PIP-on-a-chip:蛋白质 - 磷酸肌醇相互作用的无标记研究

我们在微流体平台的背景下提供支持的脂质双层，以使用基于pH调节的无标记方法研究蛋白质 - 磷酸肌醇相互作用。

PIP-on-a-chip 测定的总体目标是以定量、无标记的方式评估蛋白质膜相互作用。蛋白质膜相互作用是细胞及其病原体许多过程的核心，但研究这些相互作用的技术很少。该技术的优点是简单体积小，无配体或受体标记要求，并且能够以生理相关方式测试膜相互作用。

病毒的许多治疗靶点是膜蛋白，这些靶蛋白的研究通常使用去污剂在溶液中进行。我们的技术提供了一种更具生物学相关性的替代方案。虽然您会发现该检测能够监测蛋白质与膜的相互作用，但它实际上是一种用途广泛的检测，可用于监测铁膜、小分子膜甚至肽膜的相互作用。

首先，在一个大型塑料称重舟中，以 10：1 的比例混合聚二甲基硅氧烷或 PDMS 预聚物和固化剂。将混合物在真空中脱气 1 小时，真空强度为 500 tor 或更低。将包含相同 SU8 微图案的多个重复的硅母版放入一个大型塑料称重船中，倒入脱气 PDMS，然后在 60 摄氏度的干燥烘箱中固化过夜。

第二天，用手轻轻地从硅主控器上剥离 PDMS。使用手术刀和尺子在矩形中标记每个微图案的边界。然后，将 PDMS 切成块，用活检冲头在每个微通道的两端打 16 个孔，打出直径为 1.0 毫米的孔。

将计算体积的磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸和 pH 敏感荧光探针移液到单个 20 mL 玻璃通风瓶中。在化学通风橱内的氮气流中将混合物干燥 10 分钟，或直到溶剂蒸发并在样品瓶底部形成薄脂质膜。然后，在真空下以 10 微米的真空强度将混合物干燥至少三个小时，以去除任何残留的有机溶剂。

用 5 毫升电泳缓冲液重新水化干燥的脂质膜，将再水化的脂质置于超声浴中，以 35 kHz 的工作频率在室温下放置 30 分钟。用液氮和 40 摄氏度水浴冻融囊泡悬浮液，得到单层囊泡。重复冻融 10 次，将囊泡悬浮液挤出至 0.1 微米轨道边缘聚碳酸酯膜，使用脂质挤出机富集小的单层囊泡。

重复挤压 10 次。使用水洗瓶将去离子水喷入孔中，测试 PDMS 模块的入口和出口是否堵塞，然后用氮气干燥 PDMS 模块。接下来，将 PDMS 模块和预先清洁的盖玻片放入氧气等离子体系统样品室内。

用氧气等离子体暴露 PDMS 块和盖玻片 45 秒，功率设置为 75 瓦，氧气流速为每分钟 10 立方厘米，真空强度为 200 毫托。接下来，在氧气等离子体处理后立即将 PDMS 块的图案表面与盖玻片接触。轻轻按压以去除接触部位的任何气泡。

将设备放在 100 摄氏度的水平热板上 3 分钟，以增强粘合效果。使用蘸有 100% 乙醇的无绒湿抹布去除设备顶部和底部的任何灰尘颗粒。然后，将设备贴在玻璃显微镜载玻片的顶部。

将 100 微升含有小单层囊泡的磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸转移到 0.65 毫升微量离心管中。通过添加 6.4 微升 0.2 正盐酸，将溶液的 pH 值调节至约 3/2。通过入口将 10 微升 pH 调节的小单层囊泡溶液移液到每个通道中，并通过移液管施加压力，直到溶液到达出口。

从移液器上拆下吸头，并将其连接到设备上。对每个通道重复此步骤后，在室温下孵育设备 10 分钟，设备组装后应立即将囊泡注射到微通道中。同时，使用镊子切割一组入口和出口管，将出口管组连接到设备上，然后将设备贴在显微镜载物台上。

将入口管的一端浸入锥形管中包含的 25 毫升电泳缓冲液中，并用胶带固定以确保管路固定。使用实验室千斤顶，将锥形管放在比设备更高的地面上，以便通过重力流将溶液推过微通道。对于每个入口管，使用注射器从管的自由端抽取 1 mL 电泳缓冲液。

从入口上取下移液器吸头，并将入口管的自由端插入设备。重复此过程，将所有入口管路连接到设备。流经通道的电泳缓冲液有助于去除多余的未破裂囊泡，并使双层平衡至实验条件。

接下来，打开显微镜控制软件。在左侧面板上，单击显微镜选项卡并选择 10 倍物镜。单击实时，然后单击工具栏上的 Alexa 568 图像图标，使用微调和粗略调整旋钮，专注于微通道。

扫描设备以检查 SLB 和频道的质量。然后，单击工具栏上的 FL 快门关闭图像图标，单击采集选项卡，然后在基本调整下选择曝光时间。将曝光时间设置为 200 毫秒。

在左侧面板上，单击 Multi-dimensional acquisition。在 filters 菜单下，选择红色通道。然后，单击延时菜单，将时间间隔设置为 5 分钟，将持续时间设置为 30 分钟，然后设置延时菜单。

选择 measure 选项卡下的圆工具，然后在任何通道中绘制一个圆。选中圆圈时右键单击，然后选择 properties （属性）。在配置文件选项卡下，选中所有 T 以查看荧光强度随时间的变化。

在进行下一步之前，确保此曲线达到表示平衡的平台，将缓冲溶液降低到与设备相等的水平，以停止流动。一次一根，拆下每个出口管，并使用移液管将 200 微升每种蛋白质稀释液加入出口通道。不要施加任何压力，让重力做功。

从移液器上拆下吸头，并将其连接到微流体装置上。对每个通道重复此过程，并确保在此过程中不会将气泡引入通道。接下来，将入口管降低到微流体装置下方的地面，以开始使蛋白质流过微通道。

将管路的自由端用胶带粘在废液容器上。将 pleckstrin 同源结构域的稀释液流歐 30 分钟。在软件的左侧面板上，在延时选项卡下，单击"开始"，再次开始成像。

此处显示的是微通道内含磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 SLB 的代表性视图。之前和之后，添加指定浓度的 pleckstrin 同源结构域。对于磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇 4 磷酸和磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸结合实验，将来自微通道扫描的线的荧光强度绘制为距离和像素的函数。

然后，将来自单个实验的结合数据归一化，绘制为磷脂酶 C δ 1 普列克底物蛋白同源结构域浓度的函数，并拟合到结合等项以提取明显的关联常数。表观关联常数的比较表明，正如预期的那样，磷脂酶 C Delta 1 普列克底物蛋白同源结构域与磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸特异性相互作用。观看此视频后，您应该对如何使用该测定与我们的 PIP-on-a-chip 方法制作小的单层囊泡、制造微流控装置、在这些微流控装置内形成支撑的脂质双层作为蛋白质膜结合相互作用有很好的了解。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。按照此程序，可以执行其他方法，例如光漂白后的荧光恢复，以评估蛋白质膜结合对脂质横向扩散的影响。这项技术为研究蛋白质膜与细胞中发现的脂质组装的相互作用铺平了道路，而不是一次一个，因此这种方法将广泛影响蛋白质膜相互作用的生物化学和细胞生物学。