Name: 同时测量 HDAC1 和 HDAC6 活动在 HeLa 细胞使用 UHPLC 女士 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解如何使用UHPLC-MS技术在HeLa细胞中同时测定HDAC1和HDAC6的活性，以评估组蛋白去乙酰化酶抑制剂的选择性。该方法通过单一孵育步骤即可检测活细胞中的两种HDAC亚型活性，为早期药物发现提供可靠的筛选手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢COST行动CM1406（表观遗传化学生物学）的支持。本出版物中报道的研究得到了Pierre Mercier基金会的资助。

1. 细胞培养
注意：以下步骤均在标准组织培养罩内进行。要求熟悉无菌操作技术。
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清、青霉素G（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL）的MEM培养基中，将HeLa细胞培养至T75细胞培养瓶中细胞融合度达到80%。 
	注意：细胞培养、处理和裂解步骤均在层流条件下进行，37 °C的孵育步骤需在含5% CO2的湿润环境中无菌操作。</li>
	<li>用5 mL DPBS洗涤细胞两次，吸除DPBS后加入1 mL细胞解离试剂，于37 °C孵育5 min以使细胞脱落。</li>
	<li>加入9 mL MEM培养基，充分重悬细胞悬液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>用MEM培养基将细胞悬液密度调整至6 × 104 cells/mL。</li>
	<li>向无菌、平底、经组织培养处理的96孔板的对照孔和待测孔中各加入100 µL细胞悬液（图1A）。</li>
	<li>向96孔板的空白孔中加入100 µL MEM培养基（图1A）。</li>
	<li>将96孔板在37 °C孵育24 h。 
	注意：24 h孵育时间适用于检测HeLa细胞内源性HDAC活性。对于HDAC活性未知的不同细胞类型，可能需要对对照细胞进行时间过程评估。</li>
</ol>
2. 使用测试化合物和HDAC底物处理细胞
<ol>
	<li>吸出96孔板各孔中的培养基。</li>
	<li>添加 25 µL 2× 测试化合物 例如， 曲妥辛A、MS275和图巴辛A）加入MEM中的测试孔。添加 25 µL 向对照孔和空白孔中加入 MEM。 
	注意：待测化合物的浓度应调整为至少提供5个最终测试浓度（每孔一个浓度）。待测化合物中DMSO的最终浓度不应超过0.5%，且在各孔中（包括空白孔和对照孔）应保持一致。最终孵育体积为 50 µL 每孔。Trichostatin A 在 500 至 1.95 nM 范围内以 5 个浓度（1:4 稀释）进行测试。MS275 和 tubastatin A 在 8,000 至 6.17 nM 范围内以 5 个浓度（1:6 稀释）进行测试。各测试化合物所需的目标终浓度应由使用者通过绘制剂量-反应曲线自行确定。</li>
	<li>添加 25 µL 底物混合物42 µM MAL的 42 µM MOCPAC 的，以及 42 µM 在 MEM 中加入 BATCP，分别加入对照孔和检测孔。添加 25 µL 向空白孔中加入 MEM。 
	注意：每种底物的最终浓度为 21 µM. MOCPAC 和 BATCP 分别可区分 HDAC1 和 HDAC6 的活性（图1B当在这些底物上未观察到活性时，使用MAL可能有助于鉴定对另一种HDAC同工酶的活性。</li>
	<li>将96孔板在指定条件下孵育 37 °C 在加湿的5% CO₂条件下孵育8小时2 培养箱 
	注意：该孵育时间适用于HeLa细胞，可使内源性HDAC与合成底物充分相互作用。不同细胞系可能需要调整孵育时间及/或底物浓度。</li>
</ol>
3. 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析的细胞裂解与样品制备
注意：样品制备步骤中使用的有机化学品具有高度易燃性，且通过摄入或吸入具有毒性。应佩戴适当个人防护装备，如手套和护目镜。
<ol>
	<li>向96孔板的每个孔中加入10 µL 6x RIPA缓冲液（由10x RIPA缓冲液稀释而成），并添加蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>向每孔加入160 µL预冷的乙腈以终止反应，并通过反复吹打混匀。 
	注意：在进行此步骤前，应将乙腈保存在-20 °C条件下。</li>
	<li>将该板置于-80 °C冰箱中冷冻10分钟。</li>
	<li>从冰箱中取出板，将每孔中的220 µL液体转移至一个非无菌、圆锥底（V型底）96孔板中。在4 °C条件下以5,000 × g离心10分钟。 
	注意：此步骤旨在去除蛋白质和盐类。如有需要，可在离心前将溶液转移至单独的圆锥形离心管中，或通过一组96孔、0.65 µm PVDF滤板进行过滤。在进行UHPLC分析前，必须成功去除沉淀物。</li>
	<li>将200 µL上清液（或滤液）转移至与UHPLC系统兼容的96孔板中，并使用可剥离热封膜通过封板机密封。 
	注意：在移取上清液时避免吸入沉淀。若无法立即进行UHPLC分析，该板可在4 °C条件下最多保存24小时，直至分析开始。</li>
</ol>
4. 超高效液相色谱-串联质谱分析
<ol>
	<li>通过加入流动相体系（95% A : 5% B）准备超高效液相色谱（UHPLC）系统： 
	A：H2O，色谱纯，含0.1%甲酸（配制1 L） 
	B：乙腈，色谱纯，含0.1%甲酸（配制1 L）。 
	注意：流动相含有有机化学品，易燃，且经摄入或吸入后有毒。操作时应佩戴适当个人防护装备，如手套和护目镜。</li>
	<li>将96孔板放入配备板架的自动进样器中。根据表1提供的UHPLC-ESI-MS/MS条件运行样品。 
	注意：分析用96孔板的每一列应包含一个对照孔和一个空白孔（如图1A所示的板布局）。对照孔代表测试细胞系中100%的酶活性，而空白孔用于检测质谱源背景信号是否稳定。若在某一空白孔中检测到异常质谱峰，应进行排查，以避免质谱灵敏度发生变化。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用适当的超高效液相色谱（UHPLC）积分软件，对每种底物及其去乙酰化产物的峰面积进行积分。 
	注：使用自动积分参数并配合平滑方法（例如，均值法，窗口大小为3，平滑次数为2）。根据表1提供的色谱条件，洗脱顺序为 dMAL（5.8 分钟）、dBATCP（6.0 分钟）、dMOCPAC（6.2 分钟）、MAL（7.6 分钟）、MOCPAC（8.9 分钟）和 BATCP（9.8 分钟），如图1C所示。</li>
	<li>针对每种底物，计算各色谱图中去乙酰化产物与乙酰化底物的峰面积比值（去乙酰化/乙酰化）（测试样品与对照样品）。</li>
	<li>计算每个测试样品的HDAC抑制百分比： 
	<img alt="抑制率计算公式，% 抑制 = 100 - (测试比值 × 100 / 对照比值)。" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation"> 
	注：HDAC1 抑制率通过 dMOCPAC/MOCPAC 的峰面积比值计算；HDAC6 抑制率通过 dBATCP/BATCP 的比值计算。dMAL/MAL 的比值可用于表示总体 HDAC 抑制情况。</li>
</ol>

<ol><li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+protein+families%3A+a+new+frontier+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li>
<li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+cellular+memory+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+p53+at+lysine+373%2F382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21%28Waf1%2FCip1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://expert.sgst.cn/upload/attach/attach200904010401046mjwfsp6qt.pdf">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li>
<li>Simões-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases%3A+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li>
<li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li>
<li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li>
<li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21139608">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015).</li>
<li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricolinostat+plus+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma%3A+a+multicentre+phase+1b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li>
<li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1517/13543776.13.6.935">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).</li>
<li>Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS%2FMS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Enzyme+Inhibi+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li>
<li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li>
<li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li>
<li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior%2C+neuroprotective+HDAC6+inhibitor%2C+tubastatin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li>
<li>Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJung%2C+M+%22Epigenetic+Targets+in+Drug+Discovery%22">Epigenetic Targets in Drug Discovery</a>. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).</li>
<li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li>
<li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li>
<li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li>
<li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li>
<li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCopeland%2C+RA+%22Evaluation+of+enzyme+inhibitors+in+drug+discovery%22">Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery</a>. , Wiley. (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

HDAC 抑制是药物发现领域的热点话题，目前的研究重点是针对癌症治疗的 HDAC6 选择性抑制剂21。HDAC 选择性通常通过一系列高通量、无细胞的生化检测方法进行评估，旨在确定化合物对各个 HDAC 亚型的抑制效力21。然而，抑制剂的选择性还需在活细胞中进一步验证，即通过评估内源性蛋白底物的乙酰化状态（如组蛋白用于评估 I 类 HDAC，微管蛋白用于评估 HDAC6）来确认。因此，通常需要借助基于抗体识别的细胞检测方法（例如免疫染色、Western 印迹、流式细胞术和 ELISA），以对特定化合物在活细胞中对不同亚型的作用效力进行定量或半定量评估21。在无细胞酶学检测中表现出选择性的化合物，在细胞或组织中却缺乏选择性的情况并不少见17,22，反之亦然19。这可能是由于酶来源未标准化，以及生化检测中缺乏辅因子或蛋白...

HDAC 属于一类能够在染色质结构中使组蛋白去乙酰化的酶。它们在细胞质中还具有其他蛋白质底物，并分布于多种细胞区室中。迄今为止已鉴定出 18 种 HDAC 同工型，这些同工型与多种细胞机制相关，包括转录因子和基因表达的调控，以及细胞信号传导和运输。1,2,3,4,5,6,7HDAC 催化抑制剂已作为潜在的癌症治疗药物出现。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的大多数 HDAC 抑制剂用于治疗 T 细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤，且均为非特异性 HDAC 抑制剂，例如伏立诺他（SAHA）、贝利司他和帕比司他。8,9然而，广谱抑制剂已报道存在一系列副作用，因此寻找亚型特异性小分子已成为药物化学与药物发现领域的研究热点。相应地，I类（HDAC1-3 和 HDAC8）选择性抑制剂罗米地辛（romidepsin）已作为获批药物投入使用10，而HDAC6特异性抑制剂目前正处于多发性骨髓瘤的临床试验阶段，展现出更高的治疗潜力11,12,13,14,15.
用于表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂的筛选实验，通常基于将HDAC底物与酶源（单一亚型、核提取物或细胞裂解液）共同孵育。该底物通常为一段含有乙酰化赖氨酸残基的小肽序列，并连接一个可裂解的荧光基团（例如，香豆素），如N-(4-甲基-7-氨基香豆素基)-Nα-(叔丁氧羰基)-Nω-乙酰赖氨酰胺（MAL）16。为了区分不同亚型的特异性活性，需分别进行针对各亚型的无细胞实验，但这些实验可能无法真实反映活细胞中各亚型的实际活性。目前已有商业化的亚型特异性底物，例如苯甲基(S)-[1-(4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基氨基甲酰基)-5-丙氨酰氨基戊基]氨基甲酸酯（MOCPAC，HDAC1特异性底物）和(S)-[5-乙酰氨基-1-(2-氧代-4-三氟甲基-2H-色烯-7-基氨基甲酰基)戊基]氨基甲酸叔丁酯（BATCP，HDAC6特异性底物）（图1B）。然而，若将含有MAL、MOCPAC和BATCP的多底物混合物施加于活细胞，则由于这些底物携带相同的可裂解荧光基团，无法通过荧光检测方法区分各个去乙酰化产物。
本方法通过多底物检测联合超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）分析，可在HeLa细胞中实现各底物及其去乙酰化产物的检测与相对定量17。该检测在HeLa细胞中进行组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性分析，以直接鉴定受试化合物对内源性HDAC的抑制活性及其特异性。本方法重点关注HDAC1与HDAC6，并可同时对其进行评估。为在单次孵育实验中完成上述酶学测定，将非特异性与特异性HDAC底物的混合物加入接种于96孔板中的经处理与未处理的HeLa细胞中。经过孵育后，裂解细胞以释放底物及其相应的反应产物，并采用UHPLC-MS方法进行分离与检测（图1C）。MAL、MOCPAC和BATCP三种底物的去乙酰化产物分别为去乙酰化MAL（dMAL）、去乙酰化MOCPAC（dMOCPAC）和去乙酰化BATCP（dBATCP）。对于具有活性的化合物，可构建剂量-反应曲线。
<img alt="采用UHPLC-MS色谱图进行化合物分析和底物反应的细胞抑制实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：通过多底物的UHPLC-MS分析，建立基于细胞的HDAC检测方法以鉴定HDAC1和HDAC6特异性抑制剂的总体方案。（A）典型96孔板示意图，包含经处理（测试化合物）和未处理（对照）的HeLa细胞，以及无细胞的空白对照。（B）作为混合物（每种21 µM）加入的底物化学结构，可被内源性HDAC去乙酰化。（C）典型的UHPLC-MS色谱图，显示所加底物（MAL、MOCPAC和BATCP）及其去乙酰化产物（分别为dMAL、dMOCPAC和dBACTP）的色谱峰。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>同义词：BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Tubastatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，HPLC级</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，LC/MS级</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，HPLC级</td><td></td><td></td><td>经Milli-Q纯化系统过滤的蒸馏H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>HeLa细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离试剂 TrypLE Express</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，细胞培养级</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA缓冲液</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，无菌，平底，Corning组织培养处理</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96孔板，非无菌，V型底，Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td><td>用于离心步骤</td></tr><tr><td>96孔板，锥形底，Nunc</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>249944</td><td>与Acquity UHPLC系统兼容</td></tr><tr><td>T75细胞培养瓶，Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>可剥离热封箔</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC系统</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>积分软件：MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>目录号不可用</td></tr><tr><td>Combi thermo-sealer SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>目录号不可用</td></tr><tr><td>Quattro micro API 串联四极杆系统</td><td>Waters</td><td></td><td>目录号不可用</td></tr></tbody></table>

使用超高效液相色谱-质谱法同时测定hela细胞中hdac1和hdac6活性

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

寻找新的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在药物研发中日益受到关注。自从I类HDAC抑制剂罗米地辛被批准用于癌症治疗，以及HDAC6特异性抑制剂进入多发性骨髓瘤的临床研究以来，亚型选择性成为研究热点。本方法用于测定受试化合物在细胞中对HDAC1和HDAC6的抑制活性。通过超高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS）分析经处理与未处理的HeLa细胞孵育后的特异性底物，以测定不同亚型的酶活性。与在分离亚型上进行的无细胞生化检测相比，该方法的优势在于能够反映细胞环境中内源性HDAC的活性。此外，由于该方法基于合成底物的定量分析，因此无需依赖抗体识别内源性乙酰化蛋白。该方法易于适用于多种细胞系，并可实现自动化操作。此前该方法已在神经母细胞中成功用于发现HDAC6选择性化合物。本文以HeLa细胞为例，展示了标准HDAC抑制剂——曲古抑菌素A（非特异性）、MS275（HDAC1特异性）和管抑素A（HDAC6特异性）的代表性实验结果。

为展示该方法在鉴定HDAC1（I类）和HDAC6（IIb类）的非选择性与选择性抑制剂中的应用，采用已知的标准化合物处理HeLa细胞：曲古抑菌素A（对HDAC1与HDAC6无选择性）18、MS275（HDAC1选择性抑制剂）19 和 tubastatin A（HDAC6选择性抑制剂）20。利用本方法（图1），可在活细胞中直接测定HDAC1（通过检测MOCPAC去乙酰化）和HDAC6（通过检测BATCP去乙酰化）的IC50值（图2）。曲古抑菌素A对HDAC1和HDAC6均具有强效但无选择性；而MS275对HDAC1具有选择性，tubastatin A则明显选择性作用于HDAC6。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

本方法通过超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析多种底物，用于在HeLa细胞中鉴定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）亚型特异性抑制剂。该方法无需使用抗体，可在活细胞环境中反映HDAC1和HDAC6的活性，与单一亚型的无细胞检测方法相比具有优势。

使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

寻找新的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在药物发现领域日益受到关注。由于不同亚型的选择性，该领域近年来备受瞩目。

本方法的总体目标是利用单一的超高效液相色谱-质谱联用检测法，在细胞中测定化合物对 HDAC 的抑制潜力，并鉴定其对 HDAC6 或 HDAC1 的选择性。该方法有助于回答药物发现领域中的关键问题，例如确定某种 HDAC 抑制剂在活细胞中是否对 HDAC6 的选择性高于 I 类 HDAC。该技术的主要优势在于，仅需一步细胞孵育，同时加入抑制剂和特异性底物，即可同步测定对两种 HDAC 异构体的抑制活性。该技术的应用意义在于推动选择性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂的早期药物发现，因为它能够在活细胞中检测HDAC6选择性是否得以维持，从而避免使用内源性蛋白乙酰化检测方法。尽管本方法是在HeLa细胞中评估HDAC抑制剂的选择性，但它也可应用于其他细胞系，如原代细胞、其他肿瘤细胞以及临床样本。在添加10%胎牛血清、青霉素G和链霉素的最低必需培养基中，将HeLa细胞培养至T75细胞培养瓶中约80%汇合度。用五毫升杜氏磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。然后吸去缓冲液，加入一毫升细胞解离试剂。在37摄氏度孵育五分钟，以解离细胞。五分钟后，向细胞中加入 9 毫升 MEM 培养基，充分重悬细胞悬液。将细胞转移至新的 15 毫升离心管中，然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。用 MEM 将细胞悬液密度调整至每毫升 60,000 个细胞。接下来，将 100 µL 细胞悬液加入无菌、平底、经组织培养处理的 96 孔板中的对照孔和待测孔。然后，向 96 孔板的空白孔中加入 100 µL MEM 培养基。将 96 孔板在 37 °C 条件下孵育 24 小时。吸除96孔板各孔中的培养基。吸除过程中应避免将细胞从孔壁上脱离或移除。可通过使用较低的吸液速度，并将吸头小心地置于孔底角落处来实现。然后，向测试孔中加入 25 µL 含两倍浓度待测化合物的 MEM 培养基，包括 Trichostatin A、MS275 和 Tubastatin A。向对照孔和空白孔中各加入 25 µL MEM 培养基。接着，向对照孔和测试孔中加入 25 µL 底物混合液。然后，向空白孔中加入 25 µL MEM 培养基。将96孔板置于加湿的5%二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育八小时。进行细胞裂解时，首先向96孔板的每孔中加入10微升含有蛋白酶抑制剂的6倍RIPA缓冲液。通过向每孔加入160微升预冷的乙腈终止反应，并用移液器反复吹打混匀。将培养板放入-80摄氏度冰箱中冷冻10分钟。从冰箱中取出培养板，将每孔中的220微升内容物转移至一个非无菌的锥底96孔板中。在4摄氏度条件下，以5,000 × g离心10分钟。离心后，将200 µL上清液转移至适用于UHPLC系统的96孔板中。然后使用板封仪以可剥离的热封膜密封板孔。通过加入流动相系统，准备超高效液相色谱-质谱联用系统。将96孔板放入含有板架的样品管理器中。根据文中所述的UHPLC ESI MS/MS条件运行样品。进行数据分析时，使用适当的UHPLC积分软件对每种底物及其去乙酰化产物的峰面积进行积分。针对每种底物，计算每个色谱图中去乙酰化产物与乙酰化产物的峰面积比值。需包括测试样品和对照样品。最后，根据文本方案中的公式计算每个测试样品的HDAC抑制百分率。此处展示了样品的UHPLC-MS色谱图。根据书面实验方案中表一描述的质量转换，检测到对应于添加至细胞中的底物的色谱峰。MOCPAC被HDAC1去乙酰化，从而产生去乙酰化的MOCPAC峰。类似地，BATCP 被 HDAC6 去乙酰化，从而产生去乙酰化的 BATCP 峰。最后，MAL 提供去乙酰化的 MAL 峰，该峰反映了多种内源性 HDACs 非特异性地对 MAL 进行的去乙酰化作用。图中显示了使用不同浓度的 HDAC 抑制剂曲古抑菌素 A（Trichostatin A）所获得的色谱图。对标准 HDAC 抑制剂进行了剂量反应评估。利用MOCPAC和dMOCPAC测得的整合值计算标准抑制剂对HDAC1的抑制活性。IC50计算结果显示，选择性I类HDAC抑制剂MS275对HDAC1的IC50值低于已知的HDAC6抑制剂Tubastatin A。另一方面，采用BATCP和dBATCP测得的独立值来计算标准品对HDAC6的抑制活性。这一次，Tubastatin A 提供的 IC50 值低于 MS275，证实了它们的亚型选择性特征。Trichostatin A 是一种强效的非选择性抑制剂。一旦掌握，该技术若正确操作，包括细胞处理时间和对 96 孔板的分析，可在 72 小时内完成。在进行该实验操作时，需要注意，此处所列的孵育时间是针对HeLa细胞的。若使用其他细胞系，则需要进行优化。按照本方案，只要存在特异性底物，即可检测其他亚型的特异性HDAC抑制活性。请注意，使用有机溶剂和其他化学品可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须始终佩戴防护眼镜、手套和实验服。

simultaneous-measurement-hdac1-hdac6-activity-hela-cells-using-uhplc

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

同时测量 HDAC1 和 HDAC6 活动在 HeLa 细胞使用 UHPLC 女士

我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。...

哺乳动物连接组蛋白亚型的表达分析

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

HaloTag 技术是一种多功能技术，在从哺乳动物细胞中分离大小不同的蛋白质复合物方面已取得显著成功。...

利用 HaloTag 技术发现蛋白质相互作用并表征蛋白质功能

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。...

使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。...

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

本方案概述了如何利用三维细胞培养系统在接近生理状态下建模、处理和分析染色质修饰。...

三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

快速且准确的化学检测方法用于筛选特异性抑制剂，是药物开发工具库中的重要手段。本文介绍一种可放大的乙酰化-点击化学检测方法，用于测定HAT1乙酰化活性的抑制情况。...

一种乙酰化-点击化学检测法用于测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化水平

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。...

从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。...

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

了解如何使用UHPLC-MS技术在HeLa细胞中同时测定HDAC1和HDAC6的活性，以评估组蛋白去乙酰化酶抑制剂的选择性。该方法通过单一孵育步骤即可检测活细胞中的两种HDAC亚型活性，为早期药物发现提供可靠的筛选手段。

使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

探索更多视频