Name: 量化睡眠小鼠的光谱功率和心率的慢速动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解小鼠非快速眼动睡眠中神经与心脏活动的协调机制，通过脑电图、肌电图和心电图监测技术，分析睡眠对外部刺激的反应性。该方法为睡眠障碍诊断提供新视角。

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感谢所有实验室成员对本文撰写和仔细审阅所做出的贡献。我们感谢 Paul Franken 提供富有启发性的讨论，感谢 Gisèle Ferrand 博士对手术方案提出的有益建议，感谢 Jean-Yves Chatton 博士提供用于噪声暴露实验的原始 Labview 可执行文件。本研究由瑞士国家科学基金会（资助号 31003A_146244 和 31003A_166318）和沃州政府提供经费支持。

所有实验操作均严格遵循洛桑大学动物护理委员会以及沃州消费与兽医事务局的规定进行。
1. 用于脑电图/肌电图-心电图记录的手术
<ol>
	<li>动物饲养与选择
	<ol>
		<li>将动物（C57Bl/6J，7 - 9 周龄，25 - 30 g）单独饲养于标准环境条件下（40% 湿度），保持 12:12 小时明暗循环， 22 &#176;C），提供食物和水 随意摄取.</li>
		<li>仅使用雄性受试者，以避免激素周期对睡眠的所有影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极的制备
	<ol>
		<li>使用长约0.5 cm的金丝（75% Au，13% Ag，12% Cu；直径：0.2 mm）制作脑电图（EEG）/皮层脑电图（ECoG）电极（用于步骤1.3.11），将每段金丝焊接到镀金钢螺钉（长3 mm，基部直径1.1 mm）顶部；参见 图1）。为每只动物准备2个脑电图（EEG）电极，并用70%乙醇清洗。</li>
		<li>准备肌电图-心电图电极，使用长度为 3 - 4 cm 的金丝（75% Au，13% Ag，12% Cu；直径：0.2 mm）。将金丝在一端弯曲成 90&#176; 距一端1 cm处弯折并制备成线圈（1 - 2 mm &#248;）在另一端（图1在两端之间弯曲金属丝，形成一个小的弧度，以匹配小脑与人字缝之间颅骨表面的轮廓。
		<ol>
			<li>每只动物准备2个EMG-ECG电极。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备一个6通道雌雄头端连接器（栅格：2.54 mm × 2.54 mm，尺寸：5 mm × 8 mm × 9 mm，针脚尺寸：5 mm；参见 图1).
		<ol>
			<li>盖上连接器&#160;在雌性和雄性针脚的底部用胶带固定。</li>
			<li>向6个雄性针脚中的4个针尖添加少量焊锡丝，以帮助在手术期间焊接脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）电极（见步骤1.3.16）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55863/55863fig1.jpg" /> 
图1小鼠颅骨上脑电图和肌电图电极植入位点示意图 
颅骨开窗1号和2号位于中线外侧约2 mm，前囟前约2 mm处。颅骨开窗3号和4号位于人字缝前约2 mm，分别位于中线外侧4 mm和2 mm处。两个脑电图（EEG）电极由金丝焊接在镀金钢螺钉（2号和4号）顶部制成，位于右侧半球。左侧两个螺钉（1号和3号）作为支撑。注意，肌电图-心电图（EMG-ECG）电极不应与这两个支撑螺钉接触。EMG-ECG电极为长3 - 4 cm的金丝，弯曲成 90&#176; 吻端角度超过1 cm且卷曲（1 - 2 mm） &#248;在尾端。2个脑电图（EEG）电极和2个肌电图（EMG）电极通过将一根导线焊接到一个角形针脚上，连接至2 × 3通道头部连接器，如虚线所示。有关这些电极及其植入的更多详细信息，可参见 在 29. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55863/55863fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>植入手术
	<ol>
		<li>在异氟烷诱导室中麻醉动物（4 - 5% 异氟烷 + O₂）2 以1-2 L/min流速，持续3-4分钟注入。注入 5 &#181;g/g 在将小鼠从舱室中取出后、进行立体定位固定前，经腹腔（i.p.）注射卡洛芬。</li>
		<li>按照标准操作程序将小鼠固定在立体定位仪上。通过气体麻醉面罩维持异氟烷麻醉（3% 异氟烷 + O₂）2 固定期间保持1 L/min的流速）。整个手术过程中维持体温在 37 &#176;C 使用加热垫。
		<ol>
			<li>使用维生素A软膏保护眼睛，防止干燥。通过测试动物的足爪回缩反射来检查其手术耐受水平。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将耳杆的钝端（而非尖端）放置在颅骨上（不插入耳道）来固定头部29. 将口部固定杆按常规位置放置，以确保头部水平。 
		注意：固定可尽量减少对耳部的损伤，这对于声学唤醒实验至关重要（参见本实验步骤的第4部分）。</li>
		<li>在手术过程中监测动物的呼吸频率，应保持在约每2秒2-3次呼吸。必要时调整气体麻醉机中的异氟烷浓度；手术期间该浓度应逐渐降低，从固定时的3%逐步降至手术结束时的1.0-1.5%。</li>
		<li>注射 100 &#181;L 使用超细胰岛素注射器，每小时腹腔注射一次0.9 % NaCl，以维持动物的水合状态。</li>
		<li>确保动物的头部被明亮的光源照亮。</li>
		<li>用70%乙醇和含碘消毒剂清洁区域（湿润毛发可防止毛发进入手术视野）。</li>
		<li>用有齿镊在颅骨中线处提起皮肤，用精细剪刀沿中线从颈部顶端至眼睛水平位置小心剪开所提起的皮肤。去除头皮组织（前后约1 cm，左右约0.5–0.8 cm）。
		<ol>
			<li>确保窗口足够宽（向两侧延伸），以便清晰观察颅骨的前囟和人字缝。使用鳄鱼钳夹住两侧皮肤并固定，以确保暴露骨面。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用手术刀小心刮除结缔组织（骨膜）。使用含碘消毒剂清洁该区域，并用无菌棉签擦干颅骨。</li>
		<li>使用锋利的手术刀片（15号），刮擦颅骨以获得清洁且无光泽的骨表面。仅使用手术刀片的尖端，刮出网格状的沟槽，沟槽间距约为1 - 2 mm。 
		注意：此步骤可增强双组分环氧胶在步骤 1.3.15 中与颅骨的粘附性。</li>
		<li>使用直径为1/005的微型钻头进行4次开颅手术（约0.7 mm） &#248;) 在颅骨特定位置 (图1；另见步骤 1.3.11.3。使用巴斯德吸管吹去骨粉，并用抗菌棉签清理任何出血。
		<ol>
			<li>若发生出血，需确保出血完全停止后再继续操作。使用止血海绵以加速止血。</li>
			<li>使用右侧半球的两个颅骨开孔插入螺钉电极（颅骨开孔 #2 和 #4）。</li>
			<li>使用左侧半球的两个颅骨开孔插入固定螺钉，以稳定植入物（颅骨开孔 #1 和 #3）。 
			注意：为了增强稳定性，最多可使用4枚锚定螺钉29. 
			注意：精确的立体定位坐标为：双侧半球距中线2 mm，前囟前2 mm（颅窗#1和#2）；人字缝前2 mm，中线左侧4 mm（颅窗#3）；人字缝前2 mm，中线右侧2 mm（颅窗#4）。见 图1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在左侧大脑半球，通过颅骨开孔拧入两枚镀金螺丝以提供支撑。
		<ol>
			<li>将螺钉固定于止血钳中，垂直持于颅骨开孔上方。小心接近颅骨开孔顶部的螺钉底部，保持垂直位置旋转，避免偏移。 
			注意：仅需旋转1.5圈即可在最小化对底层组织压力的同时，获得良好的机械稳定性和高质量信号25.</li>
			<li>在右侧，将先前准备好的电极（见步骤 1.2.1）经颅骨开孔旋入。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用镊子小心地将颈部肌肉处的皮肤边缘提起。将肌电-心电导线插入肌肉内（左侧和右侧），线圈端置于肌肉中。将导线中段粘附于颅骨，使左侧肌电-心电导线从后侧左固定螺钉旁穿出，右侧肌电-心电导线从前侧左固定螺钉旁穿出。</li>
		<li>为在睡眠期间检测心脏的ECG信号，需确保EMG-ECG导线插入肌肉的深度约为0.8 - 1 cm，且其环形末端尽可能远离彼此。</li>
		<li>使用涂有双组分环氧树脂胶的刮刀将胶水涂抹于颅骨上螺钉之间及周围区域。在光照下使其干燥，但需保护动物的眼睛免受强光刺激。 
		注意：螺钉的底部必须被覆盖，只有导线应暴露在外，从胶中伸出。</li>
		<li>确保胶水从表面延伸填充至两个EMG-ECG电极之间的空隙，使电极与支撑螺钉之间无任何电接触。需格外小心，避免将皮肤粘附于颅骨上；皮肤应能在胶水周围自由活动。</li>
		<li>将脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）导线剪至从胶中露出约0.5 mm。将步骤1.2.3中准备好的连接器四个角上的引脚焊接到从胶中引出的四根导线上（图1).
		<ol>
			<li>尽量将连接器引脚放置得尽可能靠近，以最大限度降低植入物的高度；使用固定在立体定位仪上的小型鳄鱼夹来固定连接器的位置。尽量减少与烙铁头的接触时间，因为这会迅速加热螺钉。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用牙科水泥填充胶水与连接器之间的空隙，以覆盖焊接部分。确保表面光滑，避免出现可能伤害动物的尖锐边缘。此外，避免接触皮肤，以免引起瘙痒。</li>
		<li>移除止血夹。如有必要，在连接器前后使用无菌缝合线（可吸收缝合纤维）进行缝合，采用单纯间断缝合方式，并打两个方结（5-0 FS-3针，45 cm缝线）。</li>
		<li>监测动物直至其完全清醒。术后称量动物体重，并将其放回原饲养笼中恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理及系统连接。
	<ol>
		<li>每天监测动物一次，持续一周。观察是否出现体重减轻、活动减少或异常，以及感染迹象。遵循当地兽医主管部门制定的评分程序。</li>
		<li>术后5-6天，将记录电缆连接至动物头部连接器，使其留在其居住笼内。在开始记录前额外等待4-5天，以使动物适应该状态并能够自然睡眠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于觉醒状态判定的脑电图/肌电图-心电图数据基本评分
<ol>
	<li>使用商用多导睡眠图软件连续记录48小时的脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）数据例如， Somnologica、SleepSign 或 Sirenia。使用典型设置，例如 2,000 倍增益；采集时采样率为 2,000 Hz，采集后下采样至 200 Hz；脑电图（EEG）采用 0.7 Hz 高通滤波器，肌电图-心电图（EMG-ECG）采用 10 Hz 高通滤波器。</li>
	<li>导出数据中的 &#34;.edf&#34; 文件格式</li>
	<li>打开 &#34;.edf&#34; 使用自定义编写的文件（例如， 使用Matlab软件对每4秒时段进行半自动分类，判断其为清醒状态、非快速眼动睡眠（非REM睡眠）、快速眼动睡眠（REM睡眠）及相应伪迹。 
	注意：此外，目前已有多种半自动评分软件可供使用。本流程描述了使用此处所用评分软件进行评分设置时必须完成的一些基本步骤；其他半自动评分系统可能基于不同的参数。</li>
	<li>使用软件将 &#34;.edf&#34; 4 次、每次 12 小时的录音文件。
	<ol>
		<li>去除脑电图信号中由肌电-心电活动产生的伪迹或无法归因于特定行为状态的伪迹1,29.</li>
		<li>计算绝对脑电图（EEG）的平均值平均值）以及肌电图（EMG平均值脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）记录信号在12小时内的数值。</li>
		<li>确定每个4秒时段的EEG/EMG平均值（EEG时期/EMG时期).</li>
		<li>将各个时段进行分类 &#34;清醒&#34; 当脑电图（EEG）时期&#60;脑电图平均值 和肌电图（EMG）时代&#62;肌电图平均值 以及 &#34;非快速眼动睡眠&#34; 当脑电图（EEG）时期&#62;脑电图平均值 和肌电图（EMG）时期&#60;肌电图平均值</li>
		<li>根据前一个和后一个时段，使用校正算法对不满足这些标准的时段进行分类。</li>
		<li>当脑电图显示为REM睡眠时，将该时期分类为REM睡眠时期&#60;脑电图平均值 和肌电图（EMG）时期&#60;肌电图平均值.</li>
		<li>优化关键点，例如从非快速眼动睡眠到觉醒的转换、快速眼动睡眠时段，以及非快速眼动睡眠期间的微觉醒。通过视觉检查评分结果，确保警觉状态判断准确29,30. 
		注意：务必对评分结果进行最终的视觉检查与验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑电与心跳的超慢振荡分析
<ol>
	<li>对于此分析，仅选择持续时间 ≥ 96 秒的非快速眼动睡眠片段（即， 至少24个4秒的时段）；参见 图2. 
	注意：定制化程序可根据要求提供1.</li>
</ol>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55863/55863fig2.jpg" /> 
图 2. 在无干扰的非快速眼动睡眠期间确定 Sigma 功率动态变化。 
（A）顶部：一只小鼠在光照期前 100 分钟内的脑电图（黑色）和肌电图-心电图（灰色）轨迹。警觉状态由原始轨迹上方的彩色条表示。中部：一次典型的持续非快速眼动睡眠片段（&gt;96 秒）示例。底部：随机选取的一个 16 秒区间，用于展示划分为 4 秒时间段的情况。后续分析步骤仅针对这四个时间段展示，但该方法适用于该睡眠片段中包含的每个时间段。（B）顶部：根据 A 图底部面板所示的四个 4 秒时间段生成的四个连续快速傅里叶变换（FFT）图谱。Sigma 频段（10–15 Hz）以红色阴影标出。右上角插图：来自最后一个时间段的 1 秒片段，显示平方化肌电图-心电图信号中存在的 R 波。底部：从上方相应频谱中提取的 Sigma 功率随时间变化曲线。虚线表示所选四个非快速眼动睡眠片段之前和之后的功率值延续情况。（C）归一化的 Sigma 功率（红色）和心率（以 BPM 表示）（灰色）时间进程，其中（B）中展示的部分位于两条垂直虚线之间。下方为 Sigma 频段（10–15 Hz）内相应的滤波后脑电图信号。（D）对（C）中所示 Sigma 功率时间进程进行快速傅里叶变换（FFT）分析的结果，显示在 0.016 Hz 处存在一个主导峰。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55863/55863fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>使用快速傅里叶变换（FFT）计算，提取西格玛频段（10–15 Hz）在4秒时间窗内的谱功率值（图2A 和 B）1。</li>
	<li>通过计算所有非快速眼动（non-REM）睡眠片段中各频率段谱功率的平均值，确定非快速眼动睡眠的基线谱功率（排除伪迹以及警觉状态转换期间的片段）。将每个片段的西格玛功率值归一化为在感兴趣时间段内非快速眼动睡眠期间西格玛频段的平均功率。以时间为横坐标作图（图2C）。</li>
	<li>对西格玛功率的时间序列进行快速傅里叶变换（FFT）分析，并采用汉明窗（Hamming windowing），以揭示功率动态中的振荡频率成分（图2D）1。</li>
	<li>注意，由于非快速眼动睡眠片段的持续时间各不相同，所得FFT具有不同的频率分辨率。需进行插值处理，将分辨率调整至最长非快速眼动睡眠片段所获得的最高分辨率，并对所有片段的FFT结果进行平均。</li>
	<li>继续开展此类分析，以描述脑电图（EEG）与心电图（ECG）信号动态之间的相位关系。</li>
	<li>对平方后的EMG-ECG信号进行30 Hz高通滤波后，使用适当的R波峰值检测程序提取心跳数据。 
	注意：将连续两个R波之间的最短时间间隔限制为80 ms，有助于避免因肌肉抽动引起的偶发性伪迹峰值1。</li>
	<li>测量RR间期，并计算每4秒时间窗内的平均心率（单位：每分钟心跳次数，BPM）（图2B 和 C）。</li>
</ol>
4. 噪声暴露
<ol>
	<li>生成噪声 即， 白噪声）通过自行编写的软件进行控制。将声音持续时间设置为 20 秒，强度设置为 90 dB SPL（在笼内测量）。通过标准的有源扬声器播放这些声音1.</li>
	<li>手术后，在适应记录条件期间，全天随机播放实验噪声，每日多次，且在不同时间点进行1.</li>
	<li>在实验条件下（记录脑电图/肌电图/心电图数据时），在光照开始（ZT0）后的前100分钟内随机播放噪声。播放噪声时需满足以下条件1:
	<ol>
		<li>确保小鼠已处于非快速眼动睡眠阶段 &#62; 40 秒。</li>
		<li>确保前一次曝光发生在4分钟以上。 
		注：这将导致每次会话约15次暴露。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记记录时间的起点以及每次噪声暴露的开始时间。在实验过程中，保持实验操作者对非快速眼动睡眠期间的频谱成分处于盲态。</li>
	<li>使用多导睡眠图软件采集所有数据1,29.</li>
</ol>
5. 基于噪声暴露期间行为结果的睡眠回顾性分析
<ol>
	<li>以4秒为分辨率，手动对EEG/EMG-ECG信号进行分期评分，且评分时不知晓噪声暴露时间1。</li>
	<li>使用自定义脚本提取EEG/EMG-ECG/噪声暴露数据1。</li>
	<li>当噪声暴露期间EEG和EMG信号均无变化时，评分为“持续睡眠”（图3A）；当EEG振幅降低、EEG频率升高，并伴随EMG-ECG电极检测到肌肉活动时，判定为“觉醒”（图3B）。</li>
	<li>剔除动物在刺激前阶段或噪声暴露最初4秒内发生觉醒的试验数据（图3D）。</li>
	<li>将觉醒成功率定义为所有纳入试验中觉醒试验所占的比例（“觉醒”和“持续睡眠”）。</li>
	<li>在所有纳入的试验中，分析刺激前阶段σ波功率的动态变化（图3E）1。</li>
</ol>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55863/55863fig3.jpg" /> 
图3．对噪声起始的行为反应结果：用于分析或被排除的代表性数据。 
（A-D）噪声开始前40秒及噪声持续20秒期间的脑电图（EEG，黑色）和相应的肌电图-心电图（EMG-ECG，灰色）信号的原始轨迹，蓝色阴影区域表示噪声时段。警觉状态以颜色编码标示。为说明纳入分析的数据，展示了典型的“继续睡眠”（A）和“觉醒”（B）事件。被剔除的结果包括进入快速眼动（REM）睡眠的转换（C）以及过早的“觉醒”反应（D）。插图显示了REM睡眠特征性的EEG和EMG-ECG轨迹的放大片段。（E）在噪声开始前40秒时间窗内，典型“继续睡眠”（左）和“觉醒”（右）事件的σ波功率动态变化示例。上方显示的是经σ频段带通滤波后的原始EEG轨迹。蓝色区域表示噪声起始。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55863/55863fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文展示了如何建立整合脑电图（EEG）、肌电图（EMG）和心电图（ECG）变量的非快速眼动睡眠（non-REM sleep）连续时间谱型。这是构建小鼠睡眠整合性描述的第一步，有助于识别在非快速眼动睡眠期间对噪声具有高或低恢复力的先前未被认知的时间尺度1。通过类似的分析方法，人类非快速眼动睡眠中也已描述了相似的时间结构1。
本文介绍的方法实现了两个目标。首先，我们指出，多导睡眠图技术能够可靠地在整个小鼠非快速眼动（non-REM）睡眠期间同步获取脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）信号。在快速眼动（REM）睡眠期间，由于肌肉张力消失，心跳信号在肌电图（EMG）记录中最为明显；而在非快速眼动睡眠期间，由于肌肉张力增加以及偶尔出现的肌肉抽动，心跳信号则变得较为隐蔽。将EMG-ECG电极更深地插入肌肉组织，并尽可能增大电极间距，可增强心电R波的振幅，使其能够清晰地从背景肌张力中显现出来。随后，通过峰值检测算法从非快速眼动睡眠期间的EMG-ECG信号中提取心率，并进一步量化其变异性。...

哺乳动物的睡眠是一种处于休息状态且对环境刺激具有抵抗性的行为状态。尽管表面上看似一致，多导睡眠图和自主神经参数表明，睡眠在不同时间尺度和空间尺度上会在性质和数量上存在差异的神经和躯体状态之间转换1。在数分钟至数十分钟的时间范围内，会发生非快速眼动（non-REM）睡眠与快速眼动（REM）睡眠之间的转换。非REM睡眠伴随着脑电图（EEG）中大振幅、低频率的活动，其频谱峰值约为 ~0.5 - 4 Hz；而REM睡眠则表现出规则的θ频段（6 - 10 Hz）脑电活动，并伴有肌肉失张力2。在非REM睡眠内部，人类会循环经历浅睡眠（S2）和深部慢波睡眠（SWS）。正如其名称所示，这两个阶段分别具有较低和较高的觉醒阈值3,4，主要区别在于低频皮层脑电功率的密度，即所谓的慢波活动（SWA；0.75 - 4 Hz）。即使在单次S2和SWS期间，这种非均一性仍持续存在于分钟到亚秒级的时间尺度上，这不仅表现为慢波活动在一次睡眠片段中出现的可变性5,6，也体现在更高频率的脑电图和场电位节律上，包括σ频段（10-15 Hz）的纺锤波和γ节律（80 - 120 Hz）（综述见7,8,9,10）。
这些变化并非细微，而是会将人类的睡眠皮层状态推向频谱的极端。对于非快速眼动（non-REM）睡眠，其范围从以慢波活动（SWA）为主的状态，到因含有大量高频成分而接近觉醒样活动的状态11,12。在啮齿类动物和猫中，尽管非快速眼动睡眠未被划分为不同阶段，但在快速眼动（REM）睡眠开始之前会出现一个短暂的中间睡眠期（intermediate sleep, IS）13。在IS期间，REM睡眠的特征（如海马θ活动和脑桥-膝状体-枕部波）开始出现，同时非REM睡眠的标志性特征（如纺锤波和SWA）仍然存在，表明两种睡眠状态相互混合14,15。然而，IS在功能上可能具有独特性，因为它可受抗抑郁药物的调节16，也可通过先前觉醒期间的新物体呈现而改变17，并且参与设定觉醒阈值18。此外，自由活动大鼠的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）参数的状态空间图显示，非REM睡眠、REM睡眠和觉醒之间存在一个连续的点簇分布14。在未进入觉醒或REM睡眠的情况下，SWA也会出现偶发性下降，导致在一次连续的非REM睡眠过程中，低频与高频成分的相对比例发生显著波动14,19,20。最后，非REM睡眠期间SWA与较高频率节律的比率变化不仅随时间而变，还在不同皮层区域之间表现出振幅和同步性的区域性差异19。
哺乳动物的非快速眼动睡眠远非均一。然而，这种非均一性是否会导致在功能和行为特征上不同的睡眠状态，目前尚不明确。在多种类型的睡眠障碍中，持续的睡眠会因自发性觉醒和不适当的运动行为而中断。此外，频谱分析显示脑电图（EEG）中较高频率成分的相对比例发生变化21，自主神经参数（如呼吸频率和心率）也出现改变22。因此，稳定的睡眠状态之间的有序序列受到干扰，皮层和/或自主神经系统的觉醒成分以不受控制的方式侵入睡眠过程。由此可见，理解睡眠状态的连续性变化可能对疾病机制具有重要意义。此外，在城市环境中，环境噪声对睡眠的干扰与总体健康风险相关，因而明确睡眠期间 heightened vulnerability 的关键时段显得尤为关键23。
在睡眠人类中进行的行为觉醒实验表明，从以慢波活动为主导的非快速眼动睡眠（S3期）中唤醒最为困难，而从浅层非快速眼动睡眠（S2期）和快速眼动睡眠中唤醒则具有相似且较低的觉醒阈值4。短声刺激在快速眼动睡眠、S2期和S3期之间的皮层处理存在显著差异24,25，表明状态特异性的皮层活动模式会调节感觉处理的初始阶段。对于人类的非快速眼动睡眠，个体因噪声而觉醒的可能性随脑电图中纺锤波和α节律的存在而变化26,27,28。纺锤波期间丘脑-皮层节律性活动伴随着丘脑和皮层水平突触抑制的增强，这被认为有助于感觉信息处理的减弱7。
睡眠中抗干扰期与易感期在时间上是如何组织的？其决定因素是什么？我们最近在小鼠和人类中均发现了一种超慢的、频率为0.02 Hz的神经节律振荡。根据这一0.02 Hz振荡的相位不同，小鼠对外部刺激的反应表现出差异：有时会被噪声唤醒，有时则能继续安睡。有趣的是，该振荡与心率变化相关，表明自主神经系统参与了睡眠对外部刺激易感性的调节1。与记忆相关的海马节律也在此振荡中呈现规律性组织，尤为引人注目的是，其振幅强度与人类记忆巩固的质量呈正相关。因此，0.02 Hz振荡似乎是调控啮齿类和人类非快速眼动睡眠的一个组织性原则，同时调节着对外界环境的敏感性以及内部记忆加工过程。这一发现再次强调了对睡眠状态进行多参数、连续性评估的重要性，以揭示其功能特性并识别潜在的脆弱环节。
本文介绍了一种提取这些动态波形的方法，包括小鼠手术植入以进行联合脑电图（EEG/ECoG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）测量、感官刺激暴露以及数据分析流程。该方法为将睡眠视为一种持续变化但高度有序的警觉状态提供了基础，在此状态下，不同的基本睡眠功能依次执行。更广泛而言，该方法适用于在健康和疾病状态下，旨在提取睡眠期间行为结果 preceding 的频谱和自主神经特征的研究策略。

<table><tbody><tr><td>双组分环氧胶</td><td>Henkel</td><td>Loctite EA 3450</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝合线（Prolene）</td><td>Ethicon</td><td>5-0 FS-3</td><td></td></tr><tr><td>Adson镊子</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>消毒棉片</td><td>VWR</td><td>149-0332</td><td></td></tr><tr><td>Attane异氟烷</td><td>Piramal</td><td>Isoflurane 250mL</td><td></td></tr><tr><td>3 x 2通道连接器</td><td>ENA AG</td><td>2.316</td><td>栅距2.54 x 2.54 mm；尺寸5 x 8 x 9 mm；针脚长度5 mm；http://www.ena.ch/</td></tr><tr><td>Dragonfly换向器</td><td>Dragonfly</td><td>型号#SL-10</td><td></td></tr><tr><td>EMBLA放大器</td><td>EMBLA</td><td>A10放大器</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>平头镀金钢螺丝</td><td>J.I. Morris</td><td>FF00CE125</td><td>https://jimorrisco.com/</td></tr><tr><td>金丝</td><td>CMSA</td><td>T.69 5gr</td><td>http://www.cmsa.ch/en/</td></tr><tr><td>止血海绵</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>碘类消毒剂（Betadine）</td><td>Mundipharma</td><td>标准溶液 60mL</td><td></td></tr><tr><td>Komet钻头 1/005PM104</td><td>UNOR AG</td><td>22310</td><td></td></tr><tr><td>Matlab分析软件</td><td>MathWorks</td><td>R2016b</td><td>https://ch.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>微型钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>96758</td><td></td></tr><tr><td>小动物气体麻醉头固定装置</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号923-B</td><td>http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/</td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Pharmamedica</td><td>VITA-POS</td><td></td></tr><tr><td>Paladur（液体）</td><td>UNOR AG</td><td>2260215</td><td>用于牙科水泥</td></tr><tr><td>Palavit（粉末）</td><td>UNOR AG</td><td>5410929</td><td>用于牙科水泥</td></tr><tr><td>小动物立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>型号930</td><td>http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/</td></tr><tr><td>焊锡丝</td><td>Stannol</td><td>593072</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器 - 微型直肠探头</td><td>Phymep</td><td>4090502</td><td>http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/</td></tr><tr><td>温度控制器 - 加热垫</td><td>Phymep</td><td>4090205</td><td>http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/</td></tr></tbody></table>

量化睡眠小鼠谱功率与心率的极慢动态变化

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

哺乳动物的生命主要由三种警觉状态主导：清醒、非快速眼动（非REM）睡眠和REM睡眠。随着在自由活动动物中发现越来越多与行为相关的神经活动特征，这种三分法显得过于简单。在清醒状态下，全局和局部皮层活动的集合，以及瞳孔直径和交感-迷走平衡等外周生理参数，共同定义了不同程度的觉醒水平。目前尚不清楚睡眠是否也构成一个连续的脑状态谱系，在这一谱系中，对感觉刺激的抵抗能力、唤醒能力以及其他可能的睡眠功能是否逐渐变化，以及外周生理状态如何随之协同变化。推进睡眠期间多参数监测方法的研究，并将这些功能特征组合进行归因，对于深化我们对睡眠作为一种多功能过程的理解至关重要——在此过程中，许多有益效应必须得以实现。识别表征睡眠状态的新参数，将为睡眠障碍的诊断开辟新的途径。
我们介绍了一种通过联合监测和分析脑电图（EEG）/皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）和心电图（ECG）信号，结合标准多导睡眠图记录技术，来描述小鼠非快速眼动（non-REM）睡眠状态动态变化的方法。利用该方法，我们发现小鼠的非快速眼动睡眠由一系列协调的神经与心脏振荡周期组成，这些周期产生对外部刺激具有高敏感性和低敏感性的交替阶段，每个阶段持续约25秒。因此，在稳定的非快速眼动睡眠期间，中枢神经系统与自主神经系统协同作用，形成行为上可区分的睡眠状态。本文还介绍了用于多导睡眠图（即， 结合脑电图（EEG）/肌电图（EMG）与心电图（ECG）监测，以追踪自由睡眠小鼠的睡眠周期，分析其动态变化，并采用声学刺激方案评估其对觉醒可能性的影响。该方法已拓展应用于人类睡眠研究，有望揭示哺乳动物非快速眼动（非-REM）睡眠状态的共同组织原则。

图2A （上图）显示了通过多导睡眠图电极记录的100分钟自发睡眠-觉醒行为，电极植入方法如前所述（见 图1). 非快速眼动睡眠（non-REM）开始时，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）振幅的升高与降低清晰可见。间歇出现的快速眼动睡眠（REM）以EEG振幅下降及EMG张力进一步降低为特征，但由于时间尺度压缩，此变化在此图中不可见。放大观察一次非快速眼动睡眠片段，可清晰看到EEG中的高振幅慢波，以及EMG-ECG轨迹中较低的肌肉活动，心率的RR间期以垂直偏转形式叠加于其上。图2A，中图和下图）。快速傅里叶变换（FFT）显示，在所有4秒时间段内，慢波活动（SWA）均占主导地位（图2B）。绘制每个时段的平均sigma功率（10 - 15 Hz...

本文介绍了描述小鼠非快速眼动睡眠期间神经和心脏变量时间动态的实验与分析方法，这些变量可调节睡眠对声学刺激的反应性。

哺乳动物的生命主要由三种警觉状态主导：清醒、非快速眼动（non-REM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠。随着行为的神经相关性研究不断深入……

本实验的总体目标是描述小鼠非快速眼动睡眠期间神经活动与心脏活动的协调机制。通过监测和分析脑电图、肌电图和心电图信号，该方法有助于回答睡眠研究领域中的关键问题。例如，睡眠如何协调两种基本且在进化过程中得以保留的需求，即既要保持连续性又要具有脆弱性。该技术的主要优势在于，它采用标准的多导睡眠图，以一种基于对外部刺激产生可变行为反应的新方法来判定非快速眼动睡眠。我们最初产生这种方法的想法，是源于观察到睡眠中的小鼠对噪声（例如惊醒或继续睡眠）表现出不同的反应。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为它结合了手术操作技巧、最基本的实验操作以及深入的分析过程。由于该方法包含多个本领域内全新的关键步骤，因此对其进行可视化演示至关重要。特别是在行为设计和数据分析方面。该技术的应用前景可拓展至人类睡眠障碍的诊断，因为它能够识别出极为脆弱的睡眠时段。开始操作时，使用长度为0.5厘米的金丝制备脑电图皮层电极，将每根金丝焊接到镀金钢螺钉的顶部，然后在70%乙醇中进行清洁。接着，制备两个肌电图-心电图电极，每个电极使用3至4厘米长的金丝。将金属丝一端距末端1厘米处弯成90度角，并在另一端制备线圈。在两端之间弯曲金属丝，形成与小脑和人字缝之间颅骨表面轮廓相匹配的小弧度。然后，通过在基部用胶带包裹雌性和雄性插针的连接端，制备六通道雌性至雄性头部连接器。然后在角落的针脚上添加一些焊锡，以方便焊接过程。在此步骤中，通过放置口部位置，将麻醉后的动物置于立体定位仪上。这将固定小鼠的头部。然后通过将耳杆的钝端抵住颅骨来固定头部。随后在颅骨中线处提起皮肤，并从颈部顶端沿中线轻轻切开提起的皮肤部分，直至眼睛水平位置。然后去除头皮。确保视野足够大，能够清晰地看到颅骨的前囟和人字缝。使用鳄鱼夹将两侧皮肤固定，以确保暴露骨面。接着用手术刀小心地去除结缔组织。使用含碘消毒剂清洁该区域，并用无菌棉签擦干颅骨。然后用锋利的手术刀片刮擦颅骨，以获得清洁且无光泽的骨面。仅使用手术刀尖，在骨面上划出网格状的刻痕，刻痕之间的距离为一到两毫米。随后，使用微型钻头在颅骨的特定位置进行四个颅骨钻孔。钻孔过程中，用巴斯德吸管吹去骨屑，并用消毒棉签清理任何出血。如果发生出血，必须确保出血完全停止后，方可继续操作。使用止血海绵以加速止血。将螺丝固定在止血钳上。在左侧半球，通过颅骨开孔旋入两个镀金螺丝。将止血钳垂直持于颅骨开孔上方，在不偏离垂直位置的情况下旋转螺钉。轻轻打开止血钳以释放螺钉。在右侧半球，将先前准备好的电极通过颅骨开孔旋入。在颅骨中部滴加一滴胶水，以确保左侧肌电-心电（EMG-ECG）电极牢固粘附。用镊子小心地将颈部肌肉处的皮肤边缘提起，将带有线圈末端的EMG-ECG导线插入肌肉中。为了在睡眠期间检测心脏心电信号，需确保EMG-ECG导线插入肌肉的深度约为0.8至1厘米。将左侧的肌电-心电图电极置于左后侧固定螺钉旁。重复上述操作以植入右侧的肌电-心电图电极。将右侧的肌电-心电图电极置于左前侧固定螺钉旁。确保将环的两端尽可能远离放置。肌电-心电导线必须足够深地插入肌肉，以可靠地检测心率，这一点非常重要。使用刮刀将双组分环氧胶涂抹于颅骨上螺丝之间及周围区域。在光照下晾干，但需保护动物的眼睛免受强光照射。尽量将连接器引脚紧密放置，以使用小型鳄鱼夹灯最大限度地降低植入物的高度。将连接器四个角上的引脚分别焊接到四根导线上。尽量减少与焊头的接触时间，因为焊头会迅速加热螺丝。接着，用牙科水泥填充胶水与连接器之间的空隙，并覆盖焊接部分。应形成光滑的表面，避免出现可能伤害动物的锐利边缘。此外，避免触碰皮肤，以免引起瘙痒。现在取下鳄鱼夹止血钳。使用含碘消毒剂对伤口进行消毒。如有必要，使用缝合线在连接器前后对伤口进行缝合。术后每天监测动物，持续一周，观察其是否出现体重减轻、活动减少或异常行为，以及感染迹象。术后5至6天，将记录电缆连接到动物头部连接器上，使其留在其原居住的笼具中。在开始记录前再等待四到五天，使动物适应环境条件并自然睡眠。使用商用多导睡眠图软件，以通常的设置（如2000倍增益、采集时采样率为2000赫兹，采集后下采样至200赫兹）连续记录48小时的脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）数据。对所有脑电图信号应用0.7赫兹高通滤波器，对所有肌电图-心电图信号应用10赫兹高通滤波器。在此演示中，小鼠已持续睡眠超过 40 秒。此时脑电图（EEG）显示出典型的低频、高幅信号，同时肌电图（EMG）轨迹显示肌张力较低。在播放噪声之前，必须确保小鼠稳定睡眠至少 40 秒，以获得足够长的基线，用于分析觉醒前或持续睡眠期间的睡眠状态。现在将给予一个声学刺激，此处为白噪声。在这种情况下，小鼠会在10秒内醒来。请注意，当小鼠醒来时，脑电图（EEG）出现去同步化。在另一种情况下，小鼠并未苏醒，即使噪音刺激已持续超过20秒。请注意，脑电图（EEG）并未出现去同步化。图中显示了噪音开始前40秒及噪音持续20秒期间的脑电图原始信号（黑色）以及相应的肌电-心电（EMG-ECG）信号（灰色）。这是一次贯穿睡眠的事件。这是一次醒来的事件示例。此处展示了在噪声出现前40秒时间窗内，贯穿睡眠和醒来事件对应的西格玛功率动态分析数据。本分析的关键结果是，对于贯穿睡眠事件，sigma 功率在噪声出现前处于低谷，而对于觉醒事件，sigma 功率则处于峰值。与之前呈现的觉醒和贯穿睡眠事件不同，我们排除了早期转入快速眼动（REM）睡眠的事件，同时也排除了在噪声出现前早期觉醒的事件。在进行该操作时，重要的是确保肌电图（EMG）信号能够在非快速眼动（REM）睡眠期间持续检测心率。此外，请注意分析流程需要在软件脚本中被理解并实现，以提取超慢振荡。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如局部电生理记录或成像技术，以追踪特定脑区内的活动模式。经过改进后，该技术为人类睡眠领域的研究人员探索神经和心脏活动在健康个体及睡眠障碍患者不同睡眠阶段中的组织方式奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何根据睡眠小鼠对声学刺激的行为反应，对非快速眼动（non REM）睡眠进行回顾性评分与分析。

quantifying-infra-slow-dynamics-spectral-power-heart-rate-sleeping

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

量化睡眠小鼠的光谱功率和心率的慢速动力学

介绍了一种用于自由活动小鼠的市售遥测发射器植入手术技术，该发射器可连续测量生物电位（单导联心电图）、心率、核心体温和运动活动。同时提供了术后护理和镇痛的建议与操作规程，以促进动物恢复、改善健康状况并提高存活率。...

植入遥测发射器以获取自由活动实验小鼠心电图、心率、核心体温和活动数据

本视频演示了一种在麻醉小鼠中植入脑电图（EEG）和肌电图（EMG）电极组件的实验方案。该过程包括将小鼠固定于立体定位仪上，在颅骨正中切开皮肤，钻出电极孔位，并固定电极组件以进行信号记录。小鼠苏醒恢复后，利用所记录的信号分析其睡眠-觉醒行为。...

通过脑电图和肌电图记录分析小鼠睡眠行为

在自由活动的小鼠中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）是将行为与睡眠和觉醒的生理状态相关联的关键步骤。本文所述的实验方案提供了一种基于电缆的系统，用于在小鼠中获取脑电图和肌电图记录。...

用于测量小鼠睡眠的多导生理记录操作流程

本文介绍了一种利用同步视频、脑电图（EEG）和心电图（ECG）记录小鼠脑部和心脏生物信号的实验方案。同时，我们还描述了分析所得EEG-ECG记录数据的方法，用于检测癫痫发作、EEG频谱功率、心脏功能及心率变异性。...

同步视频-脑电图-心电图监测用于识别癫痫小鼠模型中的神经心脏功能障碍

我们介绍了一种基于活动性监测的高通量睡眠测量方法，该方法通过动物在栖息笼内的活动情况进行睡眠评估。与传统的基于脑电图（EEG）的方法相比，该方法具有多项优势。该方法在总睡眠时间的测定方面已得到充分验证，可作为监测人类疾病啮齿类动物模型中睡眠状况的有力工具。...

非侵入性、高通量测定啮齿类动物睡眠时长

压力感受性反射是自主神经系统在血压变化时调节心率的一种机制。本文介绍一种手术技术，用于在小鼠体内植入遥测发射器，以持续且同步地测量心电图和血压。该方法可用于测定自发性压力感受性反射敏感性，这是心血管疾病的重要预后指标。...

植入联合遥测心电图和血压发射器以测定清醒小鼠的自发性压力感受性反射敏感性

本文介绍了一种半自动分析小鼠长期心电图（ECG）数据的分步实验方案，用于获取基本 ECG 参数及常见心律失常的分析结果。数据通过植入式遥测发射器在清醒、自由活动的小鼠中采集，并使用 Ponemah...

分析长期心电图记录以检测小鼠心律失常

本方案旨在介绍一种利用微电极阵列记录完整窦房结组织以测量内在心脏起搏频率的新方法，用于识别小鼠的起搏功能缺陷。该方法还可引入药理学试剂，以研究其对内在起搏活动的影响。...

利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠固有心脏起搏功能缺陷

我们提供了一款带有图形用户界面的软件包，供无编程经验的研究人员通过简单的下载和操作即可对小鼠的睡眠阶段进行评分。...

IntelliSleepScorer：一款带图形用户界面的小鼠睡眠阶段自动评分软件包

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

了解小鼠非快速眼动睡眠中神经与心脏活动的协调机制，通过脑电图、肌电图和心电图监测技术，分析睡眠对外部刺激的反应性。该方法为睡眠障碍诊断提供新视角。

量化睡眠小鼠谱功率与心率的极慢动态变化

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