In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本实验的总体目标是通过共聚焦显微镜延时成像，直接观察从经电穿孔处理的胚胎脑组织制备的器官型脑片培养中呈放射状迁移的神经元。该方法有助于研究新皮层发育的关键环节，可用于探究神经元极性形成及其向大脑内最终位置进行放射状迁移过程中所涉及的分子机制。

该技术的主要优势在于能够分析迁移神经元的动态特性，包括速度变化曲线、平均迁移速度以及迁移方向的改变。首先将一只适当麻醉的怀孕小鼠仰卧置于加热板上。检查其足底反射是否消失。

然后，小心地在眼睛上覆盖一层凡士林，以防止其干燥。接下来，轻轻展开四肢，并用手术胶带将其固定在加热板上。用70%乙醇擦拭腹部进行消毒，随后使用碘溶液消毒，然后将一块无菌纱布覆盖在腹部，该纱布上已剪开一个小口，以便进行腹部切口。

用抑菌氯化钠溶液润湿纱布。通过足底反射消失重新评估手术麻醉效果后，使用带齿显微Adson镊和角度精细剪刀沿腹部正中线切开皮肤约1.5厘米。随后沿腹白线切开下方肌肉。

用环形镊夹住胚胎之间的子宫角，并轻轻将其放置在湿润的纱布上，避免扰动胎盘或供血血管。然后，仔细调整胚胎位置，以清晰暴露侧脑室，其表现为与上矢状窦平行的新月形阴影。注射部位位于色素眼与窦汇之间连线的中点处，此处上矢状窦分叉为两条横窦。

确定位置后，将显微注射针穿过子宫壁并插入侧脑室。接着，使用脚踏开关控制的显微注射仪，以5到10次脉冲注入一至两微升的DNA溶液。可通过观察有颜色的DNA溶液是否充满脑室系统来判断注射是否成功。

然后，放置镊子型电极，使正极位于注射侧脑室的同侧，负极位于胚胎头部耳下方的对侧脑室位置。用数滴抑菌氯化钠溶液润湿电穿孔部位，施加5次持续时间为50毫秒的电脉冲，脉冲间隔为950毫秒。负极处出现气泡表明有电流通过。

60 至 90 毫安的电流通常足以实现成功的电穿孔。电流过低将无法有效转染神经元，而电流过高则可能导致胚胎死亡。完成第一侧子宫角所有胚胎的操作后，轻柔地将其放回腹腔内。

缝合肌肉层和皮肤后，用碘溶液仔细消毒，并使用纤维素棉签轻轻擦去眼睛上的凡士林。将小鼠置于红外灯下，直至其苏醒。采用批准的方法处死妊娠雌鼠后，取出含有胚胎的子宫，放入盛有冰冻完全HBSS的10厘米培养皿中。

从此时起，将所有溶液、胚胎和脑组织置于冰上。在体视显微镜下操作时，使用尖头镊子和一对蒂宾根弹簧剪刀将每个胚胎从子宫中分离。将胚胎转移至另一含有冰冻完全HBSS的培养皿中。

在脑干水平做一切口，沿矢状中线剪开。剥离覆盖在脑表面的皮肤和软骨。随后在大脑半球后方切断脑干，将脑组织从颅骨中取出。

用微型勺状刮铲将脑组织转移至含有冰上预冷的完全HBSS的12孔板中。将同一窝的所有脑组织均收集至该12孔板内。随后，使用荧光体视显微镜在12孔板中对脑组织进行观察，根据荧光强度以及电穿孔区域的大小进行筛选。

选择两到四个荧光信号明亮且具有假定体感皮层的大脑用于后续处理。然后，将熔融的3%低熔点琼脂糖溶液倒入可剥离的一次性包埋模具中。使用微型药匙铲将大脑从12孔板中取出，并用细纸巾小心吸除大脑周围的过量完全HBSS溶液。

将脑组织轻轻放入琼脂糖溶液中，然后使用20号针头将其推至模具底部，并仔细调整其位置。对于冠状切面，应使嗅球朝上以定位脑组织。

将模具保持在冰上，直至琼脂糖溶液完全凝固，然后进行脑组织切片。使用干净的刀片修去脑组织周围多余的琼脂糖，除嗅球区域需保留2至3毫米琼脂糖外，其余各面保留约1毫米琼脂糖。在样本上涂抹少量氰基丙烯酸盐胶水后，将修整好的琼脂糖块固定在载物台上，使嗅球朝下。

将样本台转移至含有冰冻完全型HBSS的振动切片机切片室中，并将脑组织背侧朝向刀片放置。以低至中等振幅和极慢的切片速度，切割包含电穿孔区域的250微米厚脑片。通常，每个成功电穿孔的脑组织可获得四到六片具有明亮荧光信号的脑片。

用精细镊子夹住一个切片的琼脂糖边缘，将切片转移到弯曲的微型药匙上。以这种方式，小心地将脑切片转移至含有冰冻完全HBSS的六孔板中。用100微升完全HBSS润湿已包被层粘连蛋白的膜插件。

然后，使用弯头微型药匙和镊子小心地将切片转移至膜上。轻轻将切片从药匙推至膜表面，再用镊子进行位置调整。继续转移剩余切片。

最多可将五片组织置于一个膜插件上。用移液器吸除多余的完全HBSS。然后，借助镊子小心地将带有组织切片的膜插件放入含有1.8毫升切片培养基的六孔板中。

通过倒置显微镜观察脑片，选择用于成像的脑片。应选择上部室下区（SVZ）存在明亮单个神经元并向脑片表面呈放射状迁移的脑片。若可见贯穿整个联合板的放射状胶质细胞的细长荧光突起，则表明存在完整的放射状胶质支架结构，迁移中的联合神经元将依赖该结构进行迁移。

将带有选定脑片的膜插件转移至含有2毫升脑片培养基的50毫米直径玻璃底培养皿中。将培养皿放入共聚焦显微镜的气候培养箱内。将分辨率设置为512 × 512像素。

将扫描速度从 400 赫兹提高到 700 赫兹，以将帧率从约 1.4 提高到约 2.5 帧每秒。平均次数不超过两次。通过电穿孔区域定义 Z 层扫描，步长为 1.5 微米。

通过每30分钟采集一次Z轴层扫图像，开始延时成像系列。所述设置可在采集过程中保持较低的光损伤，同时确保图像具有足够的分辨率和亮度。该视频显示了E16.5时期皮层神经元从脑室区及室下区迁移至皮层板的过程。

在胚胎发育第14.5天，将IRES-GFP对照质粒电转至Bcl11a条件性floxed转基因小鼠中。该视频由108帧组成，播放速率为每秒5帧。比例尺代表100微米。

包含 Cre-IRES-GFP 的 DNA 质粒载体的电穿孔影响了条件性 Bcl11a 基因敲除脑中的皮层神经元迁移。如图所示，极少有神经元能够穿过中间带到达皮层板。该视频显示了左侧对照组中 GFP 标记的皮层神经元与右侧 Bcl11a 突变神经元的极化情况。

这些来自Bcl11a突变神经元中代表性对照的动态轨迹，是通过对E16.5脑片培养物进行每小时一次时间分辨率的时间推移成像获得的。同样，左侧显示的是对照脑组织的数据，右侧显示的是经Cre-IRES-GFP电穿孔处理的脑组织数据。从这些来自对照和Bcl11a突变脑片培养物的代表性轨迹可以看出，Bcl11a突变神经元经常出现迁移速度减慢的重复阶段，并随机改变迁移方向，如红色箭头所示。

可以通过迁移神经元的轨迹计算速度分布。如图所示，与对照组相比，更大比例的Bcl11a突变神经元迁移速度较慢。偏转角可通过轨迹数据计算得出。

从该直方图可以看出，由黑色柱状图表示的 Bcl11a 突变神经元相较于对照组表现出更大的偏转角度。一旦掌握该技术，子宫内电穿孔和器官型脑片培养的制备均可在两小时内完成。该方案可轻松适用于通过基因功能获得或缺失，以及血管实验，对径向迁移的皮层神经元中的目的基因进行区段化分析。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过延时共聚焦显微镜直接观察从经电穿孔的胚胎脑组织制备的器官型脑片培养中呈放射状迁移的神经元。