延期共聚焦显像移植神经元在器官性切片培养胚胎小鼠脑使用在Utero电穿孔

该方案提供了直接观察径向迁移皮质神经元的指导。 在子宫电穿孔中，组织切片培养和延时共聚焦成像结合直接动态地研究过度表达或下调基因在迁移神经元中的作用并分析其在发育过程中的分化。

该程序的总体目标是通过延时共聚焦显微镜从电穿孔胚胎脑制备的器官型切片培养物中直接观察径向迁移的神经元。这种方法可以帮助研究新皮层发育的关键方面。它允许研究神经元极化和神经元向大脑内最终位置的径向迁移所涉及的分子机制。

该技术的主要优点是可以分析迁移神经元的动态特性，包括速度曲线、平均迁移速度以及迁移方向的变化。首先将适当麻醉的怀孕小鼠仰卧位放在加热板上。检查踏板反射是否消失。

然后，小心地用凡士林覆盖眼睛，以防止它们干燥。接下来，轻轻展开四肢并用手术胶带将它们固定在加热板上。先用 70% 乙醇擦拭，然后用碘溶液擦拭腹部消毒，然后将无菌纱布（其中已为腹部切口切开）放在腹部。

用抑菌氯化钠溶液润湿纱布。在重新评估手术麻醉的发展后，由于踏板反射丧失，使用锯齿状的微型 Adson 镊子和倾斜的细剪刀沿腹部中线切割约 1.5 厘米的皮肤。然后，沿着白线切开下面的肌肉。

用环形镊子抓住胚胎之间的子宫角，轻轻地将其放在湿润的纱布上，不要打扰胎盘或供应血管。然后，小心地放置胚胎，以清楚地看到侧脑室，侧脑室表现为平行于矢状窦的新月形阴影。注射部位位于色素沉着的眼睛和鼻窦汇合处之间的一条线的中间，矢状窦分支到两个转移窦。

确定后，将显微注射针穿过子宫壁并推入侧脑室。接下来，使用带有脚踏板的显微注射器以 5 到 10 次脉冲注入 1 到 2 微升 DNA 溶液。可以通过有色 DNA 溶液监测注射成功，该溶液应充满心室系统。

然后，放置镊子式电极，使正极与注射的心室位于同一侧，负极位于胚胎头部耳朵下方注射的心室的另一侧。用几滴抑菌氯化钠溶液润湿电穿孔部位，并施加 5 次持续时间为 50 毫秒的电流脉冲，间隔为 950 毫秒。负极上的气泡表示电流。

60 至 90 毫安通常足以成功进行电穿孔。较低的电流不会有效地转染神经元，而较高的电流可能会导致胚胎死亡。对第一个子宫角的每个胚胎重复该过程后，轻轻地将其放回腹腔。

缝合肌肉层和皮肤后，用碘溶液仔细消毒，并使用纤维素棉签轻轻去除眼睛中的凡士林。将鼠标放在红外灯下，直到它被唤醒。使用批准的方法对怀孕的雌性实施安乐死后，取出含有胚胎的子宫，并将其放入装有冰冷完全 HBSS 的 10 厘米培养皿中。

从这时起，将所有溶液、胚胎和大脑保持在冰上。在立体显微镜下工作时，使用细尖镊子和一把 Vannas Tubingen 弹簧剪刀将每个胚胎与子宫分开。将胚胎转移到另一个含有冰冷完全 HBSS 的培养皿中。

在脑干水平切开，沿矢状中线切开。剥去覆盖大脑的皮肤和软骨。然后，切掉半球后面的脑干，从颅骨中取出大脑。

用微勺刮刀将大脑转移到含有冰冷完全 HBSS 的 12 孔板中。从 12 孔板中的垫料中收集所有大脑。然后，使用荧光立体显微镜筛选 12 孔板中的大脑的荧光亮度以及电穿孔区域的大小。

选择 2 到 4 个具有明亮荧光信号的大脑和假定的体感皮层进行进一步处理。然后，将熔融的 3% 低熔点琼脂糖溶液倒入可剥离的一次性包埋模具中。使用微勺刮刀从 12 孔板中取出大脑，并使用细纸巾小心地从大脑周围排出多余的完全 HBSS。

将大脑轻轻放入琼脂糖溶液中。然后，用 20 号针将其推到模具底部并仔细调整其位置。对于冠状切片，将大脑定向，使嗅球朝上。

将霉菌放在冰上，直到琼脂糖溶液凝固，然后继续切开大脑。使用干净的剃须刀片修剪掉大脑周围多余的琼脂糖，在所有侧面留下大约 1 毫米的琼脂糖，除了嗅球，应留下 2 到 3 毫米的琼脂糖。在标本上涂抹少量氰基丙烯酸酯胶后，固定修剪过的琼脂糖块，使嗅球朝下。

将标本台转移到含有冰冷完全 HBSS 的振动刀片切片机的切片室中，并将大脑的背面朝向刀片。切下 250 微米厚的脑切片，其中包含电穿孔区域，振幅为低到中等，切片速度非常慢。通常从每个成功的电穿孔大脑中获得 4 到 6 个具有明亮荧光信号的切片。

用细尖镊子抓住一段琼脂糖边缘，然后将切片拉到弯曲的微勺刮刀上。以这种方式，小心地将脑切片转移到含有冰冷完全 HBSS 的六孔板中。用 100 微升完全 HBSS 润湿层粘连蛋白包被的膜插入物。

然后，使用弯曲的微勺刮刀和镊子小心地将切片转移到膜上。轻轻地将刮刀中的切片推到膜上，然后使用镊子定位。继续传输剩余的切片。

一个膜插件上最多可以放置 5 个切片。用移液管去除多余的完全 HBSS。然后，在镊子的帮助下，小心地将带有切片的膜插入物放入含有 1.8 毫升切片培养基的六孔板中。

通过倒置显微镜观察切片，选择脑切片进行成像。选择一个切片，在上部 SVZ 中具有明亮的单个神经元径向向切片的堆表面迁移。跨越整个共轭板的放射状神经胶质细胞的精细荧光过程的存在表明迁移共轭神经元使用完整的放射状神经胶质支架。

将带有选定切片的膜插入物转移到含有 2 mL 切片培养基的 50 毫米直径玻璃底培养皿中。将培养皿放入共聚焦显微镜的气候室中。将分辨率设置为 512 x 512 像素。

将扫描速度从 400 赫兹提高到 700 赫兹，以将帧速率从每秒约 1.4 帧提高到每秒约 2.5 帧。使用不超过两倍的平均法。定义一个通过电穿孔区域的 Z 堆栈，步长为 1.5 微米。

通过每 30 分钟进行一次 Z 堆栈来开始延时序列。所述设置允许图像具有足够的分辨率和亮度，同时在采集过程中保持较低的照片损伤。这部电影展示了 E16.5 皮质神经元从脑室室下区迁移到皮质板。

在 Bcl11a 中，在胚胎第 14.5 天对 IRES-GFP 对照质粒进行电穿孔后，絮凝条件转基因。影片由 108 帧组成，速率为每秒 5 帧。比例尺代表 100 微米。

含有 Cre-IRES-GFP 的 DNA 质粒载体的电穿孔影响了条件性 Bcl11a 絮凝脑中的皮层神经元迁移。如图所示，很少有神经元通过中间区到达皮质板。这部电影显示了左侧 GFP 标记对照的皮层神经元与右侧 Bcl11a 突变体的神经元的极化。

Bcl11a 突变神经元中代表性控制的这些动画痕迹是从 E16.5 切片培养物的延时系列中获得的，具有一小时间隔的分辨率。同样，来自对照大脑的数据显示在左侧，来自 Cre-IRES-GFP 电穿孔大脑的数据显示在右侧。从来自对照和 Bcl11a 突变切片培养物的代表性痕迹集合中可以看出，Bcl11a 突变神经元经常经历迁移速度降低和方向随机改变的重复阶段，如红色箭头所示。

速度曲线可以根据迁移神经元的痕迹计算出来。如图所示，与对照组相比，更大比例的 Bcl11a 突变神经元的迁移速度较慢。偏差角可以根据跟踪数据计算得出。

从该直方图中可以看出，与对照相比，由黑条表示的 Bcl11a 突变神经元表现出更大的偏差角。一旦掌握，该技术可以在不到两个小时的时间内完成，用于子宫内电穿孔和器官型脑切片培养的制备。该程序可以很容易地适应通过功能的获得和丧失以及血管实验对径向迁移皮质神经元中感兴趣的基因进行分数分析。

观看此视频后，您应该对如何通过延时共聚焦显微镜从电穿孔胚胎脑制备的器官型切片培养物中直接观察径向迁移的神经元有很好的了解。