非交联无甲醛组织固定剂 HER2 鱼的协议, 结合低温保存和福尔马林固色的优点

个性化医疗需要从经典组织学到分子分析的不同类型的分析，并且对肿瘤进行各种原位技术以选择最佳疗法。调查技术允许从单个样本中使用各种分析技术。我们在这里证明，通过在简单的福尔马林固定后步骤中使用非交联固定剂，您可以使用最初为正式和固定石蜡包埋材料开发和验证的方案，可以从细胞样品中使用，产生良好的形态、良好的 RNA 质量和更全义原位杂交的良好结果。

典型的杂交条件不适用于不含福尔马林的固定组织产生 FISH 结果。我们揭示了从果胶固定组织获得可比的 FISH 结果的关键不是渗透，而是化学校正时间。只有用于 FISH 的部分是正式的和后期固定的。

正如 RTPCR 所证明的那样，相对于 FFP 组织，剩余的不含福尔马林的固定组织能够实现更出色的分子分析。我们由我实验室的技术人员 Daniela Pabst 演示的程序。首先，用无菌手术刀将乳腺癌组织样本切成两半，每半厚 4 毫米，以确保足够的组织数量。

使用最大尺寸为 4 x 15 x 15 毫米的限制剂通过标准缓冲福尔马林溶液或通过替代的非交联、不含福尔马林的组织固定进行固定。将肿瘤标本的一半放入标准组织盒中，并将其浸入 SBFS 中。将肿瘤标本的另一半置于替代固定液中 24 小时，体积比为四份固定剂和一份组织。

然后，打开容器，将组织盒旋转 180 度，然后将其浸入，将替代固定的样品转移到稳定剂溶液中 2 至 72 小时。接下来，将装有 SBFS 固定样品的组织包埋盒放入装有 70% 乙醇的容器中，在室温下放置 30 分钟，以去除残留的 SBFS。按照文本协议中的说明进行组织处理和包埋后，使用切片机切割 FFPE 和 NCFPE 块的三个微米切片。

将每种类型的切片放入冷水浴中。用细画笔在精细的显微镜载玻片上拾取漂浮部分，然后将其转移到温水浴中。用画笔再次将拉伸的部分捡起显微镜载玻片上，没有任何皱纹。

还要准备 RNA 分离，通过将每种类型的切片中的一些放入反应瓶中，对同一样品进行逆转录 PCR。对于组织切片的脱蜡，我们在室温下用 250 毫升不同的试剂在染色罐中逐步水合切片。首先将切片放入 100% 二甲苯中 2 次，反应 15 分钟，然后将切片转移到 96% 乙醇中 2 次，反应 15 分钟。

接下来，逐步降低乙醇百分比，将切片移入其中，将每种溶液孵育 2 分钟。最后，将切片转移至蒸馏 2 次，每次 10 分钟。将 NCFPE 玻片放入装满 SBFS 的新染色瓶中，在室温下放置 24 小时，对 NCFPE 玻片进行后固定。

在固定后 24 小时步骤中将罐子留在通风橱中。令人惊讶的是，所有超过 18 小时的固定后时间都产生了与使用正式和固定石蜡材料获得的结果相似的结果。通过在磷酸盐缓冲盐水中洗涤 10 分钟 3 次，去除载玻片上多余的 SPFS。

然后用蒸馏水第二次洗涤 10 分钟，两次。接下来，将装有 250 毫升柠檬酸热预处理溶液的染色罐放入 98 摄氏度的水浴中。将水合的 FFPE 放入固定的 NCFPE 玻片中放入罐中，孵育 15 分钟。

然后，在新的染色罐中，在室温下用蒸馏水洗涤玻片 3 分钟。对于蛋白水解，将载玻片置于 37 摄氏度的温控杂交中。立即将即用型胃蛋白酶溶液滴加到组织切片上，直到它们完全覆盖。

然后，在 37 摄氏度的杂交系统中孵育 9 分钟。接下来，将玻片放入含有 SSC 洗涤缓冲液的罐中，孵育 5 分钟。将玻片置于室温下蒸馏水中 1 分钟。

一系列分级醇中对切片进行脱水，每个切片脱水 1 分钟。在脱水系列之后，风干切片。对于杂交，将 10 微升 HER2 和 sun 17 探针的组合移液到干燥的组织切片上，用盖玻片覆盖每个样品，并用橡胶水泥密封。

在 75 摄氏度的杂交系统中对探针和样本 DNA 进行编码变性 10 分钟。杂交系统会自动降低到 37 摄氏度，杂交会在一夜之间进行。第二天，用镊子小心地去除橡胶粘合剂和盖玻片，以进行后杂交和保护。

在含有 37 摄氏度预热 1X 缓冲液 A 的染色瓶中孵育各大小 5 分钟。接下来，使用预热的 1X 洗涤缓冲液在 27 °C 下洗涤玻片 2 次，每次 5 分钟。然后，对于每个浓度，在 70%90% 和 100% 乙醇中脱水载玻片 1 分钟。

在空气中干燥样品，并避光保存。染色时，将 30 微升 DAPI 溶液涂抹在杂交区域，避免气泡。在避光孵育切片 15 分钟之前，用盖玻片盖住切片。

轻轻按压滤纸之间的载玻片，小心地去除多余的 DAPI 溶液。将载玻片在 2 至 8 摄氏度下避光保存长达两周，直到通过共聚焦显微镜进行评估。使用绿色和橙色通道的滤镜采集图像。

按照文本方案中的描述进行 RNA 质量的数据解释和评估。这里显示的是从正式和固定样品中获得的结果与已后固定的非交联固定样品的直接比较。信号强度相似，背景也相似。

在正常的间期细胞中，对应于 HER2 基因座和 sen 17 参考基因座的红色和绿色信号数量相等，这表明 HER2 基因没有扩增。这里显示的是另一种情况的结果，其中 HER2 基因被扩增，HER2 基因座的信号比内参基因的信号强得多，也宽得多。这种现象在正式和固定、非交联的固定组织中表现明显。

该图显示了 GAPDH mRNA 不同扩增子长度的扩增效果。对于福尔马林，大约需要 23 个循环，对于非交联固定材料，这减少到 20 个循环。这种差异在较长的扩增子上变得更加明显，这表明使用非交联固定剂可以显著减少碎裂和化学修饰。

观看此视频后，您应该很好地了解如何通过在预分析程序中添加一个简单的固定后步骤，在非交联固定材料上使用 FDA 批准的密钥来检测 FFPN 材料。该技术的主要优点是，只有用于全义原位杂交的部分用于与福尔马林后固定，而其余部分固定在非交联固定剂中，因此可用于广泛的分子分析。该方案在现代个性化医学的背景下特别有用，当必须对相对较小的肿瘤进行多次分析时，并且无法为不同的方案处理组织标本。

此外，使用非交联固定剂的优点是它可以保留组织特性，如冷冻保存。这避免了冷冻液氮的需要，并在化学环境中保持冷却链。RNA 质量的这些差异并不明显，因此当使用经典的 RNA 质量控制分析（如 RNA 完整性值）时，因为这些分析在从固定和石蜡包埋材料中分离的 RNA 质量上并不完全形成。