使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

本方法的总体目标是确定化合物对HDAC的抑制潜力，并利用单一超高效液相色谱-质谱联用检测方法，在细胞中鉴定其对HDAC6或HDAC1的选择性。该方法有助于回答药物发现领域中的关键问题，例如确定某种HDAC抑制剂在活细胞中是否对HDAC6具有优于I类HDAC的选择性。该技术的主要优势在于，仅需将细胞与抑制剂及特异性底物进行一次共孵育，即可同时测定化合物对两种HDAC同工酶的抑制活性。

该技术的应用有助于选择性HDAC抑制剂的早期药物发现，因为它能够在活细胞中检测HDAC6选择性是否得以维持，从而避免使用内源性蛋白质乙酰化检测方法。尽管该方法是在HeLa细胞中评估HDAC抑制剂的选择性，但它也可应用于其他细胞系，如原代细胞和其他肿瘤细胞，包括临床样本。在T75细胞培养瓶中，使用添加10%胎牛血清、青霉素G和链霉素的最低必需培养基，将HeLa细胞培养至80%汇合度。

用五毫升杜氏磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。然后吸去缓冲液，加入一毫升细胞解离试剂。在37摄氏度孵育五分钟，使细胞脱落。

五分钟后，向细胞中加入九毫升 MEM 培养基，充分重悬细胞悬液。将细胞转移至一个新的 15 毫升离心管中，然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。用 MEM 将细胞悬液的密度调整至每毫升 60,000 个细胞。

接下来，将100微升细胞悬液加入无菌、平底、经组织培养处理的96孔板的对照孔和待测孔中。然后，向96孔板的空白孔中加入100微升MEM培养基。将96孔板在37°C条件下孵育24小时。

吸出96孔板各孔中的培养基。在吸出培养基时，应避免将细胞从孔壁上脱离并移除。可通过使用较低的吸液速度，并小心地将吸头置于孔底部的角落处来实现。

然后，向测试孔中加入 25 µL 用 MEM 稀释的两倍浓度的待测化合物，包括 Trichostatin A、MS275 和 Tubastatin A。向对照孔和空白孔中各加入 25 µL MEM。接着，向对照孔和测试孔中加入 25 µL 底物混合液。然后，向空白孔中加入 25 µL MEM。

将96孔板置于含5%二氧化碳的湿润培养箱中，在37摄氏度下孵育八小时。进行细胞裂解时，首先向96孔板的每孔中加入10微升含有蛋白酶抑制剂的6倍RIPA缓冲液。通过向每孔加入160微升预冷的乙腈终止反应，并用移液器反复吹打混匀。

将培养板放入-80摄氏度冰箱中冷冻10分钟。从冰箱中取出培养板，将每孔中的220微升内容物转移至一个非无菌的锥底96孔板中。在4摄氏度条件下，以5,000 × g离心10分钟。

离心后，将200微升上清液转移至适用于超高效液相色谱系统的96孔板中。然后使用板封仪以可剥离热封膜密封板。通过加入流动相系统，准备超高效液相色谱-质谱联用系统。

将96孔板放入含有板架的样品管理器中。根据文中所述的超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UHPLC ESI MS/MS）条件运行样品。进行数据分析时，使用适当的UHPLC积分软件对各底物及其去乙酰化产物的峰面积进行积分。

针对每种底物，计算每个色谱图中去乙酰化产物与乙酰化产物的峰面积比值。需包括测试样品和对照样品。最后，根据文本方案中的公式计算每个测试样品的HDAC抑制百分率。

此处展示了样品的超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）色谱图。根据书面实验方案中表一描述的质量跃迁，可检测到添加至细胞中的底物对应的峰。MOCPAC 被 HDAC1 去乙酰化，从而产生去乙酰化的 MOCPAC 峰。

类似地，BATCP 被 HDAC6 去乙酰化，从而产生去乙酰化的 BATCP 峰。最后，MAL 提供去乙酰化的 MAL 峰，该峰反映了多种内源性 HDAC 非特异性地对 MAL 的去乙酰化作用。图中显示了使用不同浓度的 HDAC 抑制剂曲古抑菌素 A（Trichostatin A）所获得的色谱图。已对标准 HDAC 抑制剂进行了剂量反应评估。

利用MOCPAC和dMOCPAC测得的整合值计算标准抑制剂对HDAC1的抑制活性。在进行IC50计算后，MS275（一种选择性I类HDAC抑制剂）对HDAC1的IC50值低于Tubastatin A（一种已知的HDAC6抑制剂）。另一方面，利用BATCP和dBATCP测得的独立值计算标准品对HDAC6的抑制活性。

此次，Tubastatin A 提供的 IC 50 值低于 MS275，证实了它们的亚型选择性特征。Trichostatin A 是一种强效的非选择性抑制剂。一旦掌握，若操作得当，包括细胞处理时间和 96 孔板分析在内，该技术可在 72 小时内完成。

进行该实验操作时，需要注意此处指示的孵育时间适用于HeLa细胞。若使用其他细胞系，则需要进行优化。按照本方案，只要存在特异性底物，即可测定其他亚型的特异性HDAC抑制活性。

请注意，使用有机溶剂和其他化学品可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须佩戴护目镜、手套并穿上实验服。