量化睡眠小鼠谱功率与心率的极慢动态变化

本实验的总体目标是描述小鼠非快速眼动睡眠期间神经活动与心脏活动的协调机制。通过监测和分析脑电图、肌电图和心电图信号，该方法有助于回答睡眠研究领域中的关键问题。

例如，睡眠如何协调两种基本且在进化过程中得以保留的需求，即既要保持连续性又要具有脆弱性。该技术的主要优势在于，它采用标准的多导睡眠图，以一种基于对外部刺激产生可变行为反应的新方法来判定非快速眼动睡眠。

我们最初产生这种方法的想法，是源于观察到睡眠中的小鼠对噪声（例如惊醒或继续睡眠）表现出不同的反应。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为它结合了手术操作技巧、最基本的实验操作以及深入的分析过程。由于该方法包含多个本领域内全新的关键步骤，因此对其进行可视化演示至关重要。

特别是在行为设计和数据分析方面。该技术的应用前景可拓展至人类睡眠障碍的诊断，因为它能够识别出极为脆弱的睡眠时段。

开始操作时，使用长度为0.5厘米的金丝制备脑电图皮层电极，将每根金丝焊接到镀金钢螺钉的顶部，然后在70%乙醇中进行清洁。接着，制备两个肌电图-心电图电极，每个电极使用3至4厘米长的金丝。

将金属丝一端距末端1厘米处弯成90度角，并在另一端制备线圈。在两端之间弯曲金属丝，形成与小脑和人字缝之间颅骨表面轮廓相匹配的小弧度。然后，通过在基部用胶带包裹雌性和雄性插针的连接端，制备六通道雌性至雄性头部连接器。

然后在角落的针脚上添加一些焊锡，以方便焊接过程。在此步骤中，通过放置口部位置，将麻醉后的动物置于立体定位仪上。这将固定小鼠的头部。

然后通过将耳杆的钝端抵住颅骨来固定头部。随后在颅骨中线处提起皮肤，并从颈部顶端沿中线轻轻切开提起的皮肤部分，直至眼睛水平位置。然后去除头皮。

确保视野足够大，能够清晰地看到颅骨的前囟和人字缝。使用鳄鱼夹将两侧皮肤固定，以确保暴露骨面。接着用手术刀小心地去除结缔组织。

使用含碘消毒剂清洁该区域，并用无菌棉签擦干颅骨。然后用锋利的手术刀片刮擦颅骨，以获得清洁且无光泽的骨面。仅使用手术刀尖，在骨面上划出网格状的刻痕，刻痕之间的距离为一到两毫米。

随后，使用微型钻头在颅骨的特定位置进行四个颅骨钻孔。钻孔过程中，用巴斯德吸管吹去骨屑，并用消毒棉签清理任何出血。如果发生出血，必须确保出血完全停止后，方可继续操作。

使用止血海绵以加速止血。将螺丝固定在止血钳上。在左侧半球，通过颅骨开孔旋入两个镀金螺丝。

将止血钳垂直持于颅骨开孔上方，在不偏离垂直位置的情况下旋转螺钉。轻轻打开止血钳以释放螺钉。在右侧半球，将先前准备好的电极通过颅骨开孔旋入。

在颅骨中部滴加一滴胶水，以确保左侧肌电-心电（EMG-ECG）电极牢固粘附。用镊子小心地将颈部肌肉处的皮肤边缘提起，将带有线圈末端的EMG-ECG导线插入肌肉中。为了在睡眠期间检测心脏心电信号，需确保EMG-ECG导线插入肌肉的深度约为0.8至1厘米。

将左侧的肌电-心电图电极置于左后侧固定螺钉旁。重复上述操作以植入右侧的肌电-心电图电极。将右侧的肌电-心电图电极置于左前侧固定螺钉旁。

确保将环的两端尽可能远离放置。肌电-心电导线必须足够深地插入肌肉，以可靠地检测心率，这一点非常重要。使用刮刀将双组分环氧胶涂抹于颅骨上螺丝之间及周围区域。

在光照下晾干，但需保护动物的眼睛免受强光照射。尽量将连接器引脚紧密放置，以使用小型鳄鱼夹灯最大限度地降低植入物的高度。将连接器四个角上的引脚分别焊接到四根导线上。

尽量减少与焊头的接触时间，因为焊头会迅速加热螺丝。接着，用牙科水泥填充胶水与连接器之间的空隙，并覆盖焊接部分。应形成光滑的表面，避免出现可能伤害动物的锐利边缘。

此外，避免触碰皮肤，以免引起瘙痒。现在取下鳄鱼夹止血钳。使用含碘消毒剂对伤口进行消毒。

如有必要，使用缝合线在连接器前后对伤口进行缝合。术后每天监测动物，持续一周，观察其是否出现体重减轻、活动减少或异常行为，以及感染迹象。术后5至6天，将记录电缆连接到动物头部连接器上，使其留在其原居住的笼具中。

在开始记录前再等待四到五天，使动物适应环境条件并自然睡眠。使用商用多导睡眠图软件，以通常的设置（如2000倍增益、采集时采样率为2000赫兹，采集后下采样至200赫兹）连续记录48小时的脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）数据。对所有脑电图信号应用0.7赫兹高通滤波器，对所有肌电图-心电图信号应用10赫兹高通滤波器。

在此演示中，小鼠已持续睡眠超过 40 秒。此时脑电图（EEG）显示出典型的低频、高幅信号，同时肌电图（EMG）轨迹显示肌张力较低。在播放噪声之前，必须确保小鼠稳定睡眠至少 40 秒，以获得足够长的基线，用于分析觉醒前或持续睡眠期间的睡眠状态。

现在将给予一个声学刺激，此处为白噪声。在这种情况下，小鼠会在10秒内醒来。请注意，当小鼠醒来时，脑电图（EEG）出现去同步化。

在另一种情况下，小鼠并未苏醒，即使噪音刺激已持续超过20秒。请注意，脑电图（EEG）并未出现去同步化。图中显示了噪音开始前40秒及噪音持续20秒期间的脑电图原始信号（黑色）以及相应的肌电-心电（EMG-ECG）信号（灰色）。

这是一次贯穿睡眠的事件。这是一次醒来的事件示例。此处展示了在噪声出现前40秒时间窗内，贯穿睡眠和醒来事件对应的西格玛功率动态分析数据。

本分析的关键结果是，对于贯穿睡眠事件，sigma 功率在噪声出现前处于低谷，而对于觉醒事件，sigma 功率则处于峰值。与之前呈现的觉醒和贯穿睡眠事件不同，我们排除了早期转入快速眼动（REM）睡眠的事件，同时也排除了在噪声出现前早期觉醒的事件。

在进行该操作时，重要的是确保肌电图（EMG）信号能够在非快速眼动（REM）睡眠期间持续检测心率。此外，请注意分析流程需要在软件脚本中被理解并实现，以提取超慢振荡。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如局部电生理记录或成像技术，以追踪特定脑区内的活动模式。

经过改进后，该技术为人类睡眠领域的研究人员探索神经和心脏活动在健康个体及睡眠障碍患者不同睡眠阶段中的组织方式奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何根据睡眠小鼠对声学刺激的行为反应，对非快速眼动（non REM）睡眠进行回顾性评分与分析。