通过基因转移在新型RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中鉴定和表征转移因子

本实验的总体目标是通过将基因转移至新型 RIP-Tag;RIP-tva 小鼠模型中，识别并表征转移性因子。该方法有助于回答癌症转移领域中的关键问题，例如鉴定驱动因子及新型治疗靶点。这种癌症小鼠模型的主要优势在于，可通过体细胞基因转移技术针对胰腺β细胞前体病灶来识别转移性因子。

每只待感染的小鼠，需收获一皿15厘米的病毒生产用DF1细胞。首先，收集汇合度达到100%的15厘米培养皿中的培养基。随后，在预冷的离心机中以1650 × g、4 °C低速离心10分钟，去除细胞碎片。

接下来，将病毒上清液转移至聚烯烃超速离心管中。在超速离心机中以 9540 ×g 离心 1.5 小时，温度为 4 °C。尽可能吸除超速离心管中的上清液。

然后向超速离心管中加入 PBS，使每 15 厘米培养皿的最终病毒悬液体积为 100 微升。用实验室封口膜覆盖管口，于中等速度下涡旋振荡两分钟，以重悬不可见的病毒沉淀。随后将超速离心管置于 4 摄氏度摇床上轻摇一小时或过夜。

孵育结束后，将病毒悬液转移至微量离心管中，并立即进行病毒滴度测定。开始滴定操作前，需确保接种于12孔组织培养板中的DF1细胞已达到30%的汇合度。每次病毒滴度测定需使用一块12孔板。

首先，在微量离心管中将5微升病毒上清液与495微升培养基混合，配制10²倍稀释液，进行病毒上清液的10倍系列稀释。短暂涡旋振荡数秒钟。然后，取10²倍稀释液40微升转移至另一微量离心管中，与360微升培养基混合，制备10³倍稀释液。

涡旋混匀数秒。继续此步骤，依次稀释至10⁴和10⁵倍。随后，将2.25毫升培养基分装至五个6毫升聚苯乙烯管中，每管2.25毫升。

分别标记为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰。取0.25毫升的10⁵稀释液与2.25毫升培养基在6毫升聚苯乙烯管中混合，制备10⁶稀释液。涡旋振荡数秒，使其混匀。

对10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰稀释度重复上述操作。随后，从12孔板中的DF1细胞中移除原始培养基，并将1毫升稀释后的病毒液以每孔双复孔的方式加入各孔中。

将细胞置于37摄氏度、5% CO2条件下培养至少七天。开始感染程序时，先对一只七周龄的RIP-Tag RIP-tva小鼠进行麻醉。在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。

剃除RIP-Tag RIP-tva小鼠胸腔部位的毛发，将小鼠仰卧置于吸水实验台纸上，垫在snuggle safe加热垫上。轻捏足趾以检查动物是否无反应，确认已达到完全麻醉状态。伸展前肢，并用胶带固定。

标记小鼠的注射部位。在胸骨切迹与剑突顶端之间的中点处标记，并在解剖位置上略偏于胸骨左侧。然后使用聚维酮碘消毒液或氯己定消毒液擦拭小鼠胸前壁，随后用70%异丙醇或70%乙醇浸湿的纱布海绵进行擦拭。

用无菌的28.5号胰岛素注射器抽取50微升空气，以在500微升注射器的柱塞与弯月面之间形成空间。吸取100微升病毒。注射器内壁无液体的气腔对于观察心脏搏动至关重要。

保持针头垂直，一手绷紧小鼠皮肤，另一手将针头插入标记位置。当注射器内出现鲜红色血液脉冲时，立即停止推进针头，并用一只手固定针头在小鼠体内的深度。另一只手缓慢而小心地推动针栓，持续约60秒，以注入病毒悬液。

当注射器中出现鲜红色血流脉冲时，立即注入10-20微升。鲜红色含氧血液持续进入透明针座，表明针头已正确置于左心室。在最后一次推动活塞注入病毒悬液后，且尚未见到下一次鲜红色血流脉冲前，迅速将针头从胸腔中撤出。

在注射部位施加轻柔压力至少一分钟，以减少出血。然后小心地将小鼠转移至加热垫上或置于加热灯下，直至其完全清醒。RIP-Tag RIP-tva 小鼠在七周龄时感染指定的 RCASBP-Bcl-xL 逆转录病毒，并在16周龄时实施安乐死。

该照片显示了胰腺淋巴结中转移性胰腺神经内分泌肿瘤的典型突触素染色结果。在此，RIP-Tag RIP-tva 小鼠被接种了指定的 RCASBP-RHAM B 病毒。该照片展示了胰腺淋巴结中转移性胰腺神经内分泌肿瘤的典型突触素染色。此处，在注射 RCASBP-RHAMM B 病毒后，可在肝脏中观察到突触素染色。

需要牢记的是，对于RIP-Tag RIP-tva小鼠体内增殖的TVA细胞感染，病毒滴度必须高于每毫升10的8次方个感染单位，且RCASBP逆转录病毒载体最多可递送长达2.5千碱基的cDNA。该小鼠模型建立后，促成了一项范式转变式的重要发现：BCL-xL能够独立于其抗凋亡功能促进癌症转移。