;L 的 EcoRI-HF 和 13.3 &#181;克隆p2 DNA的克数。加入ddH₂O20 到 100 &#181;L.</li>
		<li>37℃孵育 &#176;C，孵育1-2小时。</li>
		<li>使用商业化的凝胶和PCR纯化试剂盒进行纯化（参见材料表）。用30 μL洗脱液洗脱。 &#181;70℃预热的洗脱缓冲液 L &#176;在加热块中放置 5 分钟（先将柱子孵育 5 分钟，然后再离心）。 
		注意：保留 1 &#181;L，以便后续进行凝胶电泳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备连接反应。
	<ol>
		<li>混合10 &#181;L 的 10x T4 DNA 连接反应缓冲液，3 &#181;L T4 DNA连接酶（400 U/&#181;升），29 &#181;L 的纯化 p1，以及 29 &#181;L 纯化 p2。加入 ddH20 到 100 &#181;L.</li>
		<li>室温孵育 2 小时或 16 &#176;C 过夜。</li>
		<li>使用商业凝胶和PCR纯化试剂盒进行纯化（见材料表）。用10 μL洗脱液洗脱。 &#181;70℃预热的洗脱缓冲液 L &#176;在加热块中于 55°C 孵育 5 分钟，然后离心。 
		注意：保留 1 &#181;L，以便后续进行凝胶电泳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将未消化的质粒、消化后的质粒以及连接产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。连接产物应出现比任一单独消化质粒分子量更高的条带（约11 kb），表明连接成功。图2b).</li>
	<li>设置 T7 体外 转录反应。
	<ol>
		<li>将10 &#181;L 2x ARCA/NTP 混合液，2 &#181;L 的 T7 RNA 聚合酶混合物，以及 8 &#181;L 纯化连接反应产物，终体积为 20 &#181;L. 
		注意：混合物中包含的ARCA是一种帽类似物，仅以正确的方向被特异性地结合。标准的帽类似物可能导致仅有约50%的转录本具有正确方向的帽结构。</li>
		<li>37℃孵育4小时 &#176;C.</li>
		<li>通过紫外分光光度计测定RNA浓度。可选地，运行变性琼脂糖凝胶以确认RNA转录本的长度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过电穿孔拯救感染性病毒
<ol>
	<li>电穿孔前数天，为每个待回收的构建体准备 1 个 T182 培养瓶的 Vero 细胞（T150 至 T182 均可接受；使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养），另设 1 个 T182 培养瓶作为模拟转染对照。细胞使用时应处于 70–80% 汇合度。</li>
	<li>当细胞准备就绪时，将每反应 12 mL 的 DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES 置于 37°C 水浴中预热。</li>
	<li>采用标准方案用胰酶消化使细胞脱落，并用含 10% FBS 的培养基重悬以灭活胰酶；在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟收集细胞。</li>
	<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟形成沉淀。重复此步骤共三次。</li>
	<li>按每份样品计，用 200 µL 的 RPMI 1640 + 10 mM HEPES（无菌）重悬细胞。将 200 µL 细胞悬液转移至无菌离心管中。细胞浓度应约为 0.5 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>向每组细胞中加入 20 µL 水（模拟阴性对照）或第 3.4 步制备的 20 µL RNA（建议使用 5–10 µg）。轻弹离心管混匀，然后将内容物转移至 2 mm 间隙的电穿孔杯中。</li>
	<li>将电穿孔仪参数设置为 170 V LV，电阻（omega）设为 0，电容为 950 µF（其他仪器大致相当于 625 V/cm 和 20 ms 时间常数）。将电阻调至最低可用档位，即 0 或 ∞（如有）。</li>
	<li>施加一次电脉冲后，立即加入在第 4.2 步中预热的 600 µL DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES。彻底冲洗电穿孔杯内壁以回收所有细胞，将细胞悬液加入含有 10 mL 预热培养基的 T75 组织培养瓶中。使用电穿孔杯配套的滴管吸取杯内残留的培养基。操作过程中注意保持无菌。</li>
	<li>轻轻摇晃培养瓶使培养基与细胞混匀，然后置于 37 °C 培养箱中培养。</li>
	<li>次日观察细胞活力，并持续每日观察直至观察到 50–75% 的细胞死亡。通过与模拟电穿孔对照组比较来判断细胞死亡情况。 
	注意：ZIKV 在 Vero 细胞中引起的细胞病变效应（CPE）非常明显，表现为细胞变圆、脱落并漂浮于培养基中。我们观察到最佳收获时间为 8–10 天。</li>
	<li>将上清液收集至锥形离心管中，在 4 °C 下以 >3,000 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。</li>
	<li>将澄清后的上清液转移至新离心管中，并补充 FBS 至终浓度为 20%（使用 100% 储液）。此外，加入无菌 HEPES 至终浓度为 10 mM（使用 1 M 无菌储液）作为缓冲剂，以维持病毒在冷冻状态下的感染性。</li>
	<li>通过涡旋混匀病毒液，分装至带螺口盖的小瓶中。储存于 -80 °C 以备后续使用。</li>
</ol>
5. 恢复病毒的滴定
<ol>
	<li>在滴定前一天，将适量数量的 6 孔或 12 孔板 Vero 细胞接种好。</li>
	<li>从冰箱中取出病毒，在离心管或 96 孔板中用含 2% FBS 的 DMEM 进行 10 倍系列稀释。 
	注意：回收克隆的预期滴度在 1 × 106 至 5 × 107 PFU/mL 之间。</li>
	<li>分别向 12 孔板或 6 孔板的每个孔中加入 200 或 400 µL 的各稀释液，每种稀释度设两个复孔。</li>
	<li>将培养板放入 37 °C 培养箱中，每隔 15 分钟轻轻摇动一次，总吸附时间约为 1–1.5 小时。</li>
	<li>吸除病毒接种液，向每个孔中加入 1 mL（12 孔板）或 2 mL（6 孔板）DMEM-刺梧桐胶覆盖层。 
	注意：此处也可使用琼脂糖、琼脂、甲基纤维素或其他覆盖培养基。</li>
	<li>在 37 °C 培养箱中培养 5 天。形成合适斑块所需时间会因所用覆盖层不同而有所差异。</li>
	<li>固定细胞时，将培养板从培养箱中取出，轻轻将覆盖层倾倒至消毒液中。</li>
	<li>向每个孔中加入足量的含 20% 乙醇/0.1% 结晶紫（CV）溶液，使其覆盖孔底，轻轻旋转混匀。 
	注意：此处也可使用多种其他固定剂。此外，若使用琼脂糖或琼脂覆盖层，可结合中性红染色进行第二层覆盖，以在不固定的情况下观察斑块。先前研究显示，20% 乙醇可有效灭活包膜病毒；请勿将此浓度用于非包膜病毒，因其无法被灭活19。</li>
	<li>在室温下（在 II 级生物安全柜内）孵育 30–60 分钟；按当地规定弃去结晶紫溶液，并用自来水清洗培养板。</li>
	<li>让培养板自然干燥，人工计数斑块。 
	注意：参考文献 20 可作为进行斑块试验的额外参考资料。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种寨卡病毒（ZIKV）双组分感染性cDNA克隆系统的构建方法。先前报道的ZIKV克隆系统存在减毒现象，或需插入内含子，导致质粒体积增大，并阻碍在昆虫细胞中拯救病毒。利用该双质粒克隆系统，可在哺乳动物细胞或昆虫细胞中成功拯救出具有感染性的病毒（数据未显示）。此外，从该系统拯救出的病毒在多种细胞系、免疫缺陷小鼠模型以及蚊虫中均表现出与野生型病毒相似的生物学特性。
由于黄病毒基因组中存在隐蔽的细菌启动子3，全长黄病毒克隆难以操作，常导致质粒中出现突变、插入、缺失或重排。为解决这些问题，我们将寨卡病毒（ZIKV）基因组拆分为两个质粒，从而打断病毒NS1基因中存在的毒性序列。该策略获得了一个更稳定的系统，并且易于引入遗传修饰。利用此克隆系统，我们已在ZIKV基因组中引入多个点突变，并在3'非翻译区（UTR）插入外源序列（数据未显示）。该系统还为研究致病性的遗传决定因素、构建疫苗候选株以及开发报告病毒提供了理想的起点。此外，克隆来源的病毒已被证实是研究病毒进化的重要工具22。
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寨卡病毒（ZIKV；黄病毒科 Flaviviridae：黄病毒属 Flavivirus）是一种通过蚊子传播的黄病毒，于2013至2014年间传入巴西，并随后引发了一场大规模发热性疾病暴发，疫情蔓延至整个美洲地区1。此外，ZIKV还与多种严重疾病结局相关，例如成人中的吉兰-巴雷综合征以及胎儿和新生儿中的小头畸形2。在该病毒于西半球迅速传播之前，人们对ZIKV的了解甚少，包括缺乏可用的分子工具，从而阻碍了对其致病机制的研究。针对病毒的分子工具，例如感染性cDNA克隆，有助于疫苗和抗病毒治疗药物的开发，并可用于评估与病毒致病性差异、免疫应答及病毒进化相关的病毒遗传因素。
黄病毒的感染性克隆由于其基因组中存在隐蔽的原核启动子，已知在细菌中极不稳定3已采用多种方法来改善这一问题，包括在病毒序列上游插入串联重复序列4，假定的原核生物启动子序列的突变5将基因组分割成多个质粒6，低拷贝数载体（包括细菌人工染色体）7,8 病毒基因组中内含子的插入9一种未经修饰的全长ZIKV系统已有描述；然而，该克隆在细胞培养和小鼠中均表现出减毒现象10其他研究团队已将内含子插入ZIKV基因组中，从而可在细菌中破坏不稳定的序列，并在哺乳动物细胞中通过剪接将其去除 体外 用于感染性病毒的制备11,12此外，一种基于PCR的系统，称为感染性亚基因组扩增子（Infectious-Subgenomic-Amplicons），已成功用于拯救寨卡病毒（ZIKV）原型株MR76613该方法无需引入外源序列，而是利用多个质粒靶向基因组的高不稳定性区域进行破坏，此前已在黄热病病毒研究中成功应用。6，登革热14,15 和西尼罗病毒16此外，在病毒基因组末端添加丁型肝炎病毒核酶序列，有助于形成真实的3'末端，而无需引入线性化位点。同时，这两个质粒均构建于低拷贝数载体（pACYC177，约每细胞15个拷贝）中，以减轻可能存在的残留毒性。17. 分离得到的病毒在生长特性上与亲本病毒相当 体外 在8种细胞系中绘制生长曲线，这些细胞系包含来源于哺乳动物和昆虫的多种细胞类型，并在小鼠中表现出相同的致病特征，以及在蚊子中具有相同的感染、扩散和传播速率18.
在此，我们详细描述了一种用于扩增感染性克隆质粒并生成全长病毒RNA（即病毒基因组）的实验方案。 体外 并在细胞培养中回收具有感染性的病毒。首先，我们描述了在细菌中扩增质粒，或使用滚环扩增（RCA）进行无菌扩增的方法。接着，我们展示了如何将两个质粒进行酶切消化，随后连接形成全长病毒基因组。最后，我们描述了RNA的体外转录及其通过电穿孔导入Vero细胞的过程，随后对回收的病毒进行滴度测定。图1该方法快速高效，可在1至2周内获得具有感染性的病毒毒种。

<table><tbody><tr><td>NEB Stable 感受态 E. coli</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐</td><td>多个供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy 质粒小量提取试剂盒</td><td>Zymo 研究公司</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE 质粒大量提取试剂盒</td><td>Zymo 研究公司</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3138S</td><td>20,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3131S</td><td>20,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0507S</td><td>10,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3101S</td><td>20,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3136S</td><td>20,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3104S</td><td>20,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 扩增试剂盒</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶 (rSAP)</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0371S</td><td>1,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0290S</td><td>10,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202S</td><td>400,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA 合成试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 高通量电穿孔系统</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>其他设备亦可接受。</td></tr><tr><td>含琼脂的 LB 培养基（Miller 配方）</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>也可自行配制。</td></tr><tr><td>优质肉汤（Terrific Broth）</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>也可自行配制。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>培养管</td><td>VWR 国际公司</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 培养瓶</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺和 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>刺梧桐胶粉末</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>变性乙醇</td><td>VWR 国际公司</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>测序引物</td><td>IDT</td><td>见表 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Qubit 3.0</td><td>其他方法亦可接受。</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32850</td><td>其他方法亦可接受。</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32852</td><td>其他方法亦可接受。</td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>不同厂家</td><td>不适用</td><td>活病毒实验必需。</td></tr></tbody></table>

从一种新型寨卡病毒感染性克隆中拯救与鉴定重组病毒

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

感染性cDNA克隆可实现对病毒的遗传操作，从而促进疫苗、致病机制、复制、传播及病毒进化等方面的研究。本文描述了一种寨卡病毒（ZIKV）感染性克隆的构建方法，该病毒目前在美洲地区引发大规模暴发流行。为避免黄病毒来源质粒在细菌中常见的毒性问题，我们构建了一个双质粒系统，将基因组在NS1基因处分割，其稳定性优于全长构建体；后者若无突变则难以成功回收。经酶切与连接反应将两个片段连接后，可体外转录生成全长病毒RNA 体外 使用T7 RNA聚合酶进行转录。将转录所得RNA通过电穿孔导入细胞后，成功回收到表现出相似特性的病毒 体外 生长动力学和 体内 小鼠和蚊子中的毒力和感染表型

此处描述的实验方案可用于获得感染性克隆来源的寨卡病毒。与全长版本相比（全长版本极不稳定，数据未显示），在谨慎操作下，双质粒感染性克隆系统的操作更为简便。在对两个不同的片段进行酶切与连接后，使用体外转录系统生成带帽的RNA 体外 使用T7聚合酶进行转录，然后通过电穿孔将产物导入Vero细胞（图1）。质粒序列的正确性可通过小量提取质粒后进行限制性酶切消化作为替代方法进行检测（图 2a）以及在通过RCA或质粒大提进行大规模DNA制备后，经Sanger测序验证。在测序确认克隆正确后，仅需进行酶切和连接即可恢复获得具有感染性的病毒， 体外 转录，最后进行电穿孔。这些步骤可在一天内完成。可通过琼脂糖凝胶电泳监测酶切和连接的正确性（图2b），必要时可进行故障排查。
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本方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中回收具有感染性的寨卡病毒的方法。

感染性cDNA克隆可实现对病毒的遗传操作，从而促进疫苗、致病机制、复制、传播及病毒学等相关研究。

本实验的总体目标是从两部分组成的寨卡病毒Z型DNA克隆中拯救出具有感染性的病毒。该方法可用于解答黄病毒学领域中的关键科学问题，例如疫苗策略、致病机制、传播途径以及病毒进化等。该技术的主要优势在于，相较于全长克隆策略，这种两部分系统具有更高的稳定性。尽管该方法可用于研究寨卡病毒，但也可应用于其他因质粒不稳定而难以克隆的病毒系统。本实验操作将由本实验室的博士后 James Weger 演示。首先，为编码寨卡病毒基因组的两个质粒 P1 和 P2 分别设置酶切反应。在终体积为 100 µL 的反应体系中，用 ApaL1 和 BamH1 High Fidelity 酶对 3.3 µg 的 P1 质粒进行酶切，同时加入具有活性的磷酸酶。对于P2，用ApaL1和EcoR1 High Fidelity在最终体积为100 µL的体系中消化13.3 µg的P2 DNA。将两个反应体系在37 °C下孵育1.2小时。使用商用凝胶和PCR纯化试剂盒纯化消化后的质粒后，向柱子中加入30 µL预热至70 °C的洗脱缓冲液，并孵育五分钟。将纯化的消化后质粒离心沉淀后，在双蒸水中加入纯化的P1和P2各29微升，并加入T4 DNA连接反应缓冲液和T4 DNA连接酶，总体积调整至100微升，配制连接反应体系。将连接反应在室温下孵育两小时。孵育结束后，按前述方法纯化连接产物质粒。此次使用 10 微升预热的洗脱缓冲液。接下来，将未消化的质粒、消化后的质粒以及连接产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。成功的连接反应应产生一条大小约为 11 Kb 的连接产物条带。在确认质粒的分子量正确后，使用八微升纯化的连接反应产物进行T7体外转录反应，并在37摄氏度下孵育四小时。孵育结束后，通过紫外分光光度计测定RNA浓度。在电穿孔前一至两天，为每个待回收的构建体准备一瓶T182培养瓶的Vero细胞。包括一个T182培养瓶作为模拟电穿孔对照。当细胞融合度达到70%至80%时，将含有15%胎牛血清（FBS）和10毫摩尔HEPES的DMEM在37摄氏度水浴中预热。通过胰蛋白酶消化法按照标准方法使细胞脱离，并收集细胞及含有10%FBS的培养基以灭活胰蛋白酶。然后在4°C条件下，以150 × g离心5分钟。用PBS洗涤细胞3次后，将每份细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，含10 mmol/L HEPES，细胞浓度约为0.5 × 10⁷ 个细胞/毫升。取200 µL细胞悬液转移至无菌管中。接下来，向每组细胞中加入 20 微升水作为模拟对照，或加入 20 微升 RNA。通过轻弹管壁轻轻混匀细胞，然后将管内液体转移至 2 毫米间隙的电穿孔比色皿中。将电穿孔仪设置为 170 伏、0 欧姆电阻和 950 微法。将细胞脉冲一次后，立即加入600微升预热的培养基。将细胞加入含有10毫升预热培养基的T75组织培养瓶中。使用随细胞电转杯附带的滴管，吸除电转杯中残留的培养基。轻轻摇动培养瓶以混匀培养基和细胞，随后将其放入37摄氏度培养箱中。从次日开始，每天观察细胞存活情况，直至观察到相对于模拟电穿孔对照组出现50%至75%的细胞死亡。当观察到50%至75%细胞死亡时，收集上清液至锥形管中，随后在4摄氏度条件下以超过3,000 × G离心10分钟，以去除细胞碎片。离心后，将澄清的上清液转移至新管中，并加入胎牛血清（FBS），使其终浓度为20%。此外，加入无菌HEPES至终浓度10毫摩尔/升，作为缓冲剂以维持病毒在冷冻状态下的感染性。最后，通过涡旋混匀病毒溶液，并分装至螺口管中。将病毒于-80摄氏度保存，以备后续使用。该图像显示了野生型PRVABC59和感染性克隆来源的寨卡病毒对非人灵长类Vero细胞系生长动力学的相似影响。该图像还展示了两种病毒对人类胎盘细胞的作用。在蚊源性C6/36细胞系中也观察到类似的生长动力学。该生存曲线显示了用 1,000 PFU 的 PRVABC59 或感染性克隆衍生病毒接种的四周龄干扰素α、β和γ受体敲除小鼠的实验数据。埃及伊蚊在摄取含寨卡病毒的血液餐后14天被解剖。通过蚀斑试验评估蚊虫整体感染情况，检测腿部以评估病毒扩散，或检测唾液分泌物以评估感染性病毒的传播能力。结果以检测的蚊子总数的百分比表示。在进行该操作时，需注意对整个病毒进行测序。同时，为减少病毒复制周期，应在细胞病变效应达到50%至75%时收获病毒。该技术对于黄病毒学领域的研究人员探索寨卡病毒的疫苗、致病机制及病毒进化具有重要意义。

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科研

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Immunology and Infection

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