用 [NiFe] 氢对 H2氧化的研究表明, 蛋白质膜红外电化学

该方案的总体目标是使用蛋白质膜红外电化学或 PFIRE 在非周转和稳态电催化周转条件下探测镍铁氢化酶氧化还原酶的活性侧化学。PFIRE 技术的主要优点是它能够同时对固定在碳电极上的氧化还原蛋白进行精确的电化学控制和红外光谱采样。该方法可以帮助回答生物物理学和生物电化学领域关于稳态催化周转过程中存在哪些氧化还原蛋白状态的关键问题。

首先，在湿厌氧手套箱中，将 20 毫克高表面积炭黑颗粒悬浮在 1 毫升超纯水中。以较低功率对悬浮液进行超声处理至少 15 分钟，或直到颗粒均匀分散且静止时 1 小时内没有沉淀物形成。然后将 15 微升大约每毫升 7 毫克的大肠杆菌氢化酶溶液 1 加载到 50 道尔顿离心过滤装置中。

用 450 微升 pH 值接近氢化酶等电点的低离子强度交换缓冲液稀释溶液。通过以 27， 000 倍 g 离心将混合物浓缩至 50 微升。将混合物再浓缩四次以完成缓冲液更换。

然后将 5 微升每毫升 20 毫克的炭黑分散体与缓冲液交换的氢化酶混合。将混合物在 0 摄氏度下储存过夜，以使氢化酶吸收到炭黑颗粒中。定期检查混合物以保持颗粒分散。

将改性颗粒以 27， 000 倍 g 离心，并验证上清液几乎无色，表明氢化酶对颗粒的良好吸收。实现高水平的吸收对于实验的成功至关重要。我们使用 pH 值接近蛋白质等电点的低离子强度缓冲液作为起点来优化吸收缓冲液。

用 3 到 5 个离心循环洗涤颗粒，并在新鲜的交换缓冲液中重悬。将颗粒混合物浓缩至约 5 μL，以实现每毫升 20 毫克的颗粒负载。要开始准备进行 PFIRE 测量，请在硫酸中进行低功率超声处理 15 分钟，以清洁硅胶内部反射元件。

然后用硝酸 1 小时。然后用超纯水冲洗元件，并在干燥的氮气流下干燥。使用电气级硅酮密封胶将 IRE 固定在五反射 ATR 附件的底板中，注意将密封胶保持在 IRE 的边缘。

让密封剂完全干燥。然后将底板放入 FTIR 分光光度计旁边带有 IR 透明窗口的干燥厌氧手套箱中。将底板安装在 ATR 附件上。

在快速扫描模式下采集背景光谱。然后拆下 ATR 附件底板并将其转移到湿厌氧手套箱中。将 1 微升酶改性炭黑颗粒均匀地滴注在 IRE 表面上，不要让颗粒完全干燥。

重要的是，酶修饰的颗粒混合物已浓缩至尽可能接近 20 毫克/毫升的负载。否则，在此步骤中对颗粒进行滴式铸造时，可能很难获得连接良好的颗粒膜。将一张浸泡在超纯水中的碳纸轻轻地放在 IRE 表面上，确保颗粒膜被覆盖，而不会让纸接触硅酮密封胶。

在 IRE 上安装定制的光谱电化学池。通过溶液入口添加 200 μL 实验缓冲液，以在系统制备过程中保持酶水合。通过蠕动泵管将溶液入口和出口连接到小瓶实验缓冲液。

然后将组装好的电池转移到干燥的手套箱中。将池组件安装在 ATR 附件上，并将管路连接到蠕动泵。使用先前获取的光谱作为背景获取吸收光谱。

验证 MI2 条带在 1， 540 平方厘米处是否清晰可见，并且在 1， 850 至 2， 150 区域可检测到氢化酶活性位点峰。为了准备实验，将负 0.8 伏特的还原电位与饱和甘汞参比电极施加到颗粒膜上。用厌氧氢气浸透实验缓冲液。

然后开始以每分钟约 12 毫升的速度将缓冲液流经光谱电化学池。将样品置于氢饱和实验缓冲液的流动下过夜以激活氢化酶。获取活化样品的吸收光谱，并验证活性位点的 CO 和 CN 谱带是否显示多种还原态。

接下来，用厌氧氮气浸透实验缓冲液，并使缓冲液流过细胞。与饱和甘汞参比电极相比，施加零伏的氧化电位 30 分钟，并获得吸收光谱。然后施加还原电位 30 分钟并获取另一个光谱。

验证酶是否完全氧化，然后被还原。如果没有，请检查电池的电气连接。使用厌氧氢饱和缓冲液，以增加的流速获取一系列循环伏安图，以确定实验的最佳流速。

使用此流速，采集一系列电位和溶液条件下的光谱。在惰性气氛和氢气存在下以各种电位获得大肠杆菌氢化酶 1 的 PFIRE 测量值。在氢气氛下获得的光谱代表了催化氢氧化过程中存在的活性位点态的稳态分布。

然后通过在潜在应用期间的不同时间点获取光谱并制备相对于第一个光谱的不同光谱来研究通过从镍硅形成镍 B 态来厌氧氧化和激活氢化酶。观察到的镍硅向镍 B 的逐渐转化与电流的单调下降一致。还在一系列溶液 pH 值上采集了光谱，以研究氢化酶催化循环的质子转移步骤。

在低 pH 值下，镍 C 状态更普遍，而镍 L 状态在高 pH 值下更普遍。镍 C 和镍 L 相对浓度的 pH 依赖性是根据实验中评估的每个 pH 值下相应峰处的最大吸收剂值确定的。这项技术为生物电化学领域的研究人员探索通过加氢作用活化氢的稳态动力学铺平了道路。

看完这个视频，你应该对一个典型的 PFIRE 实验有一个很好的了解。该技术适用于任何可以通过蛋白质膜电化学研究的氧化还原蛋白，并为电化学测量增加了直接的化学洞察力。