Name: 转移因子的鉴定和表征转移到新的RIP 标签;tva小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解利用RIP-Tag;RIP-tva小鼠模型进行体细胞基因转移以研究癌症转移的方法。该技术通过心内注射禽类逆转录病毒靶向胰腺β细胞前病变，帮助识别转移因子和潜在治疗靶点。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Harold Varmus、Brian C. Lewis、Douglas Hanahan、Danny Huang、Sharon Pang、Megan Wong 和 Manasi M. Godbole。Y.C.N.D. 的研究由美国国防部资助项目 W81XWH-16-1-0619 和美国国立卫生研究院资助项目 1R01CA204916 支持。

伦理声明：动物实验严格按照威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。
1. 禽逆转录病毒载体的选择（基于RCASBP(A)或基于RCANBP(A)）
<ul style="list-style: none;">
	<li>载体源自劳斯肉瘤病毒11禽类逆转录病毒载体可递送 cDNA（≤2.5 kb）、短发夹 RNA（shRNA）、微小 RNA（miRNA）及其他非编码 RNA。 commercially available vectors 的列表见于 材料 以及其他需要直接向作者申请获取的资源。</li>
	<li>过表达目的基因，使用以下载体之一：RCASBP(A)12 (图1A），RCAS-X（图1B），RCAS-Y13 (图1C），RCASBP-Y DV14，或其他 ALV-A 载体（https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html）。</li>
	<li>利用shRNA敲低目的基因，使用以下载体之一：RCAN-X DV15 或 RCAS-RNAi16.</li>
	<li>过表达miRNA，按照所述方法构建RCAS-miR载体17.</li>
	<li>转化至 E. coli 以及DNA需求。</li>
	<li>建议将DNA转化至Stbl2或Stbl3感受态细胞中，这些细胞具有独特的基因型，可稳定直接重复序列和逆转录病毒序列。使用能够获得高纯度转染级质粒DNA的方法进行质粒DNA纯化。所需DNA量为5 µg，最低浓度为0.1 µg/µl。</li>
</ul>
2. 鸡成纤维细胞DF1细胞系中的病毒增殖
<ol>
	<li>进行细胞培养时必须使用带滤膜的移液吸头，以防止病毒储备液之间发生交叉污染18。</li>
	<li>将DF1细胞培养于6 cm培养皿中，使用生长培养基（含高糖DMEM、10%胎牛血清、6 mM（终浓度）L-谷氨酰胺、10 单位/ml 青霉素、10 µg/ml 链霉素），在37 oC、5% CO2条件下培养。若DF1细胞为刚从冻存状态复苏，则转染前需至少培养3天。</li>
	<li>转染前一天，将DF1细胞传代至6 cm组织培养皿中，使其在转染时达到30–50%的融合度。</li>
	<li>在组织培养超净台内，用不含血清、青霉素和链霉素的DMEM将5 µg纯病毒DNA稀释至总体积150 µl，置于微量离心管中。</li>
	<li>将30 µL Superfect直接加入已稀释的DNA管中；涡旋混合10秒；在组织培养超净台中室温静置5–10分钟，以形成转染复合物。</li>
	<li>在复合物形成期间，轻柔吸除DF1细胞培养皿中的生长培养基，并用4 ml PBS-/-小心洗涤细胞。</li>
	<li>吸取5 ml生长培养基（含血清和抗生素）；将其中4 ml转移至Falcon管中备用；将剩余的1 ml加入转染复合物中。用移液器轻轻吹打混合2次，立即把全部转染复合物转移至DF1细胞中。轻轻摇动培养皿以确保细胞层被均匀覆盖；在37oC孵育2–3小时。</li>
	<li>吸除转染混合液，用4 ml PBS-/-洗涤细胞，加入4 ml新鲜生长培养基（含血清和抗生素），将细胞放回37oC培养箱中继续培养。</li>
	<li>当细胞达到汇合状态时进行传代（可在转染后48至72小时检测瞬时表达）。</li>
	<li>继续传代培养约7天，直至所有细胞均被感染；通过PCR检测病毒DNA整合情况，并通过Western blotting检测蛋白表达水平；最后用含10% DMSO和20%胎牛血清的DMEM培养基将细胞冻存。</li>
</ol>
3. In Vivo 感染 RIP-Tag; RIP-tva 小鼠
<ol>
	<li>病毒的收集与浓缩 
	使用新鲜浓缩的病毒 体内 感染。保存在 4 的病毒滴度 o一周内C的含量未见显著降低。然而，病毒储备液的冻存等分试样在解冻后滴度下降10倍。
	<ol>
		<li>根据所需病毒的量，将病毒生产用DF1细胞扩增至15 cm培养皿中。对于 体内 小鼠感染实验中，每只小鼠准备平均一个培养皿。</li>
		<li>将转子（例如 SW28）、摆桶及超速离心机预冷至 4oC.</li>
		<li>从汇合的15 cm培养皿中收集上清液。在4 °C下以1,650 × g低速离心10分钟，去除细胞碎片oC.</li>
		<li>将病毒上清液转移至超速离心管（聚碳酸酯离心管）中，在4 °C条件下以95,400 × g离心1.5小时 oC. 对于 Beckman XL-100 超速离心机，使用加速档位：1；减速档位：1 的设置。</li>
		<li>尽可能移除超速离心管中的上清液。加入不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）-/-将病毒悬液加至超速离心管中，从一个15 cm培养皿中制备终体积为100 µl的病毒悬液。用Parafilm封口膜覆盖管口。通过在中等速度下涡旋振荡超速离心管2分钟，重悬不可见的病毒沉淀。</li>
		<li>在4℃下轻轻摇动超速离心管 o4°C 下孵育一小时至过夜。</li>
		<li>将病毒悬液转移至微量离心管中。在注射小鼠前，将病毒悬液升温至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒滴度测定 
	每种新的病毒载体构建完成后，在使用前均需测定其病毒滴度 体内 感染
	<ol>
		<li>将DF1细胞接种于12孔组织培养板的所有孔中（建议：2 × 10⁵ 细胞/孔）4 细胞/孔，1 毫升/孔），使其在感染时融合度达到30%。每项病毒滴度测定需要一个12孔板。</li>
		<li>在生长培养基中对病毒上清液进行连续10倍梯度稀释，步骤如下：
		<ol>
			<li>将5 µl病毒上清液与495 µl培养基混合，制备10⁻²稀释度2 在微量离心管中进行稀释。涡旋振荡数秒。</li>
			<li>从10中取出40 µl2 稀释至360 µl培养基中，置于微量离心管内，用于10倍稀释3 稀释。涡旋振荡数秒。</li>
			<li>按照步骤 3.2.2.2 进行 10 次4 和 105 稀释</li>
			<li>准备5个6 ml聚苯乙烯管，每管分装2.25 ml培养基，并标记为106, 107, 108, 109, 1010分别。</li>
			<li>混合 0.25 ml 来自 105 用2.25 ml培养基在6 ml聚苯乙烯管中进行稀释，用于10倍稀释6 稀释。涡旋振荡数秒。</li>
			<li>按照步骤 3.2.2.5 操作，持续 107, 108, 109，和1010 稀释</li>
			<li>从12孔板中的DF1细胞中移除原始培养基。每孔加入1 ml稀释后的病毒液，设两个重复孔（未感染组，1010 至 106 IU/ml</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让细胞生长至少 7 天（必要时进行胰酶消化）。收集细胞以提取 DNA，并按照所述方法通过 PCR 检测病毒 DNA 的存在 &#34;6. PCR 实验方案&#34;. 如果该病毒滴度为 108 每毫升感染单位（IU/ml），使用含10个细胞的DNA进行PCR检测时，将观察到398 bp的阳性产物（来自RCASBP）8 至 106 IU/ml 病毒，但不来自未感染的细胞或含有 10 的细胞10 至 109 IU/ml 病毒。滴度为 &#62;1 × 108 每毫升感染单位应被用于 体内 感染</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心内注射 
	半合子 RIP-Tag 小鼠，而非纯合子小鼠，被用于本研究。半合子 RIP-Tag 小鼠在7至12周龄时会发展出胰腺神经内分泌肿瘤，而纯合子小鼠的肿瘤潜伏期更短。由于细胞增殖是病毒cDNA整合到宿主基因组所必需的，因此使用7周龄的小鼠 RIP-Tag；RIP-tva 使用具有胰岛β细胞增生的小鼠。请注意，在成年小鼠中，大多数正常的β细胞并不发生增殖。
	<ol>
		<li>使用7周龄的 RIP-Tag；RIP-tva 用于实验的纯C57BL/C背景小鼠</li>
		<li>使用氯胺酮/赛拉嗪组合（150 mg/kg；15 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在整个麻醉过程中，使用加热装置维持小鼠体温。</li>
		<li>在双眼内涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。</li>
		<li>剃除胸部区域的毛发 RIP-Tag；RIP-tva 小鼠。将小鼠仰卧放置，胸部朝上。进行足趾夹捏以观察动物是否无反应，从而确认麻醉完全生效。</li>
		<li>伸展前肢并用胶带固定。在小鼠胸部标记注射位置，在胸骨切迹与剑突顶端之间的中点处标记，位置略偏胸骨左侧（解剖学左侧）。图2).</li>
		<li>用聚维酮碘消毒液或氯己定消毒液擦洗前胸壁，随后使用浸有70%异丙醇或70%乙醇的纱布擦拭。</li>
		<li>用无菌的28G½胰岛素注射器抽取50 µl空气，以在500 µl注射器的柱塞与液面之间形成空隙，随后吸入100 µl病毒。该气腔在管壁无液体附着的情况下，对于观察心脏搏动至关重要。</li>
		<li>保持针头垂直。一手绷紧小鼠皮肤，将针头插入标记位置。当注射器内出现鲜红色搏动性血流时，停止推进针头，并用一只手固定针头在小鼠体内的深度。</li>
		<li>用另一只手仔细且缓慢地推动针栓，在约60秒的时间内注入病毒悬液（约100 µl）。当在注射器内观察到鲜红色的血液脉冲时，立即注入10–20 µl。持续有鲜红色富氧血液进入透明的针头连接部，表明针头已正确置于左心室。</li>
		<li>在最后一次推动活塞以注入病毒悬液后，且在观察到下一次血液搏动性回流之前，迅速将针头从胸腔中拔出。</li>
		<li>在注射部位施加轻柔压力，以减少出血，持续至少1分钟。</li>
		<li>将小鼠小心地移至加热垫上或加热灯下，直至完全清醒。在麻醉作用消退期间需持续观察小鼠，直至其能够自主远离刺激物，此过程通常持续约一小时。术后每日监测小鼠被毛是否均匀完整，以及行为是否出现任何变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤的组织病理学分析
<ol>
	<li>注射后第九周，处死16周龄的RIP-Tag; RIP-tva小鼠。记录原发性胰腺肿瘤的大小和数量，以及任何肉眼可见的转移灶。</li>
	<li>将胰腺、肝脏和/或其它器官置于10%中性缓冲福尔马林中，在室温下于摇床上固定过夜。</li>
	<li>次日将固定后的组织转移至70%乙醇中。将组织处理并包埋于石蜡中，制备成切片。</li>
	<li>按照制造商说明书对突触素（神经内分泌标志物）或胰岛素（β细胞特异性标志物）进行免疫组织化学染色，以鉴定胰腺淋巴结或肝脏中胰腺β细胞的转移灶。然而，去分化的肿瘤细胞或低分化肿瘤细胞可能丧失胰岛素表达，仅能通过突触素免疫染色检测到。</li>
</ol>
5. 体外 感染表达tva的细胞
进行体外感染时，无需使用浓缩病毒。in vitro 感染可采用以下所述的两轮感染方案。如需进行更多轮次的感染，可重复执行以下方案。
<ol>
	<li>从汇合的 DF1 细胞中收集病毒上清液。将病毒上清液置于 4 oC 保存，并在一周内用于感染。感染前，将病毒上清液通过 0.45 μm 滤器过滤，以获得无细胞的病毒。</li>
	<li>用 PBS-/- 快速冲洗表达 tva 的靶细胞（例如来自 RIP-Tag; RIP-tva 小鼠的 N134 胰腺 β 细胞肿瘤细胞系），以去除含有胰蛋白酶抑制剂的血清残留。再用胰蛋白酶-EDTA 溶液（例如 0.25% 胰蛋白酶-2.21 mM EDTA）快速冲洗靶细胞。加入胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 2 分钟。轻轻敲击培养皿，于倒置显微镜下观察细胞。细胞通常在 2 至 3 分钟内脱落。将靶细胞接种至 6 cm 培养皿中，并使用 3~4 ml 过滤后的病毒上清液作为生长培养基。 
	注意：病毒上清液中的营养物质已被 DF1 细胞消耗，因此次日需更换培养基。</li>
	<li>次日，将足量的病毒上清液恢复至室温。吸除靶细胞中的培养基，并替换为 3–4 ml 病毒上清液。</li>
	<li>第三天，根据需要传代细胞。若细胞密度尚不足以传代，则将约 4 ml 常规生长培养基（含高糖 DMEM、10% 胎牛血清、6 mM（终浓度）L-谷氨酰胺、10 单位/mL 青霉素、10 µg/mL 链霉素）预热后替换病毒上清液。</li>
	<li>扩增感染后的细胞，并通过 Western 印迹法检测候选蛋白的表达19。可利用 Transwell 实验分析候选基因对细胞迁移和侵袭能力的影响。此外，还可通过尾静脉注射转移模型实验，评估这些细胞系向肝脏转移的潜能。</li>
</ol>
6. PCR 实验方案
所有溶液应尽快在冰上配制。可为大量样品预先配制不含模板的主混合液（mastermix），并分装至各PCR管中。将每种试剂所需用量乘以样品数量。在加入主混合液前，通过轻弹混匀试剂，并用移液器吸头轻轻吹打混匀。每向主混合液管中加入一种试剂后，均需用移液器反复吸打数次，以确保吸头内残留液体完全转移。
<ol>
	<li>检测感染或转染细胞中是否存在 RCASBP。 
	以下方案每份样品需要 11.5 µL 混合液和 1 µL 基因组 DNA。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
	<ol>
		<li>配制混合液：7.68 µL 无核酸酶水、0.75 µL DMSO、1.25 µL AmpliTaq DNA 聚合酶 10x 缓冲液 II、1.375 µL 25 mM MgCl2 和 0.125 µL 25 mM dNTP。</li>
		<li>向混合液中加入 0.125 µL 100 µM 正向引物 RCAS5626F（5'-ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3'）和 0.125 µL 100 µM 反向引物 RCAS6023R（5'-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3'）。</li>
		<li>向混合液中加入 0.075 µL AmpliTaq DNA 聚合酶。</li>
		<li>用手指轻弹管壁混匀混合液，短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。</li>
		<li>从混合液中分装 11.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。</li>
		<li>轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 1 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如下：
		<ol>
			<li>用 200 µL 0.05 M NaOH 裂解细胞沉淀，反复吹打以充分溶解沉淀。</li>
			<li>将细胞裂解液在 PCR 仪中 98 °C 加热 20 分钟，随后冷却至 25 °C。</li>
			<li>向管中加入 20 µL 1.0 M Tris-HCl（pH 7.5），并将 DNA 样品置于 4°C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>轻弹混匀样品，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。</li>
		<li>PCR 程序设定为：92 °C 预变性 2 分钟；随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、67 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。</li>
		<li>PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x DNA 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。</li>
		<li>PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，其扩增产物大小为 398 bp。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tag 基因分型。 
	以下方案每份样品需要 10.5 µL 混合液和 2 µL 基因组 DNA。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
	<ol>
		<li>配制混合液：4.5 µL 无核酸酶水和 4.00 µL MyTaq DNA 聚合酶 5x MyTaq 反应缓冲液。</li>
		<li>向混合液中加入 0.4 µL 100 µM 正向引物 TagF2（5'-GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3'）和 0.4 µL 100 µM 反向引物 TagR2（5'-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3'）。</li>
		<li>向混合液中加入 0.8 µL 10 µM β-2-微球蛋白前体（B2m）引物混合物作为内参对照。B2m 内参对照的 PCR 引物为 B2 F（5'-CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3'）和 B2 R（5'-TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3'）。</li>
		<li>向混合液中加入 0.4 µL MyTaq DNA 聚合酶。</li>
		<li>用手指轻弹管壁混匀混合液，离心机短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。</li>
		<li>从混合液中分装 10.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。</li>
		<li>轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 2 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如上所述。</li>
		<li>轻弹混匀溶液，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。</li>
		<li>PCR 程序设定为：95 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒、65 °C 退火 15 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。</li>
		<li>PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。</li>
		<li>PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，Tag 和 B2m 的 PCR 产物大小分别为约 450 bp 和 300 bp。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>tva 基因分型。 
	以下方案每份样品需要 10.5 µL 试剂混合液。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
	<ol>
		<li>配制混合液：5.6 µL 无核酸酶水、0.5 µL DMSO、1.25 µL AmpliTaq DNA 聚合酶 10x 缓冲液 II、1.375 µL 25 mM MgCl2 和 0.125 µL 25 mM dNTP。</li>
		<li>向混合液中加入 0.125 µL 100 µM tva-3（5'-GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC-3'）和 0.125 µL 100 µM tva-5（5'-CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3'）。</li>
		<li>向混合液中加入 1.275 µL 10 µM B2m 引物混合物作为内参对照。</li>
		<li>向混合液中加入 0.125 µL AmpliTaq DNA 聚合酶。</li>
		<li>用手指轻弹管壁混匀混合液，离心机短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。</li>
		<li>从混合液中分装 10.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。</li>
		<li>轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 2 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如上所述。</li>
		<li>轻弹混匀溶液，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。</li>
		<li>PCR 程序设定为：92 °C 预变性 2 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。</li>
		<li>PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。</li>
		<li>PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，tva 和 B2m 的 PCR 产物大小分别为 500 bp 和 300 bp。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multistep+nature+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The multistep nature of cancer.</a> Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).</li>
<li>Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in cancer research.</a> Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS biology. 5 (10), e276(2007).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+formation+of+pancreatic+beta-cell+tumours+in+transgenic+mice+expressing+recombinant+insulin%2Fsimian+virus+40+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes.</a> Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).</li>
<li>Fisher, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+flexible+and+specific+gene+delivery+system+for+production+of+murine+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models.</a> Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).</li>
<li>Orsulic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RCAS-TVA-based+approach+to+designer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models.</a> Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).</li>
<li>Tuveson, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+medicine%3A+Cancer+lessons+from+mice+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans.</a> Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+promotes+metastasis+independent+of+its+anti-apoptotic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity.</a> Nat Commun. 7, 10384(2016).</li>
<li>Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+fall+of+apoptosis+during+multistage+tumorigenesis%3A+down-modulation+contributes+to+tumor+progression+from+angiogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors.</a> Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).</li>
<li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li>
<li>Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+in+vivo+expression+of+a+muscle-specific+promoter+by+using+avian+retroviral+vectors+for+gene+transfer+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected].</a> J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).</li>
<li>Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-directed+gene+transfer+demonstrates+Wnt1+role+in+melanocyte+expansion+and+differentiation+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).</li>
<li>Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+RCAS+vectors+useful+for+functional+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses.</a> DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).</li>
<li>Bromberg-White, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNA+sequences+by+using+a+replication-competent+avian+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector.</a> J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).</li>
<li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-RNAi%3A+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).</li>
<li>Huse, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PTEN-regulating+microRNA+miR-26a+is+amplified+in+high-grade+glioma+and+facilitates+gliomagenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo.</a> Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).</li>
<li>Ahronian, L. G., Lewis, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+RCAS+virus+from+DF1+chicken+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).</li>
<li>Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+hyaluronan-mediated+motility+isoform+B+promotes+liver+metastasis+in+a+mouse+model+of+multistep+tumorigenesis+and+a+tail+vein+assay+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).</li>
<li>Guernet, A., Grumolato, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+editing+of+the+genome+for+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling.</a> Methods. , (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们描述了一种强大的小鼠模型RIP-Tag; RIP-tva，该模型可通过禽类逆转录病毒实现体细胞基因递送，用于鉴定和表征转移性因子。尽管RIP-Tag; RIP-tva小鼠会发展出胰腺神经内分泌肿瘤，但在此小鼠模型中鉴定出的转移性因子也可能促进其他类型癌症的转移。
我们的方法能够以时间可控的方式将体细胞遗传改变特异性地引入胰腺β细胞的癌前病变中，从而更真实地模拟人类散发性肿瘤的发生过程。该方法避免了传统转基因模型中因目的基因在发育过程中异位表达而对正常组织形成造成的潜在干扰。此外，与制备转基因小鼠相比，构建携带目的基因的禽类逆转录病毒载体更为快速。由RCASBP衍生的禽类逆转录病毒载体可将cDNA（≤2.5 kb）、shRNA、miRNA及其他非编码RNA递送至表达tva的细胞中 体外 和 体内感染效率（以及多重感染效率）取决于靶细胞的增殖速率和细胞的可及性。滴度为 &#62;1 × 108 每毫升感染单位是必需的 体内 感染。可实现更高效的病毒递送 <em...

大多数癌症源于体细胞突变1。传统的基因工程小鼠模型（GEMM）在揭示特定遗传改变对肿瘤发生的作用方面提供了重要见解2。然而，这些模型存在若干局限性。此类模型的主要缺点在于无法模拟人类肿瘤形成的散发性特征，即仅组织中的部分细胞获得遗传改变。此外，转基因和基因敲除小鼠的突变属于生殖系突变，可能影响发育过程。而且，构建这些小鼠模型的成本高昂且耗时较长。
转移是癌症领域中的一个重要问题。在基因工程小鼠模型（GEMM）中建立转移模型一直较为困难。在小鼠中，自发性转移极为罕见。GEMM转移模型的外显率具有变异性，且潜伏期较长3。实验性转移模型通过将细胞直接注射到小鼠循环系统中，从而绕过了转移级联反应的早期步骤。
为了克服上述在小鼠模型中研究转移因子的一些局限性，我们开发了一种双转基因小鼠模型 RIP-Tag; RIP-tva4。该策略基于将高度同步的肿瘤进展小鼠模型 RIP-Tag 5 与A亚群禽白血病病毒受体 tva 6,7 相结合。RIP-Tag; RIP-tva 小鼠模型允许将基因以体细胞方式导入单一的双转基因小鼠品系中。SV40 T抗原可抑制Rb和p53的肿瘤抑制功能，小鼠由此发生胰腺神经内分泌肿瘤，其发生过程与人类肿瘤发生相似，包含增生、血管生成、腺瘤及侵袭性癌等阶段。该 RIP-Tag 模型极大地促进了我们对癌症特征的理解，其应用不仅限于胰腺神经内分泌肿瘤，还已被用于临床前试验 8。
我们介绍了一种通过心内注射禽类逆转录病毒至RIP-Tag; RIP-tva小鼠体内实现体细胞基因转移的实验方案。使用RCASBP衍生的禽类逆转录病毒成功感染靶细胞的前提是靶细胞处于活跃增殖状态。因此，我们选择7周龄的RIP-Tag; RIP-tva小鼠进行实验，此时约50%的胰岛已出现增生。为达到10–20%的感染效率，需向左心室进行高滴度病毒的心内注射4。该递送方式可减少病毒颗粒在到达胰岛前因血液循环而造成的显著稀释。
利用这一方法，我们先前已证明Bcl-xL可促进癌症转移，且该作用独立于其抗凋亡功能4,9。在RIP-Tag; RIP-Bcl-xL小鼠模型中，当Bcl-xL在整个肿瘤发生过程中于所有胰腺β细胞中通过转基因表达时，并未观察到这种不依赖抗凋亡作用的转移功能10。因此，我们的小鼠模型为研究在肿瘤发生后期阶段表达的基因功能提供了独特的机会。由于在未感染病毒的RIP-Tag; RIP-tva双转基因小鼠中，仅有2%-4%的胰岛会发展为肿瘤，且并非所有癌前病变均被RCASBP来源的禽类逆转录病毒感染，因此只有那些相较于肿瘤自然进程具有选择性优势的因子才能被鉴定出来。特别是转移相关因子最容易通过该方法被识别，因为在RIP-Tag; RIP-tva小鼠中通常不会发生向胰腺淋巴结或其他器官的转移。

<table><tbody><tr><td>RCASBP-Y DV 质粒</td><td>Addgene</td><td>11478</td><td></td></tr><tr><td>RCAS-RNAi 质粒</td><td>Addgene</td><td>15182</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，100倍浓度</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓度</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS&lt;sup&gt;-/-&lt;/sup&gt;，1倍浓度</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Superfect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>聚烯烃离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm Nalgene&lt;br/&gt; 带PES膜的注射器滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>突触素（synaptophysin）</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-S284</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（辣根过氧化物酶，兔IgG）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101</td><td></td></tr><tr><td>含Buffer II的AmpliTaq DNA聚合酶</td><td>Life Technologies</td><td>N8080153</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21106</td><td></td></tr></tbody></table>

通过基因转移在新型rip-tag; rip-tva小鼠模型中鉴定和表征转移因子

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

转移性癌症导致了90%的实体瘤患者死亡。迫切需要更深入地了解癌症转移的驱动因素，并确定新的治疗靶点。为了研究从原发性癌症进展为转移性癌症过程中的分子事件，我们开发了一种双转基因小鼠模型RIP-Tag; RIP-tva。在此小鼠模型中，大鼠胰岛素启动子（RIP）驱动SV40 T抗原（Tag）以及A亚群禽类白血病病毒受体（tva）在胰腺β细胞中的表达。这些小鼠会以100%的外显率发展出胰腺神经内分泌肿瘤，其发生过程经历明确的阶段，类似于人类肿瘤的发生过程，包括增生、血管生成、腺瘤和侵袭性癌等阶段。由于RIP-Tag; RIP-tva小鼠不会自发产生转移性疾病，因此可以方便地识别促进转移的遗传改变。通过心内注射携带目标遗传改变的禽类逆转录病毒，可实现对表达tva的、正在增殖的胰腺β细胞癌前病变进行体细胞基因转移。每毫升感染单位数超过&#62;1 × 108的病毒滴度被认为适合用于体内感染。此外，禽类逆转录病毒能够高效感染从RIP-Tag; RIP-tva小鼠肿瘤中建立的细胞系。这些细胞系也可用于鉴定和表征促转移因子。本文将演示如何利用该小鼠模型及细胞系来评估候选基因在肿瘤转移中的功能。

体内和体外条件下，基于RCASBP的病毒对RIP-Tag; RIP-tva肿瘤细胞的感染率分别约为20%和80%20。在RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中，每只小鼠约400个胰岛中约有4%会自然发展为肿瘤20，因此每只小鼠体内均存在足够数量的肿瘤细胞，可用于对病毒递送基因潜在效应进行组织学和表型分析。利用该系统，研究人员发现Bcl-xL在转移过程中具有新的核功能9。与感染对照病毒RCASBP-ALPP的小鼠相比，感染RCASBP-Bcl-xL的RIP-Tag; RIP-tva小鼠出现侵袭性癌的比例更高（96% vs. 74%）。此外，在16周龄实施安乐死时，47%感染RCASBP-Bcl-xL的RIP-Tag; RIP-tva小鼠在胰腺淋巴结中出现转移灶（<str...

我们提出了一种利用RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型展示新型体细胞基因转移系统的研究方案，用于分析基因在转移过程中的功能。通过心内注射将禽类逆转录病毒递送至成年小鼠体内，以确保将基因导入胰腺β细胞的癌前非侵袭性病灶中。

通过基因转移在新型RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中鉴定和表征转移因子

转移性癌症导致了90%的实体瘤患者死亡。迫切需要更深入地理解癌症转移的驱动因素……

本实验的总体目标是通过将基因转移至新型RIP-Tag;RIP-tva小鼠模型中，识别并表征转移性因子。该方法有助于回答癌症转移领域中的关键问题，例如鉴定驱动因子及新型治疗靶点。该癌症小鼠模型的主要优势在于可通过体细胞基因转移技术，对胰腺β细胞前体病灶中的转移性因子进行鉴定。每只待感染的小鼠，首先收集一个 15 厘米培养皿中产生病毒的 DF1 细胞。首先，收集汇合的 15 厘米培养皿中的培养基。然后，在预冷的离心机中以 1650 × g 离心 10 分钟，4 °C，以去除细胞碎片。接下来，将病毒上清液转移至聚烯烃超速离心管中。在超速离心机中以 9540 ×g 离心 1.5 小时，温度为 4 °C。尽可能吸除超速离心管中的上清液。然后向超速离心管中加入 PBS，使每 15 厘米培养皿获得最终体积为 100 微升的病毒悬液。用实验室封口膜封住管口，于中等速度下涡旋振荡两分钟，以重悬不可见的病毒沉淀。随后将超速离心管置于 4 摄氏度摇床上轻摇一小时或过夜。孵育结束后，将病毒悬液转移至微量离心管中，并进行病毒滴度测定。开始滴定操作前，需确保接种于12孔组织培养板中的DF1细胞已达到30%融合度。每次病毒滴度测定需要一个12孔板。首先，在微量离心管中将5微升病毒上清液与495微升培养基混合，配制10²倍稀释液，进行10倍系列稀释。短暂涡旋振荡数秒钟。然后，将10²倍稀释液中的40微升转移至另一微量离心管中，与360微升培养基混合，得到10³倍稀释液。涡旋振荡数秒。继续此步骤，将样品稀释至10⁴和10⁵倍。随后，将2.25毫升培养基分装至五个6毫升聚苯乙烯管中，每管2.25毫升。分别标记为10的6次方、10的7次方、10的8次方、10的9次方和10的10次方。取0.25毫升10的5次方稀释液，加入2.25毫升培养基，置于6毫升聚苯乙烯管中，配制10的6次方稀释液。短暂涡旋振荡数秒钟。对10的7次方、10的8次方、10的9次方和10的10次方稀释度重复上述操作。随后，从12孔板中的DF1细胞中移除原始培养基，并将1毫升稀释后的病毒以每个稀释度设两个复孔的方式加入各孔中。将细胞置于37摄氏度、5% CO2条件下培养至少七天。开始感染程序前，先对一只七周龄的RIP-Tag RIP-tva小鼠进行麻醉，并在双眼涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。将RIP-Tag RIP-tva小鼠胸部区域的毛发剃除，将小鼠仰卧置于吸水实验台纸上，纸下垫有Snuggle Safe加热垫。轻捏足趾以检查动物是否无反应，确认已达到完全麻醉状态。将前肢伸展并用胶带固定。标记小鼠胸部以进行注射。在胸骨切迹与剑突顶端之间的中点处标记，并在解剖位置上略偏左于胸骨。然后使用聚维酮碘溶液或氯己定溶液擦拭前胸壁，再用70%异丙醇或70%乙醇浸湿的纱布擦拭。用无菌的28.5号胰岛素注射器抽取50微升空气，以在500微升注射器的推杆与液面之间形成空隙。吸取100微升病毒。管壁无液体的空气空间对于观察心搏脉动至关重要。保持针头垂直，一手绷紧小鼠皮肤，将针头插入标记位置。当注射器内出现鲜红色搏动性回血时，停止推进针头，并用同一只手固定针头在小鼠体内的深度。另一只手缓慢而轻柔地推动针栓，使病毒悬液在约60秒内完成注射。每当注射器中出现鲜红色血流脉冲时，即刻注入10–20微升。鲜红色含氧血液持续进入透明针座，表明针头已正确置于左心室。在最后一次推动活塞注入病毒悬液后，且尚未见到下一次鲜红色血流脉冲前，迅速将针头退出胸腔。在注射部位施加轻柔压力至少一分钟，以减少出血。然后小心将小鼠转移至加热垫上或置于加热灯下，直至其完全清醒。RIP-Tag RIP-tva 小鼠在7周龄时感染指定的 RCASBP-Bcl-xL 逆转录病毒，并于16周龄时实施安乐死。该照片显示了胰腺淋巴结中转移性胰腺神经内分泌肿瘤的典型突触素染色结果。在此，RIP-Tag RIP-tva 小鼠被接种了指定的 RCASBP-RHAM B 病毒。该照片展示了胰腺淋巴结中转移性胰腺神经内分泌肿瘤的典型突触素染色。此处可见在注射 RCASBP-RHAMM B 病毒后，肝脏中出现突触素染色。必须牢记，对于RIP-Tag RIP-tva小鼠体内增殖的TVA细胞感染，需要达到每毫升超过10的8次方个感染单位的滴度，且RCASBP逆转录病毒载体最多可递送长达2.5千碱基的cDNA。该小鼠模型建立后，推动了一项范式转变的重要发现：BCL-xL实际上能够独立于其抗凋亡功能促进癌症转移。

identification-characterization-metastatic-factors-gene-transfer-into

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

转移因子的鉴定和表征转移到新的RIP 标签;tva小鼠模型

本视频介绍了将逆转录病毒通过心内注射导入转基因小鼠，以实现基因向增殖性胰腺β细胞癌前病变转移的实验方案。该方法还有助于评估候选基因在肿瘤转移中的功能。...

心脏内注射病毒载体：一种在小鼠模型中通过心脏内注射病毒载体研究胰腺转移的技术

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。...

通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

我们描述了一种相对简单的方法 离体...

ex vivo 肺转移及其微环境的活体成像

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

目前尚缺乏用于评估靶向乳腺癌转移的辅助治疗的临床前模型。为解决这一问题，我们建立了一种de...

De Novo 乳腺癌转移的临床前小鼠模型的外科手术操作与方法学

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

我们详细描述了一种具有临床相关性的结直肠癌肝转移（CRLM）肿瘤模型，以及肝脏缺血再灌注（I/R）对肿瘤生长和转移的影响。该模型有助于更好地理解手术促进肝转移性生长的潜在机制。...

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。...

联合使用尾静脉转移实验与活体实时成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及负荷

静脉注射癌细胞常用于转移性研究，但转移性肿瘤负荷的分析往往较为困难。本文中，我们展示了一种通过尾静脉注射建立转移模型的方法，并介绍了一种分析由此产生的肺转移性肿瘤负荷的新方法。...

肿瘤细胞侧尾静脉注射后肺转移的病理学分析

这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。...

利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

本文描述了一套用于检测黑色素瘤转移新型候选介质及其作用机制的技术流程。...

一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

了解利用RIP-Tag;RIP-tva小鼠模型进行体细胞基因转移以研究癌症转移的方法。该技术通过心内注射禽类逆转录病毒靶向胰腺β细胞前病变，帮助识别转移因子和潜在治疗靶点。

通过基因转移在新型RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中鉴定和表征转移因子

探索更多视频