Name: 光学相干断层扫描: 成像小鼠视网膜神经节细胞在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习使用高分辨率光谱域光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜神经节细胞进行活体成像。该方法可快速准确评估视网膜厚度，为视神经病变研究提供非侵入性检测手段。

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本工作由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、蒙彼利埃大学、法国视网膜协会、法国国家盲人与视力障碍者联盟（UNADEV）、Wolfram综合征协会、法国医学研究基金会、法国基金会以及卓越实验室EpiGenMed项目资助。

实验方案已获得法国国家健康与医学研究院（Inserm；法国蒙彼利埃）的批准，符合欧洲相关指令，并遵守ARVO关于在眼科研究中使用动物的声明。本研究在朗格多克-鲁西永动物实验伦理委员会（CEEALR；编号CEEA-LR-12123）的许可下进行。
1. 仪器设置与成像前准备
注意：此处使用谱域（SD）眼科成像系统对小鼠视网膜进行光学相干断层扫描（OCT）（图1A）。SD-OCT设备由基座和带有啮齿类动物校准平台（RAS）的动物成像支架（AIM）组成（图1B）。基座包含计算机、OCT引擎、SD-OCT探头以及专用于小鼠的镜头。探头安装在AIM上，AIM包含Z轴平移装置。RAS通过配备X轴和Y轴平移台的载物台、可旋转和摆动的样品盒，以及可拆卸的咬合杆和鼻带，实现小鼠的精确定位。制造商提供的软件可用于OCT图像的采集与分析，但后者也可使用开源图像处理程序完成。
<ol>
	<li>将探针牢固地放入AIM中。</li>
	<li>将小鼠专用镜头连接至探头。</li>
	<li>调整参考臂设置以适配特定镜头（此处功率设为 086，位置设为 964）。</li>
	<li>确保小鼠专用镜头与胶片盒保持足够距离，将带有鼻带的咬合杆安装到胶片盒上。 
	注意：可通过位于AIM后部的Z轴调节螺钉来调整镜头与暗盒之间的距离。鼻带为市售弹性带，应根据小鼠的大小调整其张力。</li>
	<li>打开电源（推车右下角），然后启动计算机。</li>
	<li>双击屏幕上的相应快捷方式以启动成像程序。 
	注意：这取决于镜头类型；此处为小鼠视网膜。</li>
	<li>创建一项新的临床研究并添加所需的方案；否则，使用现有的临床研究和/或方案。
	<ol>
		<li>通过选择添加一项新研究 &#34;研究名称&#34;; &#34;ID&#34;; &#34;治疗组规格&#34; （此处， &#34;未分类&#34;）；以及预定义的 &#34;扫描方案&#34;，如果存在的话。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个 &#34;检查者&#34; 在 &#34;临床研究&#34; 部分 
	注意：对于新的 &#34;检查者&#34;，前往 &#34;设置检测人员 &amp;#38; 医师&#34; 来定义它。</li>
	<li>在“患者/检查”部分，通过点击“添加患者”并输入 &#34;ID&#34;, &#34;名称&#34;, &#34;姓氏&#34;, &#34;性别&#34;，以及 &#34;出生日期&#34; （可选） 
	注意：若更方便，可在每次测试小鼠前进行此操作。确保编号不超过10个字符。该小鼠双眼的屈光误差为0，眼轴长度为23.0。</li>
	<li>点击 &#34;添加考试&#34; 并选择所需的 &#34;实验方案&#34; 通过添加 &#34;预设扫描&#34; 从列表中选择，从首先测量的眼睛开始（此处为右眼），或通过自定义扫描进行。</li>
	<li>要自定义扫描，可使用现有的扫描作为模板进行编辑，或从头开始创建。 &#34;添加自定义扫描&#34; 选项。添加所有扫描至列表后，使用以下方式定义新协议 &#34;输入 &#34;新实验方案名称&#34; 选项（OS：oculus sinister，左眼；OD：oculus dexter，右眼）。 
	注意：本方案包含三次扫描：（i）径向扫描，直径1.4 mm，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，每体积100个B扫描，每B扫描1帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积；（ii）矩形扫描，长和宽均为1.4 mm，角度0°，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，共100个B扫描，每B扫描1帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积；（iii）环形扫描，最小直径0.4 mm，最大直径0.6 mm，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，每体积3个B扫描，每B扫描48帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积。</li>
</ol>
2. 小鼠准备
<ol>
	<li>瞳孔散大与固定
	<ol>
		<li>在数据采集前至少15分钟，向小鼠眼内滴入10%去氧肾上腺素滴眼液，去除多余液体后，再滴入0.5%托吡卡胺滴眼液。 
		注意：首次散瞳可一次性对本实验批次中所有小鼠进行。确保液体处于室温。</li>
		<li>在实施全身麻醉后（步骤2.2），立即滴加0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，保持3秒以麻醉并固定眼球。随后擦去滴眼液，并重复滴入10%去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺，以确保瞳孔充分散大。 
		注意：确保液体处于室温，并防止小鼠吞咽奥布卡因。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全身麻醉
	<ol>
		<li>配制含氯胺酮（20 mg/mL）和赛拉嗪（1.17 mg/mL）的生理盐水麻醉溶液。4 °C保存，最长不超过2周。</li>
		<li>测试前约5分钟，根据小鼠年龄和体型，按每克体重5 - 10 µL剂量经腹腔注射麻醉液。 
		注意：幼龄和/或体型瘦小的小鼠所需麻醉剂量较小，起效更快，但苏醒也更快。本实验中采用8 µL/g（即氯胺酮160 mg/kg，赛拉嗪9.33 mg/kg）。</li>
		<li>可选：使用黏性滴眼液或眼用凝胶润滑眼球，以防角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠体位摆放
<ol>
	<li>使用粘稠的甘油基滴眼液润滑眼睛，以保持角膜湿润。 
	注意：若检查过程中眼睛显得干燥，需重新滴加滴眼液。</li>
	<li>用外科纱布包裹小鼠，以保持其体温。</li>
	<li>使用海绵或棉芯，在每只眼睛上涂抹一层含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，以减少光线折射、避免混浊，并确保角膜湿润。操作时应将眼睫毛和胡须拨开。</li>
	<li>将小鼠放入样品架中，头部保持正直并朝向前方。</li>
	<li>轻轻打开咬合杆夹具，将咬合杆放入小鼠口中，并使用鼻带固定其位置。 
	注意：确保咬合杆位于样品架中央。</li>
	<li>若正在检测右（左）眼，则在右侧（左侧）下方放置棉卷。</li>
	<li>保持夹式对焦头固定在小鼠专用镜头上，通过逆时针旋转Z轴平移螺钉，将镜头缓慢移向眼睛。</li>
	<li>通过旋转和摆动样品架，以及调节咬合杆和X轴平移螺钉，预先设定小鼠的位置；目标是使右眼正对镜头，从而对齐眼睛与镜头的光轴。 
	注意：若小鼠位置过高或过低，应首先使用Y轴平移螺钉进行调整。</li>
	<li>在 &#34;Exam&#34; 中选择首个扫描项目，点击 &#34;Start Aiming&#34;，并对视网膜成像进行进一步的手动调整。
	<ol>
		<li>使用Z轴平移螺钉，在左侧面板上垂直移动视网膜（图2，水平B扫描对齐），在右侧面板上水平移动视网膜（图2，垂直B扫描对齐）。</li>
		<li>旋转样品架，通过上下移动视盘（ONH）使其位于右侧面板中央；使用咬合杆螺钉校正右侧面板上的视网膜直线；摆动样品架，使视盘位于左侧面板中央。</li>
		<li>使用X轴平移螺钉校准左侧面板上的视网膜水平。在明确各调节装置主要功能的基础上，进一步调整视网膜位置，使视盘居中。 
		注意：如有需要，可使用Y轴平移螺钉在右侧面板上上下移动视盘。可在每次扫描之间随时对位置进行精细调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 视神经乳头和视网膜的谱域光学相干断层成像（SD-OCT）
<ol>
	<li>调整满意后，点击 &#34;开始扫描&#34; 以开始 SD-OCT 扫描。
	<ol>
		<li>若无需进行三维成像，请取消勾选 OCU 选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存扫描图像和报告。</li>
	<li>继续进行下一次扫描。</li>
	<li>如需对第二只眼成像，在撤回镜头后，相应地旋转盒式组件，并重复步骤 3.6 - 4.3。</li>
</ol>
5. 采集完成
<ol>
	<li>采集完成后，将小鼠从样品架中取出，每只眼睛滴加含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上使其苏醒。</li>
	<li>最后一次采集结束后，关闭软件，并关闭计算机和OCT仪器（电源按钮）。</li>
	<li>使用消毒剂清洁样品架。</li>
</ol>
6. 分析
<ol>
	<li>进行视网膜层厚度测量时，使用制造商提供的自动分割软件。
	<ol>
		<li>点击 &#34;患者&#34;，从列表中选择所需的 &#34;检查&#34;，然后点击 &#34;查看检查&#34; 选项。</li>
		<li>通过在目标扫描图像上右键单击文件夹图标，将所需的OCT数据加载到OCT软件中。</li>
		<li>右键单击B扫描图像；通过启用最多10个测量卡尺来配置卡尺；并输入其名称、角度和颜色。</li>
		<li>通过在B扫描图像上右键单击，选择所需的卡尺，并将其相应地放置在视网膜上进行测量。 
		注意：对于以视神经乳头（ONH）为中心的扫描，在其两侧各设置5个卡尺，彼此等距分布。进行乳头周围分析时，确保卡尺不要离ONH太远。对于径向扫描，分析OCT软件选定的每幅扫描中的10张图像。其编号可在 &#34;报告&#34; 文件夹中找到。</li>
		<li>通过右键单击B扫描图像并点击 &#34;保存结果&#34;，将结果保存至电子表格软件进行分析。 
		注意：结果文件位于与扫描数据相同的文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，使用为开源图像处理程序开发的自制卡尺宏 &#34;MRI Retina Tool&#34;（参见材料表）。
	<ol>
		<li>确保 &#34;MRI Retina Tool&#34; 和 &#34;Modify Polygon Section Tool&#34; 宏已激活。加载图像后，点击m按钮以开始测量。 
		注意：该宏会自动在ONH两侧各创建一个长度为0.2 mm的测量盒。每个测量盒包含5个作为卡尺使用的测量点。其横向位置不可更改，专为径向扫描中的乳头周围区域定制。测量盒的水平位置预设用于测量RNFL/GCL厚度，但可轻松修改以测量GC复合层。如果扫描质量较差，则需要调整水平位置，或从分析中排除该图像。</li>
		<li>如需进行水平调整，请点击e按钮。在新打开的 &#34;ROI Manager&#34; 窗口中，选择第一个测量盒。</li>
		<li>点击蓝色多边形按钮，并通过点击图像中被测层的边界来调整第一个测量盒的位置。</li>
		<li>首先在 &#34;ROI Manager&#34; 窗口中选择第二个测量盒，然后点击相应的图像区域完成调整。点击r按钮重新测量。在 &#34;Measurements&#34; 窗口中查看结果。 
		注意：结果可随时复制到电子表格软件中。结果包含以下数值（右测量盒r、左测量盒l及总体total）：Intden — 测量盒内的积分密度；Area — 测量面积，单位为 mm2；Len — 测量盒内卡尺的长度，单位为 mm；Mean — 测量盒内信号的平均强度；Std — 信号平均强度的标准误差。</li>
		<li>继续处理下一张图像。</li>
		<li>在电子表格软件中进一步分析数据。 
		注意：要计算该层的平均厚度，请取10个Len值的均值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+retinal+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art retinal optical coherence tomography.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).</li>
<li>Grenier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WFS1+in+Optic+Neuropathies%3A+Mutation+Findings+in+Nonsyndromic+Optic+Atrophy+and+Assessment+of+Clinical+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity.</a> Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).</li>
<li>Zmyslowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thinning+as+a+marker+of+disease+progression+in+patients+with+Wolfram+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome.</a> Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).</li>
<li>Fischer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+in+vivo+assessment+of+mouse+retinal+structure+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography.</a> PLoS One. 4 (10), e7507(2009).</li>
<li>Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+the+Retina+With+Full-Field+Optical+Coherence+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).</li>
<li>Mustafa, S., Pandit, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+diagnosis+and+management+of+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+India%22%5BJournal%5D)">Approach to diagnosis and management of optic neuropathy.</a> Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+OPA1delTTAG+mutation+induces+premature+age-related+systemic+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse.</a> Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steroidogenesis+promotes+early-onset+and+severe+vision+loss+in+females+with+OPA1+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy.</a> Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).</li>
<li>Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1248/">Gene Reviews</a>. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).</li>
<li>Lenaers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant optic atrophy.</a> Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).</li>
<li>Delettre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+gene+OPA1%2C+encoding+a+mitochondrial+dynamin-related+protein%2C+is+mutated+in+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy.</a> Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+retinal+morphologic+and+functional+changes+in+mice+following+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

OCT系统是一种非侵入性 体内 成像方法，可提供高分辨率的类似视网膜横截面的扫描图像。因此，其主要优势在于具备进行详细分析的潜力，并能很好地将常规应用于人类的实验方案转用于小鼠模型。
在 Opa1delTTAG 突变小鼠的示例中，谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）结果显示视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞复合层厚度增加，从而为进一步探索常染色体显性视神经萎缩（DOA）的病理生理机制提供了可能9。仅依靠组织学分析无法实现这一发现。相比之下，组织学无法像环形或放射状OCT扫描那样对整个视网膜进行可视化观察。此外，考虑到在包含多个时间点的研究中所需动物数量增加，组织学方法更加耗时且成本更高。事实上，SD-OCT技术推动了对DOA中一种新型视网膜细胞——穆勒细胞（Müller cell）——的发现9。尽管该系统无法实现单细胞分辨率或特异性细胞识别，但通过对视乳头周围区域以厚度或整体状态为重点的分析，已足以检测到细胞退变。随后，可在...

光学相干断层扫描（OCT）是一种诊断工具，可实现对视网膜结构1（包括视神经乳头（ONH））的检查。多年来，它已成为评估人类2,3以及啮齿类动物4,5疾病进展的可靠指标。该技术利用干涉测量法生成视网膜各层的横截面图像，轴向分辨率达2-µm。最内层为视网膜神经纤维层（RNFL），其中含有视网膜神经节细胞（RGC）的轴突；其外侧为神经节细胞层（GCL），主要包含RGC胞体。接下来是内丛状层（IPL），RGC的树突在此与双极细胞、水平细胞和无长突细胞的轴突相连接。这些细胞连同水平细胞共同构成内核层（INL），其突起进一步与光感受器细胞的轴突在外丛状层（OPL）中连接。随后是外核层（ONL），包含光感受器细胞的胞体，该层与光感受器层之间由外限制膜（OLM）分隔，后者也称为内节/外节（IS/OS）层。最后，在小鼠视网膜中可观察到的最外层结构为视网膜色素上皮层（RPE）和脉络膜（C）。在小鼠中，RNFL通常过于菲薄而难以单独测量；因此，分析RNFL/GCL复合层更为可取4,5。另一种选择是神经节细胞复合层（GC complex layer），该层除包含GCL外，还纳入了IPL，因而厚度更大，在OCT扫描中更易于测量4。因此，OCT可提供关于视网膜病理状态的信息，例如在视神经病变（OPNs）中的应用。
或者，小鼠视网膜的厚度通常通过以下方法进行分析： 死后 组织学。然而，该技术在组织采集、固定、切片、染色、封片等方面存在局限性 等等。 因此，一些缺陷（例如细微的厚度变化）无法被检测到。最后，由于同一小鼠无法在多个时间点进行检测，导致每项研究所需的动物数量大幅增加，而光学相干断层扫描（OCT）则不存在这一问题。综上所述，OCT技术因其非侵入性、高分辨率、可重复性、随时间进行动态监测以及操作简便等优势，成为视网膜疾病研究的首选方法。
小鼠模型被用于鉴定基因缺陷并阐明视网膜病变的分子机制6。视神经病变（OPN）是一种以视神经（ON）严重损伤为特征的视网膜病变，ON由约120万根视网膜神经节细胞（RGC）轴突组成。OPN可原发于视神经，也可继发于其他先天性或后天性疾病7，导致视野缺损，最终致盲。OPN的典型特征是RGC丢失和ON损伤，这些可在人类光学相干断层扫描（OCT）中观察到，表现为视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞层（GCL）变薄2,3。然而，OPN的病理生理机制仍不甚清楚，因此仍需对小鼠视网膜进行研究。
本文以 Opa1delTTAG 小鼠品系8,9（一种常染色体显性视神经萎缩（DOA）模型）为例，描述了视网膜各层厚度的成像与定量方法10。为评估视网膜神经节细胞（RGC）的病理生理状态，对放射状、矩形及环形扫描图像进行了定量分析。定量可采用光学相干断层扫描（OCT）软件自带的标准卡尺工具，或使用为开源图像处理程序开发的自制宏来完成。标准卡尺操作困难，且其宽度常大于视网膜神经纤维层（RNFL）/神经节细胞层（GCL）的实际厚度；而自制卡尺使用简便、可重复性强且更为精确。该宏可在视盘周围区域视盘两侧的固定位置，自动识别视网膜层并进行五个点的厚度测量。本方案的目标是描述OCT扫描的获取流程，以明确视网膜定位，重点关注RGCs的分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opa1&lt;em&gt;&lt;sup&gt;delTTAG&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>法国蒙彼利埃神经科学研究所，INSERM UMR 1051</td><td>-</td><td>Opa1基因敲入小鼠携带&amp;nbsp; C57Bl6/J 背景下的 OPA1 c.2708_2711delTTAG 突变</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统</td><td>Bioptigen，Leica Microsystems，德国</td><td>-</td><td>光谱域光学相干断层扫描系统</td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统软件</td><td>Bioptigen，Leica Microsystems，德国</td><td>-</td><td>OCT图像采集与分析软件</td></tr><tr><td>ImageJ 1.48v</td><td>Wayne Rasband，美国国立卫生研究院</td><td>-</td><td>用于分析的软件，需下载并安装两个自制宏：http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool</td></tr><tr><td>自调节加热板</td><td>Bioseb，法国</td><td>BIO-062</td><td>抗低体温</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鼻带</td><td>-</td><td>-</td><td>弹性带</td></tr><tr><td>纱布垫 3&quot; × 3&quot;</td><td>美国 Curad 公司</td><td>CUR20434ERB</td><td>抗低体温保护</td></tr><tr><td>双头棉签 applicator</td><td>美丽之源，CVS健康公司，美国</td><td>-</td><td>凝胶应用</td></tr><tr><td>棉签</td><td>法国 CentraVet</td><td>T.7979C.CS</td><td>小鼠定位</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂和药物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&amp;eacute;osyn&amp;eacute;phrine Faure 10%</td><td>Laboratoires Europhtha，摩纳哥</td><td>-</td><td>瞳孔散大</td></tr><tr><td>0.5% Mydriaticum</td><td>实验室 Th&amp;eacute;法国</td><td>3397908</td><td>瞳孔散大</td></tr><tr><td>Cebesine 0.4%</td><td>Laboratoire Chauvin, Bausch&amp;安普&罗姆，法国</td><td>3192342</td><td>局部麻醉</td></tr><tr><td>Imalgene 1000</td><td>法国 Merial / 法国 CentraVet</td><td>IMA004</td><td>全身麻醉</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>拜耳医疗，德国/ CentraVet，法国</td><td>ROM001</td><td>全身麻醉、镇痛、肌肉松弛</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>法国 Osalia 实验室&amp;nbsp;</td><td>103697114</td><td>生理盐水</td></tr><tr><td>Systene Ultra</td><td>爱尔康，诺华，美国</td><td>-</td><td>眼部水合</td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>爱尔康，诺华，美国</td><td>-</td><td>用于减少光线折射和混浊的眼科凝胶</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>法国 Laboratoires Anios</td><td>59844</td><td>消毒剂</td></tr></tbody></table>

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 in vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

视网膜结构改变是眼科疾病的常见表现。光学相干断层扫描（OCT）可实现对其的识别。 体内—快速、重复且高分辨率地成像。本方案将描述小鼠视网膜的光学相干断层扫描（OCT）成像，作为一种研究视神经病变（OPN）的有力工具。OCT系统是一种基于干涉测量技术的非侵入性方法，可作为常规 死后 组织学检测。该方法可快速准确地评估视网膜厚度，从而实现对视网膜变薄或增厚等变化的动态监测。本文以 Opa1 为例，介绍成像过程及分析方法。delTTAG 小鼠品系。建议采用三种扫描方式，并提供两种定量分析方法：标准卡尺法和自制卡尺法。后者在进行放射状扫描时更适用于视乳头周围视网膜，因其精度更高，更适合分析较薄的结构。本文所述所有方法均针对视网膜神经节细胞（RGC）设计，但可轻松适配于其他细胞群体。总之，光学相干断层扫描（OCT）在小鼠模型表型分析中具有高效性，并有望用于治疗干预效果的可靠评估。

SD-OCT 技术能够实现与组织学相媲美的视网膜成像和厚度分析，且速度更快、细节更丰富图3）。如在野生型C57Bl/6小鼠中所呈现的，尽管SD-OCT扫描的质量（图3A，右侧）不如视网膜横截面图像的成像效果好图 3A，左侧），可显示更多层（例如， OLM）。此外，该方法包括小鼠准备在内仅需约40分钟，而组织学分析则需数天至数周。最后，该方法无需进行苏木精、伊红和番红等处理与染色步骤，避免了可能的组织损伤及由此导致的错误数据采集。OCT可清晰测量的视网膜层次包括RNFL/GCL、IPL、INL、OPL、ONL、IS/OS、RPE和C（图3B），因此可对整个视网膜进行复杂而深入的研究。视网膜结构的变化能够反映疾病的发展过程。对于视神经通路疾病（OPNs），这主要涉及视网膜神经节细胞（RGCs）以及视神经（ON），因而也包括...

本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

视网膜结构改变是眼科疾病的常见表现。光学相干断层扫描（OCT）可实现对其的识别……

本实验的总体目标是利用光学相干断层扫描（OCT）快速获得对视网膜厚度的准确评估。OCT 可以帮助解答眼科领域的一些关键问题，例如视神经病变。该技术的主要优势在于，它是一种用于检测小鼠视网膜神经节细胞结构变化的非侵入性方法。该技术非常有趣，因为它是一种无创、安全且可靠的方法，可用于检测治疗视神经病变的效果。首先，调整参考臂的设置，使其与镜片相匹配。然后，打开电源和计算机。当计算机准备就绪后，启动成像程序。创建新的临床研究并添加所需的检查协议。进入患者检查部分，设置检查默认参数。单击“患者检查”部分中的“添加患者”以添加新患者，并输入相关的患者信息。然后单击“添加检查”、“开始检查”，并从列表中添加预设扫描，选择所需的检查方案，首先从将要测量的第一只眼开始。在数据采集前至少15分钟，向所有待测小鼠的每只眼睛中滴入室温的10%去氧肾上腺素滴眼液。然后去除多余的试剂，滴加数滴室温下0.5%的托吡卡胺。在开始采集前约五分钟，诱导全身麻醉。紧接着，向每只眼睛给予0.4%盐酸奥布卡因，使溶液停留三秒钟，以麻醉并固定眼球。然后，去除液滴，并重复滴加10%去氧肾上腺素和0.5%环喷托酯。当瞳孔充分散大至适合成像时，使用黏性乙二醇基眼药水润滑眼睛以保持角膜湿润，并用外科纱布包裹小鼠以维持体温。使用海绵或棉芯，在每只眼睛上涂抹一层含有0.3%羟丙基甲基纤维素的滴眼凝胶。操作时，将眼睫毛和胡须拨至一旁。将小鼠放入样品盒中，使其头部保持正直并朝向前方，小心地将咬合杆放入其口腔内。在动物待检眼的一侧下方放置棉卷。然后，将夹子对准小鼠专用镜头的瞄准尖端，逆时针旋转z轴位移器螺丝，使镜头向眼睛方向移动。通过旋转和摆动样品盒、调节咬杆及x轴位移器螺丝，预设小鼠的位置，直至实验眼正对镜头中心。当眼睛的光轴与镜头光轴对齐后，在检查中选择第一项扫描。单击开始对准，使用 z 向调节螺丝在左侧面板中垂直移动视网膜，在右侧面板中水平移动视网膜。通过旋转样本盒，上下移动视神经乳头，使其位于右侧面板中央。使用咬合杆螺丝在右侧面板内校正视网膜的方位，并摆动样本盒，使视神经乳头位于左侧面板中央。然后使用 x-translator 螺丝在左侧面板内调平视网膜，并根据每个调制器的主要功能，进一步调整视网膜位置，使其精确对准视神经乳头中心。当视网膜定位完成后，单击“开始快照”以启动谱域光学相干断层扫描。切记保存扫描图像和报告。必要时调整居中位置。扫描完成后，收回镜头，按照上述方法定位第二只眼睛。完成第二只眼睛的扫描后，将小鼠从样品架中取出，为每只眼睛涂抹含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上，在监测下保温直至完全恢复。为了专注于视网膜神经节细胞，使用为 ImageJ 开发的 MRI 视网膜工具宏。打开 MRI 视网膜工具，修改多边形选择工具，并加载目标图像。点击 M 开始测量，然后点击 E 调整水平位置。在新打开的兴趣区域管理器窗口中选择第一个样本盒。单击蓝色多边形，然后单击图像中被测层的边界，以调整第一个图框的位置。在感兴趣区域管理器窗口中选择第二个图框并调整其位置。然后单击 R，重新测量视网膜，并在测量结果窗口中查看结果。尽管谱域OCT扫描的质量不如视网膜横截面图像，但OCT能够显示更多的视网膜层次。在OCT扫描中，视网膜各层易于测量，包括视网膜神经纤维层、节细胞层、内核层、外丛状层、外核层、内节与外节层、视网膜色素上皮层以及脉络膜，从而实现对整个视网膜的复杂研究。OCT对视网膜厚度的测量结果表明，遗传性OPA1突变雌性小鼠在视觉受损的情况下，其节细胞复合体及视盘周围视网膜神经纤维层出现进行性增厚。使用标准卡尺与自制卡尺对视网膜神经节细胞层的神经纤维厚度进行比较，结果表明，标准卡尺测得的厚度显著低于自制卡尺。这是因为标准卡尺较厚，难以精确放置于薄层边界。一旦掌握该技术，若操作正确，可在15分钟内完成。OCT技术问世后，为眼科领域研究人员分析小鼠视网膜结构变化开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠中进行视网膜神经节细胞的光学相干断层扫描成像及其分析方法。

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