基于芯片的PIP研究：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记分析

PIP-on-a-chip 检测技术的总体目标是以定量、无标记的方式评估蛋白质与膜的相互作用。蛋白质与膜的相互作用是细胞及其病原体众多生命过程的核心，但用于研究这些相互作用的技术却十分有限。该技术的优势在于所需样品体积小、无需对配体或受体进行标记，同时能够以符合生理条件的方式检测膜相互作用。

许多病毒的治疗靶点是膜蛋白，对这些靶点蛋白的研究通常在溶液中使用去垢剂进行。我们的技术提供了一种更具生物学相关性的替代方法。尽管您会发现该检测方法能够监测蛋白质与膜的相互作用，但实际上它具有很高的通用性，还可用于监测铁与膜、小分子与膜，甚至肽与膜之间的相互作用。

首先，在一个大的塑料称量皿中，按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂。将混合物置于真空环境中脱气一小时，真空度控制在500托或更低。将含有多个相同SU8微结构图案的硅模板放入大的塑料称量皿中，倒入已脱气的PDMS，然后在60摄氏度的干燥烘箱中固化过夜。

第二天，用手轻轻将PDMS从硅模板上剥离。使用手术刀和直尺，将每个微结构图案的边界标记为矩形。然后将PDMS切割成小块，使用活检打孔器在每个微通道的两端各打16个孔，形成直径为1.0毫米的孔。

将计算好的体积的磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和pH敏感型荧光探针移取至一个20毫升的玻璃通风小瓶中。在化学通风橱内，用氮气流吹干混合物10分钟，或直至溶剂完全蒸发，在瓶底形成一层薄脂膜。随后，在真空度为10毫托的条件下，将混合物置于真空环境中干燥至少3小时，以去除残留的有机溶剂。

用五毫升运行缓冲液重新水合干燥的脂质膜，将水合后的脂质置于超声水浴中，在35千赫兹频率下室温处理30分钟。使用液氮和40摄氏度水浴对囊泡悬浮液进行反复冻融，以获得单层囊泡。重复冻融过程10次，然后使用脂质挤出器将囊泡悬浮液通过孔径为0.1微米的核孔聚碳酸酯膜挤出，富集小的单层囊泡。

将挤出操作重复10次。使用洗瓶将去离子水从PDMS块的孔中喷出，检测其入口和出口是否堵塞，然后用氮气干燥PDMS块。接下来，将PDMS块和预先清洗好的盖玻片放入氧气等离子体系统的样品腔中。

将PDMS块和盖玻片置于75瓦功率、氧气流速为每分钟10立方厘米、真空度为200毫托的条件下进行45秒的氧气等离子体处理。随后，立即在氧气等离子体处理后将PDMS块的图案面与盖玻片接触。轻轻按压以去除接触面处的任何气泡。

将装置置于水平的加热板上，在 100 摄氏度下加热三分钟以增强结合。使用蘸有 100% 乙醇的无尘湿布擦拭装置的顶部和底部，去除任何灰尘颗粒。然后，用胶带将装置固定在玻璃载玻片的上方。

将100微升含磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的小型单层囊泡转移至0.65毫升微量离心管中。加入6.4微升0.2当量盐酸，将溶液pH值调节至约3/2。通过进样口将10微升pH调节后的小型单层囊泡溶液用移液器加入各个通道，并通过移液器施加压力，直至溶液到达出样口。

将枪头从移液器上取下并保持连接在装置上。对每个通道重复此步骤后，在室温下孵育装置10分钟，囊泡注入微通道的操作应在装置组装完成后立即进行。同时，使用镊子剪切并连接进样和出样管路，将出样管路连接至装置，然后用胶带将装置固定在显微镜载物台上。

将进样管路的一端浸入含有25毫升运行缓冲液的锥形管中，并用胶带固定管路以确保其稳固。使用实验室升降架，将锥形管置于高于装置的位置，以便通过重力流使溶液流经微通道。对于每根进样管，使用注射器从管路的自由端吸取1毫升运行缓冲液。

将移液器吸头从入口移开，并将入口管路的游离端插入装置中。重复此步骤，将所有入口管路连接至装置。让运行缓冲液流经通道有助于去除多余的未破裂囊泡，并使双层膜达到实验所需的平衡条件。

接下来，打开显微镜控制软件。在左侧面板中，点击显微镜选项卡，并选择 10x 物镜。点击“live”按钮，然后点击工具栏上的 Alexa 568 图像图标，使用细调和粗调聚焦旋钮，对微通道进行聚焦。

扫描设备以检查SLB和通道的质量。然后，单击工具栏上的荧光快门关闭图像图标，点击采集选项卡，在基本调整下选择曝光时间。将曝光时间设置为200毫秒。

在左侧面板中，点击多维采集。在滤光片菜单下，选择红色通道。然后，点击时间序列菜单，将时间间隔设置为五分钟，持续时间为30分钟，并启用时间序列菜单。

在“测量”选项卡下选择圆形工具，并在任意通道中绘制一个圆形。选中该圆形后右键单击，选择“属性”。在“轮廓”选项卡下，勾选所有 T，以查看荧光强度随时间的变化情况。

确保此曲线达到表明平衡的平稳阶段后再进行下一步操作，将缓冲液降至与仪器同一水平面以停止流动。每次断开一根出口管路，使用移液器向出口通道中加入200微升的每种蛋白质稀释液。不要施加任何压力，让重力完成加样过程。

将吸头从移液器上取下，并使其保持连接在微流控装置上。对每个通道重复此过程，并确保在此过程中没有气泡进入通道。接下来，将入口管路降低至微流控装置下方的地面位置，以开始使蛋白质流经微通道。

将管路的自由端用胶带固定在废液容器上。让pleckstrin同源结构域的不同稀释液流过30分钟。在软件左侧面板的“时间序列”选项卡下，单击“开始”，以重新开始成像。

图中显示的是微通道内含有磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate）的支撑脂双层膜（SLBs）的代表性图像，分别展示了在加入指定浓度的pleckstrin同源结构域之前和之后的情况。通过沿微通道进行线扫描所获得的荧光强度，以距离和像素为函数，分别绘制了磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇4-磷酸和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸结合实验的结果。

然后，将单个实验的结合数据进行归一化处理，以磷脂酶C delta 1的pleckstrin同源结构域浓度为自变量作图，并拟合至结合等温线，以获得表观结合常数。通过比较表观结合常数可知，磷脂酶C Delta 1的pleckstrin同源结构域能够特异性地与磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate）相互作用，符合预期结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备小型单层囊泡、制作微流控装置、在这些微流控装置内形成支撑脂双层，以及如何利用本实验中的“芯片上磷脂”（PIP-on-a-chip）方法研究蛋白质与膜的结合相互作用。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在三小时内完成。在此步骤之后，可进一步采用荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photo bleaching）等其他方法，以评估蛋白质与膜结合对脂质侧向扩散的影响。该技术为研究蛋白质与细胞内脂质组装体之间的膜相互作用提供了途径，而非一次仅研究一种脂质，因此将广泛影响蛋白质-膜相互作用的生物化学与细胞生物学研究。