Name: 非交联无甲醛组织固定剂 HER2 鱼的协议, 结合低温保存和福尔马林固色的优点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用非交联无甲醛组织固定剂进行HER2荧光原位杂交检测的方法，该方法结合低温保存和福尔马林固色的优点，可从同一样本获得高质量形态学与分子分析结果，支持个性化医疗中的多重诊断需求。

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我们感谢格拉茨医科大学病理学研究所分子病理学实验室团队的专业知识和大力支持。此外，我们感谢Iris Kufferath和Daniela Pabst提供的技术协助，感谢Bernadette Rieger和Sylvia Eidenhammer对HER2病例的处理，以及感谢Kinga Szurian（病理学家）和Tamas Regényi（3DHISTEC）。我们感谢Penelope Kungl对稿件的校对。本研究得到了Christian Doppler研究基金、奥地利联邦科学、研究与经济部以及国家研究、技术和发展基金会的经费支持。

本研究经奥地利格拉茨医科大学伦理委员会批准（编号 20-066）。在患者签署书面知情同意书后，采集了两例手术切除的原发性浸润性乳腺癌组织样本。
1. 组织固定
注意：组织固定可使用标准缓冲福尔马林溶液（SBFS），即根据 CEN/TS 16827-1:2015 定义的含有 3.7 % 质量分数（相当于 4 % 体积分数）甲醛、缓冲至 pH 6.8 至 pH 7.2 的 10 % 福尔马林溶液，或使用非交联、无福尔马林的组织固定系统（下文也称替代固定液），后者在室温（RT）下由固定剂和稳定剂溶液组成。
<ol>
	<li>使用无菌手术刀将乳腺癌组织样本切成两半，每块厚度为4 mm，以确保足够的组织量。用于NCFPE或SBFS组织固定的组织最大尺寸为4 × 15 × 15 mm。</li>
	<li>将每块肿瘤组织样本放入标准组织包埋盒中，并浸入SBFS或替代固定液中固定24小时，固定液体积与组织体积之比（v/v）为4:1（即每1 g组织使用4 mL固定液，理想情况下为10 mL/1 g）。</li>
	<li>打开容器，将组织包埋盒旋转180°后浸入稳定剂溶液中，使替代固定后的样本在其中转移并孵育2–72小时。</li>
	<li>将经SBFS固定的组织包埋盒放入250 mL的70%乙醇中，在室温下处理30分钟，以去除残留的SBFS。 
	注意：此步骤至关重要，可避免在自动组织处理仪中SBFS污染非交联固定剂处理的样本，否则会破坏非交联固定剂在生物分子保存方面的有益特性。 
	警告：SBFS为危险溶液，可引起皮肤刺激、严重眼损伤，可能引发过敏性皮肤反应，疑似导致遗传缺陷，可能致癌，引起呼吸道刺激、嗜睡，并对器官造成损害。替代固定剂经吸入、皮肤接触或吞咽后有毒，对眼睛和皮肤具有刺激性，经吸入、皮肤接触或吞咽可能导致极为严重的不可逆损害。应避免与两种固定液发生吸入暴露和身体接触。操作时须穿戴适当的防护服、手套以及眼面部防护装备，并在通风橱内进行操作。</li>
	<li>继续进行组织处理、包埋及切片（见第2和第3节）。</li>
</ol>
2. 组织处理与包埋
<ol>
	<li>使用自动组织脱水机对含有固定组织样本的组织包埋盒进行梯度脱水：70 % 乙醇（2 次，每次 15 分钟）、80 % 乙醇（30 分钟）、90 % 乙醇（60 分钟）、99 % 乙醇（2 次，每次 60 分钟），然后用二甲苯处理（2 次，每次 60 分钟）。随后在自动组织处理仪中用石蜡浸润（4 次，每次 45 分钟）。</li>
	<li>用镊子将已脱水并经石蜡浸润的样本（包括替代固定剂固定和SBFS固定的样本）放入金属模具中。</li>
	<li>使用石蜡包埋仪将样本包埋于 5 - 10 mL 熔融石蜡（凝固点为 56-58 °C）中。</li>
	<li>将模具置于 -5 °C 的冷却板上冷却 30 分钟。</li>
	<li>从模具中取出石蜡包埋的组织块。</li>
	<li>将获得的组织块（替代固定剂固定的石蜡包埋组织块（NCFPE）和SBFS固定的石蜡包埋组织块（FFPE））避光保存于 4 °C，直至使用。</li>
</ol>
3. FISH 实验的组织切片与玻片制备
注意：FFPE 切片可直接用于 FISH，而 NCFPE 切片则需在 SBFS 中后固定 24 小时后再进行 FISH 操作。
<ol>
	<li>将一次性刀片插入切片机，并将切片机调节至 10 µm。</li>
	<li>从冷却板上取下第一个包埋块，并将其插入仪器中。</li>
	<li>修切包埋块直至获得平整的表面。使用刷子清洁切片机，并将其调整至 3 µm。弃去最初的 2–3 个切片。</li>
	<li>切取 NCFPE 和 FFPE 包埋块的 3 µm 切片，并将其放入冷水中（超纯水）。 
	注意：为了获得无细胞核重叠的更佳显微图像，此处展示的是 2 µm 切片的图像，而非厂家说明书推荐的 3–5 µm 切片。</li>
	<li>使用细毛笔和针将漂浮的切片逐一转移至经处理的载玻片上，以确保组织切片牢固附着。</li>
	<li>将载玻片迅速浸入温水浴（40 °C）中，使切片完全展开。</li>
	<li>小心地将载玻片从水中拉出，使切片重新贴附于玻片上，并避免产生皱褶。</li>
	<li>将所有切片在室温下干燥 1 小时。</li>
	<li>将载玻片置于 70 °C 的孵育箱中加热 30 分钟，以熔化石蜡。</li>
	<li>将载玻片水平放入玻璃染色缸中。</li>
	<li>在室温下，于盛有下列液体（每种 250 mL）的染色缸中逐步对切片进行水化：100 % 二甲苯 2 次，每次 15 分钟；96 % 乙醇 2 次，每次 15 分钟；90 % 乙醇 2 分钟；80 % 乙醇 2 分钟；70 % 乙醇 2 分钟；50 % 乙醇 2 分钟；蒸馏水 2 次，每次 10 分钟。 
	警告：脱蜡和水化步骤必须在通风橱中进行，避免吸入有毒挥发性溶剂。 
	注意：根据切片和组织类型的不同，可能需要预先测试不同的孵育时间。</li>
</ol>
4. NCFPE 标本的后固定
<ol>
	<li>将NCFPE切片放入盛有SBFS的新染色缸中，在室温下进行24小时的后固定。后固定期间，将染色缸置于通风橱内。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液洗涤（3次，每次10分钟）和蒸馏水洗涤（2次，每次10分钟）以去除多余的SBFS。</li>
</ol>
5. 荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）
注意：此处荧光原位杂交（FISH）使用市售的HER2/CEN17双色探针试剂盒，按照制造商提供的说明书进行操作。在杂交和洗涤步骤中，切勿让组织切片干燥。探针溶液及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）DNA复染溶液应避免长时间暴露于光照下。这些步骤需在避光条件下进行，使用防光容器。根据样本材料的保存时间和固定步骤，可适当提高或降低变性和洗涤温度，以获得更佳的杂交结果。
<ol>
	<li>将含有 250 mL 柠檬酸预处理液的染色缸置于 98 °C 水浴中。</li>
	<li>将复水后的 FFPE 和后固定的 NCFPE 切片放入染色缸中，孵育 15 分钟。每个染色缸中切片数量不得超过六张。</li>
	<li>在新的染色缸中，用蒸馏水在室温下清洗切片 3 分钟。</li>
	<li>进行蛋白酶消化时，将切片放入温度可控的杂交系统中，37 °C 孵育。
	<ol>
		<li>立即以滴加方式（每滴约 30 µl）将即用型胃蛋白酶溶液（2 mg/ml）均匀覆盖组织切片，直至完全覆盖。在杂交系统中 37 °C 孵育 9 分钟。 
		注：建议孵育时间为 5–15 分钟。最佳蛋白酶消化时间应预先确定。</li>
		<li>将切片转移至含有预热 SSC 洗涤缓冲液的染色缸中，孵育 5 分钟。</li>
		<li>在室温下用蒸馏水冲洗切片 1 分钟。</li>
		<li>依次在下列梯度乙醇中进行脱水处理：50 %、70 %、90 % 和 100 %，每级各 1 分钟。空气干燥切片。</li>
		<li>进行杂交时，用移液器吸取 10 µL HER2/CEN17 探针滴加至干燥的组织切片上，每张样本加盖盖玻片，并用橡胶胶水封固。 
		注：推荐每 22 × 22 mm 组织区域使用 10 µL 探针。轻微加热探针有助于更顺畅地移液。避免产生气泡，并防止探针长时间暴露于光线下。</li>
		<li>在杂交系统中 75 °C 下共同变性探针与样本 DNA 10 分钟。</li>
		<li>将杂交系统设定为 37 °C，过夜杂交。</li>
		<li>杂交后检测时，用镊子小心去除橡胶胶水。</li>
		<li>将切片放入含有 37 °C 预热的 1 × 洗涤缓冲液 A 的染色缸中孵育 5 分钟，随后去除盖玻片。</li>
		<li>用预热的 1 × 洗涤缓冲液 A 在 37 °C 下清洗切片两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在 70 %、90 % 和 100 % 乙醇中依次脱水，每级各 1 分钟。</li>
		<li>将样本在空气中干燥，并避光保存。</li>
		<li>进行染色时，避免产生气泡，向杂交区域滴加 30 µL DAPI 溶液，并加盖盖玻片。</li>
		<li>避光孵育 15 分钟。</li>
		<li>用滤纸轻轻按压切片，小心吸除多余的 DAPI 溶液。</li>
		<li>将切片避光保存于 2–8 °C 环境中，最长可保存两周，直至进行共聚焦显微镜检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. FISH 切片的共聚焦成像与扫描
<ol>
	<li>使用配备40倍/1.2数值孔径物镜、四通道滤光片（DAPI/FITC/TRITC/Cy5）和550万像素、16位冷却型科学互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的共聚焦数字扫描仪，对载玻片进行共聚焦成像和扫描。</li>
	<li>使用绿色（激发：503 nm，发射：528 nm）和橙色（激发：547 nm，发射：572 nm）通道的滤光片采集图像。</li>
</ol>
7. 结果解读
注意：HER2/CEN17 探针包含两种成分，一种是针对17号染色体着丝粒区域（D17Z1）的红色荧光标记CEN17探针，另一种是针对HER2基因（探针定位17q12）的绿色荧光标记HER2探针。每个细胞核中HER2:CEN17比值≤2.0的肿瘤标本判读为正常，而比值≥2.0的则判读为扩增17。
<ol>
	<li>使用开源软件 CaseViewer 2.120 对图像进行质量分析。
	<ol>
		<li>根据病理学家界定的癌浸润成分的两个不同区域，评估至少 20 个细胞。计数区域内应包含分布清晰且易于区分的细胞核。排除位于组织边界以及收缩或挤压区域的组织部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA 质量
<ol>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>确保所有仪器和工具均无 RNA 酶。使用去除 RNA 酶的溶液。</li>
		<li>使用切片机按照操作流程，对 NCFPE 或 FFPE 样本切取 10 至 20 片（每片厚 5 µm）的组织切片，直至步骤 3.8。</li>
		<li>使用 RNA 提取试剂盒（参见材料表）从 NCFPE 样本中提取 RNA；使用 FFPE RNA 提取试剂盒从 FFPE 样本中提取 RNA。 
		注意：非交联固定剂固定的样本提取 RNA 时，需采用适应该固定方法的提取方式。不得使用其他 RNA 提取方法（例如，NCFPE 样本不得使用 Trizol、RNeasy FFPE 等方法）。</li>
		<li>使用分光光度计测定 RNA 浓度和纯度。260 nm 与 280 nm 处吸光度比值（A260/280）应约为 2.0。</li>
		<li>将提取的 RNA 储存于 -70 °C，待后续分析使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用不同长度扩增子的引物，进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）实时反转录 PCR8,9。
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，使用 cDNA 反转录试剂盒进行 cDNA 合成。每份样本使用 500 ng RNA。将 cDNA 储存于 -20 °C，待后续使用。</li>
		<li>根据制造商说明书配制 PCR 主混合液。</li>
		<li>将 PCR 主混合液分装至 384 孔反应板中，每孔设三个重复。每孔加入 4 µL 经 1:16 稀释的 cDNA（PCR 模板）。按照制造商说明书进行 PCR 扩增。 
		注意：针对人源 GAPDH，所用引物如下：GAPDH 正向引物：5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´；GAPDH 反向引物：71 bp 对应 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´，153 bp 对应 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´，200 bp 对应 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´，277 bp 对应 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´，323 bp 对应 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´，530 bp 对应 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´。</li>
		<li>使用适用于 PCR 仪器的软件分析结果。必须基于熔解曲线分析排除非特异性产物21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

D.G. 任职于 Qiagen，并持有该公司养老金计划中的股票期权或债券。本论文中呈现的数据涉及 PAXgene 组织系统，该系统由 Qiagen 与 PreAnalytiX 联合开发。Qiagen 是 publicly funded Christian Doppler 实验室（生物样本研究与生物库技术领域）的产业合作伙伴。所有作者均无利益冲突，亦无竞争性经济利益。

结果表明有两个关键发现。首先，对NCFPE组织切片进行简单的24小时SBFS后固定步骤，足以在使用经批准用于FFPE组织的FISH检测时获得与FFPE组织相当的结果（另见参考文献14）。该方案的优势在于可直接使用最初为FFPE组织开发并获批的FISH检测，而无需进行全面的重新验证（例如，无需针对非交联组织优化杂交前条件）。FISH实验方案可完全按照制造商提供的说明书进行操作。
本方案中对制造商说明的微小修改（例如组织切片直径以及脱蜡步骤中的孵育时间）源于此前的调整，制造商明确建议根据所用不同组织类型和固定方法进行此类调整。
后固定步骤至关重要，因为它需要18-24小时的化学反应时间，虽然会使分析时间延长一天，但可与FFPE组织已建立的日常操作流程保持一致（图1）。据报道，SBFS穿透组织的平均速率为每小时1 mm22，在2小时内可穿透5 mm，具体取决于组织类型23,24。观察发现，只有当后固定时间超过18小时，才能使NCFPE切片的性质转变为FFPE切片，这表明决定结果的关键因素并非固定剂的渗透，而是化学反应所需的时间1,14。
其次，未用于后固定的剩余NCFPE组织可用于进一步的分子分析，因为生物分子得到了良好保存。这一点通过实时逆转录PCR得到了验证（图3）。与从石蜡包埋组织中分离的mRNA的RNA质量（即化学修饰和片段化）相关的电泳图谱衍生RIN值（RNA完整性数值）相比，该检测方法更敏感且更特异8。本研究的质量控制仅限于实时PCR，因为已有独立研究组表明，除RNA外，从NCFPE组织中提取的DNA和蛋白质质量也优于FFPE组织8,9,13。
本方案遵循CEN关于分析前处理程序的技术规范要求，适用于以下环节（如SBFS配方、固定条件、RNA质量控制、验证等）： 体外 体外诊断（IVD），这些标准由欧洲标准化委员会（CEN）最近发布（例如，CEN/TS 16827-1:2015，用于从FFPE组织中分离RNA，该标准引用了ISO 15189标准）。
该方法仅限于这种特定的固定剂。尽管多项研究已表明，使用非交联、无甲醛固定剂能够良好地保存生物分子和形态结构，但其主要应用于研究领域，尚未用于常规医学实践。其中一个原因是，若以其他固定剂替代金标准SBFS固定法，则需要进行多种验证研究，因为并非所有针对FFPE材料优化的方案都适用于非交联固定剂固定的样本。本FISH实验方案未测试其他组织固定方法。
本文所述的简单固定后步骤具有使用经IVD批准的检测试剂盒的优势，适用于FFPE和NCFPE组织。

个体化医疗日益依赖于结合组织形态学和分子分析的多参数检测。作为金标准的福尔马林固定组织方法可提供优异的形态学质量1,2。然而，福尔马林引起的蛋白质和核酸的化学修饰及交联3,4,5会干扰分子分析6。这些分子修饰会降低核酸和蛋白质的质量，并可能导致基因序列假象7或基于聚合酶链式反应（PCR）检测的灵敏度下降8。尽管已投入大量努力优化针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的分子检测方法，但总体而言，组织的冷冻保存仍优于福尔马林固定，因此有必要将组织样本分样以进行不同的保存处理。为避免分子分析时需进行冷冻保存，已开发出一种非交联、不含福尔马林的固定液PAXgene Tissue。该商业化系统由固定液和稳定液组成，其中含有多种醇类、乙酸以及一种可溶性有机化合物。多项研究已证实，该系统可有效保存核酸、（磷酸化）蛋白质及组织形态6,9,10,11,12,13。
在癌症诊断中，FISH 的一个特定应用是检测多种染色体改变，例如易位、亚显微缺失和扩增14。例如，20%的浸润性乳腺癌肿瘤表现出人表皮生长因子受体2（HER2）基因的扩增15,16,17，这与预后不良相关18,19。通过FISH检测乳腺癌中HER2的过表达和扩增状态，对于筛选适合接受抗HER2靶向治疗的患者至关重要，且该检测已被美国食品药品监督管理局（FDA）列为伴随诊断（http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm）17。为了在医疗保健中广泛开展基于FISH的伴随诊断，已开发并批准了用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的检测方法。
在之前的一项研究中，我们发现NCFPE组织不能用于已批准用于FFPE组织的FISH检测。然而，对NCFPE组织经4%缓冲甲醛进行不同后固定时间处理的时间序列实验表明，NCFPE组织切片后固定时间达到18小时或更长时间时，可获得与FFPE组织相当的结果14。
本研究中，我们提供了一项详细方案，并展示了非交联、无福尔马林的组织固定以及使用同一原发组织样本进行24小时4%缓冲甲醛后固定的处理方式，对HER2 FISH检测和RNA质量的影响。
<img alt="组织样本处理流程图；包括固定、RNA提取和实时PCR分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：荧光实验步骤示意图 原位 荧光原位杂交（FISH）及RNA分析，用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和非交联、无福尔马林固定的石蜡包埋（NCFPE）组织。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH，德国弗林茨巴赫</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>组织固定剂</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd.，加拿大贝卢瓦</td><td>www.simport.com</td><td>M-498</td><td>用于组织样本的标记、固定和石蜡包埋的保存装置</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH，德国希尔登</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>用于组织样本的采集、固定和稳定：包含10个预填充试剂容器，内含PAXgene Tissue FIX和PAXgene Tissue STABILIZER</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>813150</td><td>生物样本从化学固定到石蜡浸润的处理</td></tr><tr><td>Merck Millipore，德国慕尼黑</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td>MC1009834000</td><td>组织样本的脱水</td></tr><tr><td>VWR Chemicals，德国达姆施塔特</td><td>https://at.vwr.com</td><td>10293EP</td><td>组织样本的脱水</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG，奥地利维也纳</td><td>www.herba-chemosan.at</td><td>2549662 32</td><td>组织处理设备中使用的石蜡</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH，奥地利维也纳</td><td>www.LeicaBiosystems.com</td><td>39602004</td><td>石蜡包埋介质</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik，奥地利维也纳</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>用于组织学的组织石蜡包埋仪器</td></tr><tr><td>Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH，奥地利维也纳新多夫</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010</td><td>该设备用于生物学和医学中特别复杂的石蜡切片技术。仅允许熟练或经过专门培训的人员操作切片机，包括样本夹持、修块、切片以及从仪器上取下切片。</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S，丹麦格洛斯特鲁普</td><td>www.chem.agilent.com</td><td>K802021-2</td><td>涂层玻片，用于贴附福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH，德国希尔登</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中纯化总RNA</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH，德国希尔登</td><td>www.qiagen.com</td><td>765134</td><td>用于从PAXgene固定、石蜡包埋的组织切片中纯化总RNA</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH，德国布莱梅港</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>用于检测实体恶性肿瘤（如乳腺癌样本）中常见的ERBB2（又称HER2）基因扩增</td></tr><tr><td>3DHISTEC，匈牙利布达佩斯</td><td>www.3dhistech.com</td><td></td><td>用于扫描组织切片的数字设备，配备40x/1.2 NA物镜、四通道滤光片（DAPI/FITC/TRITC/Cy5）以及550万像素、16位、冷却型科学CMOS（互补金属氧化物半导体）相机</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4368814</td><td>高容量cDNA反转录试剂盒，包含将最多2 &amp;micro;g总RNA在单个20 &amp;micro;L反应体系中定量转化为单链cDNA所需的所有组分</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>PCR主混合液，包含用于PCR扩增及扩增子定量的聚合酶、核苷酸和SYBR Green</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific，美国特拉华州威尔明顿</td><td>www.thermofisher.com</td><td>序列号 F239</td><td>用于核酸定量的分光光度计</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量PCR系统</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4485701</td><td>PCR仪</td></tr><tr><td>Vysis/Abbott Laboratories，美国伊利诺伊州艾博特公园</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td><td>例如（ThermoBrite）07J91-020</td><td>用于原位变性/杂交程序的温控载玻片处理系统</td></tr></tbody></table>

使用非交联、无甲醛组织固定剂进行her2 fish的实验方案：结合冷冻保存与甲醛固定的优点

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

数十年来，由于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本能够优异地保存组织形态，其形态学评估一直是癌症诊断的金标准。随着个体化医学的发展，通过结合形态学与分子分析技术及诊断手段，可为特定个体疾病提供量身定制的靶向治疗。然而，从同一FFPE样本中同时开展形态学与分子检测具有挑战性，原因是福尔马林会引起核酸和蛋白质的化学修饰与交联，从而产生不利影响。近期已开发出一种非交联、无福尔马林的组织固定剂，旨在同时满足两个需求：即在形态学保存方面达到与FFPE相当的效果，在生物分子保存方面达到与冷冻保存相当的水平。由于荧光原位杂交（FISH）常需与组织病理学及分子诊断联合应用，我们测试了现有FISH方案在采用这种新型固定剂处理的组织上的适用性。我们发现，在非交联、无福尔马林且石蜡包埋（NCFPE）的乳腺癌组织切片上进行福尔马林后固定处理后，其人表皮生长因子受体2（HER2）FISH分析结果与FFPE组织相当。本方案描述了如何通过对组织切片进行简单的后固定步骤，将原本为FFPE组织开发并验证的FISH检测方法应用于NCFPE组织。

FISH HER2 检测：
FFPE 和 NCFPE 样本的 HER2-FISH 信号强度相似（图 2）。在大多数细胞中，两种样本均显示绿色信号明显多于红色信号（绿色信号代表扩增的 HER2 基因位点，红色信号为 CEN17 参考基因）。因此，该病例显示 HER2 基因扩增，提示该患者可能对曲妥珠单抗（一种抗 HER2 靶向治疗药物）产生治疗反应。FFPE 样本作为阳性对照。在非肿瘤细胞中观察到的信号（FFPE 和 NCFPE 中均存在）可作为 HER2 基因扩增的内部参考和阴性对照。每次分析系列中，至少应使用一个已知基因扩增状态的切片作为杂交反应的阳性对照。
RNA 质量：
通过实时逆转录PCR检测两个不同病例的相应FFPE和NCFPE样本，显示出RNA质量的差异。实验结果表明，GAPDH mRNA在不同扩增子长度（即71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp）下的扩增效率存在差异。所有来自FFPE样本的Ct（循环阈值）值均高于NCFPE样本。该差异表明从FFPE组织中提取的mRNA的PCR扩增能力较低，提示其发生了更显著的化学修饰。此外，长扩增子的Ct值高于短扩增子，表明mRNA存在片段化现象。相比之下，不同扩增子长度的Ct值变化斜率显示，FFPE组织中的mRNA片段化程度明显高于NCFPE组织（图3）。
<img alt="显示DNA分析中染色体标记分布的细胞荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：对应福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和非交联、无福尔马林固定石蜡包埋（NCFPE）组织切片的HER2 FISH代表性结果。 展示了来自相同FFPE（A）和NCFPE（B）组织的对应样本。与正常间期细胞（C）中预期出现两个绿色信号（HER2）和两个红色信号（CEN17）不同，HER2基因位点扩增的细胞表现为多个绿色信号拷贝（HER2）（D）。HER2扩增状态在FFPE和经后固定的NCFPE切片中一致（A，B）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA 质量控制；实时逆转录 PCR；图表；Ct 值与 GAPDH 扩增子长度的关系；数据比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：用于 RNA 质量控制的实时逆转录 PCR 实验结果。 Y 轴：显示 GAPDH 基因的 Ct（循环阈值）值；X 轴：不同扩增子长度（71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp）。mRNA 来源于两个不同乳腺癌组织样本的 FFPE 和 NCFPE 样本，这些样本平行处理，提取后逆转录为 cDNA 进行 PCR 扩增。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

荧光 原位 在个体化医疗中，为选择治疗方案，通常需要将荧光原位杂交（FISH）与组织病理学及分子诊断相结合。本文介绍一种新型的非交联、无甲醛组织固定剂，通过在FISH前增加一步后固定处理，可实现对同一样本进行高质量的形态学、分子生物学及FISH分析。

使用非交联、无甲醛组织固定剂进行HER2 FISH的实验方案：结合冷冻保存与甲醛固定的优点

福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本的形态学评估几十年来一直是癌症诊断的金标准，因其……

个体化医疗需要从经典组织学检查到分子分析等多种类型的检测，通常需对肿瘤样本进行多种原位技术分析，以选择最佳治疗方案。这些检测技术可从单一样本中实现多种分析技术的应用。本文展示了一种在简单的福尔马林后固定步骤中使用非交联固定剂的方法，表明原本为福尔马林固定石蜡包埋组织开发并验证过的实验方案，也可用于细胞样本，从而获得良好的形态学结构、高质量的RNA，以及完整的原位杂交结果。典型的杂交条件不适用于无甲醛固定的组织以获得FISH结果。我们发现，关键因素并非渗透性，而是化学校正时间，这对于从果胶固定组织中获得可比的FISH结果至关重要。仅用于FISH的切片经过了固定和后续固定处理。与福尔马林固定石蜡包埋（FFP）组织相比，剩余的无甲醛固定组织在分子分析方面具有更优的表现，这一点已通过逆转录PCR（RTPCR）得到证实。该实验步骤由本实验室技术员 Daniela Pabst 演示。首先，使用无菌手术刀将乳腺癌组织样本切成两半，每块厚度为四毫米，以确保足够的组织量。固定时，组织大小不得超过 4×15×15 毫米，可采用标准缓冲甲醛溶液，或替代性的非交联、无甲醛组织固定液。将肿瘤标本的一半放入标准组织包埋盒中，并浸入 SBFS 溶液。将另一半肿瘤标本置于替代固定液中固定 24 小时，固定液体积与组织体积之比为 4:1。然后，打开容器，将组织包埋盒旋转180度并浸入稳定剂溶液中，将经替代固定法处理的样本置于其中孵育2至72小时。接着，将经SBFS固定的样本连同包埋盒一起放入盛有70%乙醇的容器中，在室温下放置30分钟，以去除残留的SBFS。按照文本方案中所述进行组织处理和包埋后，使用切片机对FFPE和NCFPE蜡块进行3微米厚度的切片。将每种类型的切片各取一些放入冷水浴中。用细毛笔将漂浮的切片捞起，置于洁净的载玻片上，然后转移至温水浴中。再次用毛笔将已舒展的切片无皱褶地转移至载玻片上。同时准备进行RNA提取，以便对同一样本进行逆转录PCR分析，方法是将每种类型的切片各取一部分放入反应管中。对于组织切片的脱蜡处理，我们使用染色缸在室温下逐步水化切片，每个染色缸中含有250毫升不同的试剂。首先将切片置于100%二甲苯中两次，每次15分钟，然后将切片转移至96%乙醇中两次，每次15分钟。接下来，将切片依次经过浓度逐步降低的乙醇溶液，每种浓度孵育 2 分钟。最后，将切片转移至蒸馏水中清洗两次，每次 10 分钟。通过将 NCFPE 载玻片放入装有 SBFS 的新染色缸中，在室温下固定 24 小时，以完成后续固定步骤。将罐子置于通风橱中，完成24小时的后固定步骤。令人意外的是，所有超过18小时的后固定时间所得到的结果均与甲醛固定石蜡包埋材料的结果相似。用磷酸盐缓冲液洗涤载玻片，每次10分钟，重复三次，以去除载玻片上多余的SPFS。随后用蒸馏水再清洗两次，每次10分钟。接着，将含有250毫升柠檬酸预处理液的染色缸置于98摄氏度的水浴中。将水化后的FFPE组织置于固定好的NCFPE载玻片上，放入染色缸中，孵育15分钟。然后，在新的染色缸中，用蒸馏水在室温下清洗载玻片 3 分钟。进行蛋白酶消化时，将载玻片放入温度可控的杂交仪中，设置温度为 37 摄氏度。立即以滴加方式将即用型胃蛋白酶溶液加至组织切片上，直至完全覆盖组织。然后，在杂交系统中于37摄氏度孵育九分钟。接着，将切片放入含有SSC洗涤缓冲液的容器中，孵育五分钟。最后，将切片置于室温下的蒸馏水中一分钟。将切片依次浸入梯度酒精中进行脱水，每级酒精处理一分钟。脱水完成后，将切片置于空气中干燥。进行杂交时，取10 µL混合的HER2和sun 17探针滴加至干燥的组织切片上，每张样本加盖盖玻片，并用橡胶胶水密封。在杂交体系中，于75摄氏度下变性探针和样本DNA 10分钟。杂交体系自动降温至37摄氏度，杂交过夜进行。次日，用镊子小心去除橡胶胶水及盖玻片，进行杂交后处理及保护。将样本置于染色缸中，在37摄氏度预热的1X缓冲液A中孵育5分钟。接着，在27摄氏度下用预热的1X洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次5分钟。然后将玻片依次在70%、90%和100%乙醇中脱水，每个浓度各1分钟。将样品在空气中干燥，并避光保存。染色时，取30微升DAPI溶液滴加至杂交区域，避免产生气泡。加盖盖玻片，于避光条件下孵育15分钟。用滤纸轻轻按压玻片以去除多余的 DAPI 溶液。将玻片置于 2 至 8 摄氏度避光环境中保存，最长可保存两周，随后进行共聚焦显微镜观察。使用绿色和橙色通道的滤光片采集图像。按照文本方案中所述进行数据解读和RNA质量评估。此处显示的是来自经甲醛固定样本与经后固定的非交联固定样本结果的直接比较。两者信号强度相似，背景也相似。在正常的间期细胞中，HER2 基因位点和 17 号染色体着丝粒参考位点对应的红色和绿色信号数量相等，表明 HER2 基因未发生扩增。此处显示的是另一病例的结果，其中 HER2 基因发生扩增，HER2 位点的信号比参考基因的信号更强且更宽。该现象在甲醛固定和非交联固定的组织中均明显可见。该图显示了GAPDH mRNA不同扩增子长度的扩增效率。对于甲醛固定的样本，大约需要23个循环；而对于非交联固定材料，循环数减少至20个。在较长的扩增子中，这种差异更为明显，表明使用非交联固定剂可显著降低片段化和化学修饰程度。观看本视频后，您应能充分理解如何通过在分析前处理过程中增加一个简单的后固定步骤，使用 FDA 批准的试剂对非交联固定的材料进行 FFPN 处理。该技术的主要优势在于，仅用于全义原位杂交的切片需要用甲醛进行后固定，而剩余的组织块则保存在非交联固定液中，因此可用于广泛的分子分析。当需要从相对较小的肿瘤组织中进行多种检测，且无法对同一样本分别按不同方案处理时，该方案在现代个体化医疗背景下尤为实用。此外，使用非交联性固定剂的优势在于其能够保存组织的特性，类似于冷冻保存的效果。这避免了使用液氮冷冻以及在化学环境中维持冷链的需要。这些在RNA质量上的差异并不明显，因此在使用经典的RNA质量控制检测方法（如RNA完整性数值）时，由于这些检测方法对于从固定及石蜡包埋样本中提取的RNA质量评估并不完全适用。

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