光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

本实验的总体目标是利用光学相干断层扫描（OCT）快速获得对视网膜厚度的准确评估。OCT 可以帮助解答眼科领域的一些关键问题，例如视神经病变。该技术的主要优势在于，它是一种用于检测小鼠视网膜神经节细胞结构变化的非侵入性方法。

该技术非常有趣，因为它是一种无创、安全且可靠的方法，可用于检测治疗视神经病变的效果。首先，调整参考臂的设置，使其与镜片相匹配。然后，打开电源和计算机。

当计算机准备就绪后，启动成像程序。创建新的临床研究并添加所需的检查协议。进入患者检查部分，设置检查默认参数。

单击“患者检查”部分中的“添加患者”以添加新患者，并输入相关的患者信息。然后单击“添加检查”、“开始检查”，并从列表中添加预设扫描，选择所需的检查方案，首先从将要测量的第一只眼开始。在数据采集前至少15分钟，向所有待测小鼠的每只眼睛中滴入室温的10%去氧肾上腺素滴眼液。

然后去除多余的试剂，滴加数滴室温下0.5%的托吡卡胺。在开始采集前约五分钟，诱导全身麻醉。紧接着，向每只眼睛给予0.4%盐酸奥布卡因，使溶液停留三秒钟，以麻醉并固定眼球。

然后，去除液滴，并重复滴加10%去氧肾上腺素和0.5%环喷托酯。当瞳孔充分散大至适合成像时，使用黏性乙二醇基眼药水润滑眼睛以保持角膜湿润，并用外科纱布包裹小鼠以维持体温。使用海绵或棉芯，在每只眼睛上涂抹一层含有0.3%羟丙基甲基纤维素的滴眼凝胶。

操作时，将眼睫毛和胡须拨至一旁。将小鼠放入样品盒中，使其头部保持正直并朝向前方，小心地将咬合杆放入其口腔内。在动物待检眼的一侧下方放置棉卷。

然后，将夹子对准小鼠专用镜头的瞄准尖端，逆时针旋转z轴位移器螺丝，使镜头向眼睛方向移动。通过旋转和摆动样品盒、调节咬杆及x轴位移器螺丝，预设小鼠的位置，直至实验眼正对镜头中心。当眼睛的光轴与镜头光轴对齐后，在检查中选择第一项扫描。

单击开始对准，使用 z 向调节螺丝在左侧面板中垂直移动视网膜，在右侧面板中水平移动视网膜。通过旋转样本盒，上下移动视神经乳头，使其位于右侧面板中央。使用咬合杆螺丝在右侧面板内校正视网膜的方位，并摆动样本盒，使视神经乳头位于左侧面板中央。

然后使用 x-translator 螺丝在左侧面板内调平视网膜，并根据每个调制器的主要功能，进一步调整视网膜位置，使其精确对准视神经乳头中心。当视网膜定位完成后，单击“开始快照”以启动谱域光学相干断层扫描。切记保存扫描图像和报告。

必要时调整居中位置。扫描完成后，收回镜头，按照上述方法定位第二只眼睛。完成第二只眼睛的扫描后，将小鼠从样品架中取出，为每只眼睛涂抹含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上，在监测下保温直至完全恢复。

为了专注于视网膜神经节细胞，使用为 ImageJ 开发的 MRI 视网膜工具宏。打开 MRI 视网膜工具，修改多边形选择工具，并加载目标图像。点击 M 开始测量，然后点击 E 调整水平位置。在新打开的兴趣区域管理器窗口中选择第一个样本盒。

单击蓝色多边形，然后单击图像中被测层的边界，以调整第一个图框的位置。在感兴趣区域管理器窗口中选择第二个图框并调整其位置。然后单击 R，重新测量视网膜，并在测量结果窗口中查看结果。

尽管谱域OCT扫描的质量不如视网膜横截面图像，但OCT能够显示更多的视网膜层次。在OCT扫描中，视网膜各层易于测量，包括视网膜神经纤维层、节细胞层、内核层、外丛状层、外核层、内节与外节层、视网膜色素上皮层以及脉络膜，从而实现对整个视网膜的复杂研究。OCT对视网膜厚度的测量结果表明，遗传性OPA1突变雌性小鼠在视觉受损的情况下，其节细胞复合体及视盘周围视网膜神经纤维层出现进行性增厚。

使用标准卡尺与自制卡尺对视网膜神经节细胞层的神经纤维厚度进行比较，结果表明，标准卡尺测得的厚度显著低于自制卡尺。这是因为标准卡尺较厚，难以精确放置于薄层边界。一旦掌握该技术，若操作正确，可在15分钟内完成。OCT技术问世后，为眼科领域研究人员分析小鼠视网膜结构变化开辟了道路。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠中进行视网膜神经节细胞的光学相干断层扫描成像及其分析方法。