In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本实验的总体目标是通过共聚焦显微镜延时成像，直接观察从经电穿孔处理的胚胎脑组织制备的器官型脑片培养中呈放射状迁移的神经元。该方法有助于研究新皮层发育的关键方面，可用于探究神经元极性形成以及神经元向脑内最终位置进行放射状迁移过程中所涉及的分子机制。

该技术的主要优势在于能够分析迁移神经元的动态特性，包括速度曲线、平均迁移速度以及迁移方向的变化。首先将一只适当麻醉的怀孕小鼠仰卧置于加热板上。检查其足底反射是否消失。

然后，小心地用凡士林覆盖眼睛，以防止其干燥。接下来，轻柔地展开四肢，并用手术胶带将其固定在加热板上。用70%乙醇擦拭腹部进行消毒，再使用碘溶液处理，然后在腹部覆盖一块无菌纱布，该纱布已剪开一个小口，用于后续的腹部切口。

用抑菌氯化钠溶液润湿纱布。通过足底反射消失重新评估手术麻醉的深度后，使用带齿显微 Adson 镊子和角度精细剪刀沿腹部正中线剪开皮肤约 1.5 厘米。然后沿腹白线剪开下方的肌肉。

用环形镊子夹住胚胎之间的子宫角，并轻轻将其放置在湿润的纱布上，注意不要扰动胎盘或供血血管。然后，小心调整胚胎位置，以清晰暴露侧脑室，侧脑室表现为与矢状窦平行的新月形阴影。注射部位位于色素眼与窦汇之间连线的中点处，此处矢状 窦分叉为两条横窦。

确定位置后，将显微注射针穿过子宫壁并插入侧脑室。接着，使用脚踏开关控制的显微注射仪，以5到10次脉冲注入一至两微升的DNA溶液。可通过观察有颜色的DNA溶液是否充满脑室系统来判断注射是否成功。

然后，放置镊子型电极，使正极位于注射侧脑室的同一侧，负极位于胚胎头部耳下方的对侧脑室位置。用数滴抑菌氯化钠溶液润湿电穿孔部位，并施加5次持续时间为50毫秒的电脉冲，脉冲间隔为950毫秒。负极处出现气泡表明有电流通过。

60 至 90 毫安的电流通常足以实现成功的电穿孔。电流过低将无法有效转染神经元，而电流过高则可能导致胚胎死亡。完成第一侧子宫角所有胚胎的操作后，轻柔地将其放回腹腔内。

缝合肌肉层和皮肤后，用碘溶液仔细消毒，并使用纤维素棉签轻轻擦去眼睛上的凡士林。将小鼠置于红外灯下，直至其苏醒。采用批准的方法处死妊娠雌鼠后，取出含有胚胎的子宫，放入盛有冰冻完全HBSS的10厘米培养皿中。

从此时起，将所有溶液、胚胎和脑组织置于冰上。在体视显微镜下操作时，使用尖头镊子和一对蒂宾根弹簧剪刀将每个胚胎从子宫中分离出来。将胚胎转移至另一含有冰冻完全HBSS的培养皿中。

在脑干水平做一切口，沿矢状中线切开。剥离覆盖在脑表面的皮肤和软骨。然后，在大脑半球后方切断脑干，将脑组织从颅骨中取出。

用微型勺状刮铲将脑组织转移至含有冰上预冷的完全HBSS的12孔板中。将同一窝的所有脑组织均收集至该12孔板内。随后，使用荧光体视显微镜在12孔板中对脑组织进行观察，根据荧光强度以及电穿孔区域的大小进行筛选。

选择两到四个具有明亮荧光信号且包含假定体感皮层的大脑用于后续处理。然后，将熔融的3%低熔点琼脂糖溶液倒入可剥离的一次性包埋模具中。使用微型勺形刮铲从12孔板中取出大脑，并用精细的擦镜纸小心吸除大脑周围多余的完全HBSS溶液。

将脑组织轻轻放入琼脂糖溶液中，然后使用20号针头将其推至模具底部，并仔细调整其位置。对于冠状切面，应使嗅球朝上以定位脑组织。

将模具保持在冰上，直至琼脂糖溶液完全凝固，然后进行脑组织切片。使用干净的剃刀刀片修去脑组织周围多余的琼脂糖，除嗅球区域外，其余各侧保留约1毫米的琼脂糖；在嗅球区域应保留2至3毫米的琼脂糖。在样本上涂抹少量氰基丙烯酸盐胶水后，将修整好的琼脂糖块固定在载物台上，使嗅球朝下。

将样本台转移至含有冰冻完全HBSS的振动切片机切片室中，并将脑组织背侧朝向刀片放置。使用低至中等振幅和极慢的切片速度，切割包含电穿孔区域的250微米厚脑片。通常，每个成功电穿孔的脑组织可获得四到六片具有明亮荧光信号的脑片。

用尖头镊子夹住一个区域的琼脂糖边缘，将脑片拉至弯曲的微型药匙上。以这种方式，小心地将脑片转移至含有冰冻完全HBSS的六孔板中。用100微升完全HBSS润湿经层粘连蛋白包被的膜插件。

然后，使用弯头微型药匙和镊子小心地将切片转移到膜上。轻轻将切片从药匙推至膜表面，再用镊子进行位置调整。继续转移剩余的切片。

最多可将五片组织置于一个膜插件上。用移液器吸除多余的完全HBSS溶液。然后，借助镊子小心地将带有组织切片的膜插件放入含有1.8毫升切片培养基的六孔板中。

通过倒置显微镜观察脑片，选择用于成像的脑片。应选择上部室下区（SVZ）中具有明亮单个神经元、且神经元正向脑片表面呈放射状迁移的脑片。若可见贯穿整个联合板的放射状胶质细胞的细长荧光突起，则表明存在完整的放射状胶质支架结构，迁移中的联合神经元将沿此支架移动。

将带有选定脑片的膜插件转移至一个直径为50毫米、底部为玻璃的培养皿中，皿内含2毫升脑片培养基。将培养皿放入共聚焦显微镜的环境培养箱中。将分辨率设置为512×512像素。

将扫描速度从400赫兹提高到700赫兹，以将帧率从约1.4提高到约2.5帧每秒。平均次数不超过两次。通过电穿孔区域定义Z轴扫描序列，步长为1.5微米。

通过每30分钟采集一次Z轴层扫图像，开始延时成像系列。所述设置可在采集过程中保持较低的光损伤，同时实现图像足够的分辨率和亮度。该视频显示了E16.5时期皮层神经元从脑室区和室下区迁移到皮层板的过程。

在胚胎第14.5天，将IRES-GFP对照质粒电转至Bcl11a floxed条件性转基因小鼠中。该视频由108帧组成，播放速率为每秒5帧。比例尺代表100微米。

包含 Cre-IRES-GFP 的 DNA 质粒载体经电穿孔后，影响了条件性 Bcl11a 基因敲除脑中的皮层神经元迁移。如图所示，极少有神经元能够穿过中间带到达皮层板。该视频显示了左侧 GFP 标记的对照组皮层神经元与右侧 Bcl11a 突变型神经元的极化情况。

这些代表性的对照组 Bcl11a 突变神经元的动态轨迹来自 E16.5 脑片培养物的时间序列图像，时间分辨率为每小时一次。同样，左侧显示对照组大脑的数据，右侧显示 Cre-IRES-GFP 电穿孔大脑的数据。从这些来自对照组和 Bcl11a 突变脑片培养物的代表性轨迹可以看出，Bcl11a 突变神经元经常出现迁移速度减慢的重复阶段，并随机改变迁移方向，如红色箭头所示。

可以通过迁移神经元的轨迹计算速度分布。如图所示，与对照组相比，更大比例的Bcl11a突变神经元迁移速度较慢。偏转角可根据轨迹数据计算得出。

从该直方图可以看出，由黑色柱状图表示的 Bcl11a 突变神经元相较于对照组表现出更大的偏转角度。一旦掌握，子宫内电穿孔和器官型脑片培养的制备每项操作均可在两小时内完成。该方法可轻松适用于通过基因功能获得与缺失，以及血管相关实验，对径向迁移的皮层神经元中的目的基因进行区段化分析。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过延时共聚焦显微镜直接观察从经电穿孔的胚胎脑组织制备的器官型脑片培养中呈放射状迁移的神经元。