Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

该程序的总体目标是研究活心肌细胞中 micro RNA 的间隙连接依赖性转移。这种方法可以帮助解决 micro RNA 在细胞间信号交易系统中的作用。该技术的主要优点是可以在具有高时空分辨率的活细胞中可视化和量化 micro RNA 的间隙连接交换。

根据文本方案分离心肌细胞后，将细胞以每平方厘米 3 倍 10 至第五个细胞的密度接种在六个孔板上。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。第二天，向细胞中加入 0.5 色嘧啶，并将培养物孵育 5 分钟以分离细胞。

通过添加细胞培养基灭活胰蛋白酶。细胞计数后，以 300 x g 离心 10 分钟。然后使用电穿孔缓冲液以每 100 微升 10 至 5 个细胞的 4 倍重悬细胞。

接下来，将 100 μL 细胞悬液与荧光 micro RNA 混合在试管中，然后将混合物装入电穿孔比色皿中。然后使用电穿孔仪上的 G009 程序进行电穿孔。加入 500 μL 预热的细胞培养基，并将整个体积的细胞悬液转移到四孔玻璃底室载玻片的孔中。

在 37 摄氏度、5% 二氧化碳气氛中将细胞培养一天。预热显微镜培养箱并打开 confucal 系统后，将腔室载玻片插入载物台样品架。使用 1.4 na 油物镜和 561 纳米激光激发光，在低激光功率下，检测范围为 570 至 680 纳米，以找到横对流心肌细胞簇。

接下来，在设置管理器中，激活 z-stack、time series、bleaching 和 regions 按钮。然后，要定义 frap 参数，请在采集模式菜单中，将帧大小设置为 512 x 512，将线步长设置为 1，并将扫描时间设置为小于 1 秒。在通道菜单中，调整激光功率、偏移和增益设置，以从最小的激光激发中获得最大的荧光，以避免强度饱和。

然后，将针孔大小设置为 2 微米。接下来，在区域菜单中，选择 roy 绘图工具，并使用光标标记目标单元格、参考单元格和背景区域。如果需要，请选择多个目标单元格进行照片漂白。

在漂白菜单中，调整照片漂白设置。然后，在 z-stack 菜单中，根据单元格的厚度定义 z-stack 采集的限制。将 z 层数调整为 12 tp 15，然后开始 frap 实验并记录荧光恢复。

要分析数据，请使用显微镜专用软件创建采集的 z 堆栈的最大投影，单击处理，最大强度投影，选择文件，应用。最后，将目标、背景和参考细胞中所有时间点的荧光强度数据复制到电子表格中，并根据文本方案进行数据分析。这里显示的是分离的心肌细胞，沿细胞间边界具有典型的条纹 α 肌动蛋白模式和连接蛋白 43 的大斑块。

培养物中存在一些非心肌细胞。如图所示，通过流式细胞术，截流效率达到 45%。此外，一篇活死论文显示，大多数细胞表现出高活力，这在分析间隙连接通讯时很重要。

对于 frap 分析，在细胞簇中选择靶细胞，并用 100% 激光功率进行光漂白，从而减少所选细胞中的 micro RNA 荧光。对所获取的数据进行定量分析和归一化，显示平均回收率为 20%在该实验中，siRNA 介导的 connexin43 敲低，导致蛋白质表达降低和间隙连接通讯的抑制。荧光回收率降低 50% 以上，表明 miro RNA 转移的效率强烈依赖于细胞之间的间隙连接偶联。

此图显示了 frap 实验的 3D 表面渲染。与最大投影相比，z 堆栈的采集可用于创建 3D 重建，以研究微 RNA 在细胞内的定位和迁移率。一旦掌握，如果执行得当，可以在 2 到 3 小时内完成 frap 测量。

在尝试此过程时，选择具有相似数量的相邻单元格的目标单元格非常重要。此外，应选择我的漂白参数和图像采集条件以避免光毒性效应。观看本视频后，您应该对如何使用 frap 显微镜以量化和可视化细胞簇内 micro RNA 的运动有很好的了解。