Name: 果蝇岛试验中运动行为的高通量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习果蝇岛试验的高通量运动行为分析方法，利用自动化图像处理技术对Drosophila melanogaster进行客观量化评估。该方法适用于大规模遗传筛选和药物测试研究。

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我们感谢维也纳 黑腹果蝇 资源中心与布卢明顿 果蝇 NIH P40OD018537 资源中心提供 果蝇 菌株。我们感谢Klämbt实验室向我们介绍岛式实验，感谢Martijn Eidhof搭建岛式实验装置。本研究部分得到了E-RARE-3联合跨国资助项目的支持 &#34;常染色体隐性共济失调的治疗准备&#34; 由荷兰科学研究组织（NWO 9003037604）的PREPARE项目、荷兰科学研究组织（NWO）的TOP资助项目（912-12-109）以及两份DCN/拉德堡德大学医学中心博士奖学金资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定及稿件撰写过程中均未发挥作用。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 定量评估的宏 果蝇 岛屿实验中的运动行为。该宏程序可随时间自动准确计数平台上的果蝇，使岛屿实验具有高度敏感性，适用于运动缺陷的定量高通量评估。该方法可用于比较不同遗传和/或环境条件下培养的果蝇（包括药物暴露条件）的各种实验情况。因此，该检测方法在进行大规模遗传学或药物筛选研究时尤为有用。 果蝇 运动障碍及其他神经系统疾病的模型，或在研究运动或飞行行为时。
本文所介绍的孤岛实验方案相较于现有或替代方法具有多项优势。例如，视频追踪运动行为的方法耗时更长，且不适合大样本量的检测。孤岛实验是一种高通量筛选工具，从这一角度而言，其与快速互动负向趋地性（RING）实验具有可比性16。两者的区别在于，孤岛实验能够检测更广泛的运动功能障碍；果蝇无法离开平台的现象可能由飞行、跳跃或行走行为的缺陷引起，而这些缺陷可源于翅膀（肌肉/神经）和/或腿部（肌肉/神经）的功能异常。相比之下，RING实验仅用于评估由腿部（肌肉/神经）缺陷导致的攀爬或行走行为障碍。如果研究者希望获取多种行为表型读数，孤岛实验也可轻松与其他实验方法（如RING实验）联合使用。此外，用于光遗传学研究的激光装置可方便地安装在孤岛实验箱内，且该装置结构简单，易于转移至可精确控制温度与光照条件的实验环境中。
为确保本文所述岛屿实验的成功与可重复性，应遵循若干建议。至少在实验前一天，将果蝇分装并转移至实验用小瓶中，以避免CO₂麻醉对实验结果的影响。2 或低温麻醉。实验小瓶中不可放入过多果蝇（每瓶10–15只果蝇为宜；最好始终保证每瓶果蝇数量一致）。始终将果蝇饲养在新鲜培养基上。若尚未熟练掌握实验操作，可预先练习将果蝇抛掷到平台上的动作，以提高成功率。同时需练习在投掷后迅速将手移开，因为手部滞留会影响后续数据分析（图像分析和果蝇计数仅在手离开画面后才开始）。在需要相互比较的实验中，应保持环境条件和实验条件完全一致（例如， 对照组与突变体，或不同年龄测试的基因型）。实验应在每天的同一时间进行，并将试管置于温度和湿度受控的条件下。为保证统计功效，每个生物学重复至少进行三次技术重复。
为确保此处所述宏的顺利运行，必须调整网络摄像头和图像设置以实现最大对比度：果蝇在白色平台上呈现为黑色物体。当宏未能正确计数果蝇数量时，应调整对比度设置，检查感兴趣区域（ROI）是否正确选择，并确保平台上果蝇的大小超过指定的最小果蝇尺寸设置（参见本实验方案的第8.3步）。这些设置仅需定义一次，只要网络摄像头与平台之间的距离保持不变，即可适用于所有实验。Circularity_min 和 max 设置用于定义参与分析的颗粒（颗粒 = 被计数的果蝇）的圆形度（果蝇 = 被计数的对象）。1 代表完美的圆形，0 代表一条直线17。由于果蝇始终具有一定程度的圆形度（果蝇不可能呈现为一条直线），因此将 &#34;Circularity_max&#34; 设置为 1，&#34;Circularity_min&#34; 设置为 0.4。用户通常无需调整这些设置。
当果蝇位于平台边缘附近时，该宏偶尔会在计数时出现错误。如果果蝇无法飞行，而是在用户定义的感兴趣区域（ROI）内来回爬行，就可能发生这种情况。大多数情况下，重新选择ROI（尽可能将其与平台贴合）即可轻松解决此问题。然而， &#34;岛屿实验分析&#34; 该脚本能够较好地检测并校正果蝇进出感兴趣区域（ROI）所导致的不正确数据计数。尽管此处使用的网络摄像头分辨率已足够高，能较清晰地区分位置相近的果蝇，我们仍在图像处理流程中引入了额外的算法 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 宏，例如分水岭和侵蚀函数17这些有助于准确区分停留在平台上的、彼此靠近的果蝇。 此外，该宏程序无法区分果蝇是从平台跳下还是飞离平台。然而，通常观察到健康年轻的果蝇品系被放置在平台时会立即飞走，而年老的果蝇或具有运动缺陷的果蝇则会在平台上停留较长时间，最终跳跃或跌落离开平台。尽管存在这些局限性，该实验方法及分析仍能非常准确地测量果蝇的运动行为。
为确保实验顺利进行 &#34;岛屿实验分析&#34; 脚本中，用户必须确保在方案指定的脚本行中输入正确的输入和输出文件路径，并按照指定的文件夹格式提供数据（如方案中所示）。 图2）。如果用户认为用于过滤不可靠实验数据的标准过于严格（第68行：第一个值 &#34;计数&#34; 列小于或等于5；第71行：该行第一个值 &#34;计数&#34; 柱中的数值高于平台上投放的果蝇总数+3），则通过在第68行和第71行的文本前添加#号来关闭这些筛选设置 &#34;岛屿实验分析&#34; 脚本。在这种情况下，所有数据集都将被纳入分析。或者，可根据用户需求调整第68行和第71行中的数值来更改筛选设置。计数值中可能存在的异常信号 &#34;results.txt&#34; 由生成的 &#34;黑腹果蝇 岛屿实验&#34; 宏也可以手动调整，并且可以对调整后的数据重新运行脚本。当用户希望处理超过10 fps或超过10秒的数据时，所处理的帧数将由 &#34;岛屿实验分析&#34; 脚本应进行调整。统计分析也可由用户自定义的替代方法替换。
在以下网站可以找到一个名为 &#34;Examples Island Assay,&#34; 的文件夹，其中包含使用岛屿实验（island assay）获得的图像时间序列示例：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。请下载“Examples Island Assay”文件夹，并按照本方案中描述的步骤操作，以快速熟悉文件存储结构、使用“Drosophila Island assay”宏处理图像，以及运行“Island Assay Analysis”脚本的方法。
岛状实验结合所开发的宏程序与分析脚本，可用于评估并量化某种生物异常的运动行为 果蝇 共济失调-毛细血管扩张症模型。由于该检测方法可高效应用于不同年龄阶段，因此非常适用于分析表型可能存在的进行性发展特征。
总之，岛状培养实验与 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 宏观与微观 &#34;岛屿实验分析&#34; 脚本是一种经济、可靠且高效的检测方法，可客观分析和量化运动缺陷 果蝇 以高通量方式建立运动障碍模型。

近年来，下一代测序技术的进步极大地推动了对脑部变性运动障碍（例如，小脑性共济失调和帕金森病）、周围神经源性障碍（例如，肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫）以及肌肉源性障碍（例如，杜氏肌营养不良症和强直性肌营养不良症）相关致病基因的鉴定1,2,3,4。尽管如此，目前对这些疾病大多数背后的分子机制仍知之甚少。深入理解这些机制对于开发有效疗法至关重要。
与人类相似，模式生物的运动，例如飞行和移动， 果蝇由中枢脑、外周神经系统和肌肉控制。此外，其快速的世代周期和遗传工具箱 果蝇 使该模式生物特别适用于与运动障碍相关基因的高通量筛选以及药物测试5,6由于此类筛选需要测试大量条件，因此非常需要可靠、经济且相对简单的检测方法，以及能够以自动化方式量化输出结果的工具。
施密特 等 (2012)7 描述了一种名为低成本检测方法 &#34;岛状实验&#34; 用于评估 黑腹果蝇 运动行为。岛式实验已成功应用于大规模筛选，以鉴定具有胶质细胞特异性功能的基因7，在评估中 果蝇 智力障碍模型8以及对果蝇运动行为的总体评估9岛式行为检测的基本设计包括一个升高的平台，将数只果蝇投掷到该平台上。这会诱发一种本能的运动行为，使健康的果蝇在数秒内逃离平台。该检测通过测量随时间推移仍停留在平台上的果蝇数量来评估其运动能力。7,8,9所有这些特征表明，岛式实验可能是筛选与运动障碍相关基因的一种有力工具。
目前，拍摄的岛状细胞迁移实验数据的定量分析仍通过人工完成7,8,9为了提高实验的效率，开发了一种低成本方法，用于半自动量化果蝇从平台上的逃逸行为。该装置通过连接至笔记本电脑的普通网络摄像头采集平台的图像时间序列，每0.1秒获取一帧图像。随后，利用软件对图像帧进行处理， &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 用于随时间量化平台上果蝇数量的宏。 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 宏被分为三个独立的子宏：（I） &#34;创建图像堆栈与投影，&#34; sub-macro 可识别存储在不同子文件夹中的各个岛屿实验，并为每个时间序列创建图像堆栈和投影。（II）该 &#34;定义平台&#34; 子宏将依次打开所有 &#34;投影图像名称.tif&#34; 位于各个实验子文件夹中的文件，此时要求用户手动将岛状平台定义为感兴趣区域（ROI）。(III) &#34;分析&#34; 自动量化在时间序列过程中停留在平台上的果蝇数量。子宏程序可连续运行（一次运行中）或独立运行。为进行统计数据分析，已开发一个脚本以自动处理所获得的数据，并应用统计检验来确定不同处理/基因型之间的行为是否存在显著差异。&#160;彼此之间（图1最后，证明该装置可用于评估和量化一种异常运动能力 果蝇 共济失调-毛细血管扩张症（AT）模型。

<table><tbody><tr><td>25 x 95 mm&lt;span class=&quot;font14&quot;&gt; &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt; 小瓶&lt;/span&gt;</td><td>Flystuff</td><td>32-116SB</td><td>-</td></tr><tr><td>罗技 C525 高清网络摄像头</td><td>罗技</td><td>-</td><td>任何具有 USB 连接的网络摄像头均适用。</td></tr><tr><td>用于固定网络摄像头的支架</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>台灯</td><td>-</td><td>-</td><td>12 V LED 灯合适</td></tr><tr><td>击打垫</td><td>-</td><td>-</td><td>任何鼠标垫均可使用</td></tr><tr><td>岛屿实验箱</td><td>-</td><td>-</td><td>尺寸 40x35x2.5 cm。孔洞 20x30 cm。透明。</td></tr><tr><td>岛式实验浴槽</td><td>-</td><td>-</td><td>尺寸 42x38x25 厘米。非白色。</td></tr><tr><td>岛屿/平台</td><td>-</td><td>-</td><td>尺寸 42x38x25 厘米。均匀白色。</td></tr><tr><td>肥皂</td><td>-</td><td>-</td><td>标准洗碗洗涤剂即可适用。</td></tr><tr><td>计算机</td><td>-</td><td>-</td><td>脚本可在 Windows 和 Mac 系统上运行</td></tr><tr><td>图像录制软件：HandiAvi&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;</td><td>&lt;em&gt;AZcendant&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>-</td><td>HandyAvi 仅兼容 Windows 系统，本文中已对此软件进行了详细描述。可从以下网址下载：http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html（版本 5.0）</td></tr><tr><td>图像记录软件：WebcamCapture</td><td>-</td><td>-</td><td>可用于 Mac 系统以替代 HandyAvi 进行图像记录的 Fiji/ImageJ 插件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/。使用该方法时，用户须采用本文所述的相同文件夹结构和图像记录设置，唯一例外是：对于每个实验重复，所捕获的图像堆栈应作为 Stack.tiff 导出至相应的实验重复文件夹中。运行 &quot;&lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font14&quot;&gt;果蝇&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;&lt;span class=&quot;font5&quot;&gt; 岛屿实验&quot; 此数据的宏中，不应包含任何文本 &quot;首帧标识符&quot; 设置。&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>-</td><td>-</td><td>版本 1.4 或更高版本，可从以下网址下载：https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td></tr><tr><td>R studio</td><td>-</td><td>-</td><td>可从以下网址下载：https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr><tr><td>R</td><td>-</td><td>-</td><td>版本 3.3.2，可从以下网址下载：https://cran.rstudio.com</td></tr></tbody></table>

高通量分析运动行为的 果蝇 岛屿实验

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

下一代测序技术的进步正以日益加快的速度推动着运动障碍及其他神经系统疾病（候选）致病基因的鉴定。然而，目前对这些疾病所涉及的分子机制仍知之甚少。遗传学、分子生物学和行为学研究工具箱的 黑腹果蝇 使该模式生物在高通量水平上鉴定新致病基因和疾病机制方面具有重要价值。然而，高通量筛选需要高效且可靠的检测方法，理想情况下应具备成本效益，并能够实现与这些疾病相关表型的自动化定量分析。岛屿实验是一种成本低、易于建立的方法，可用于评估 果蝇 运动行为。在该实验中，果蝇从固定高度被抛掷到一个平台上。这会引发果蝇的先天运动反应，使其在数秒内逃离平台。目前，对拍摄的岛屿实验进行定量分析主要依赖人工完成，这一过程费时费力，尤其在进行大规模筛选时尤为如此。
本文描述了 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 和 &#34;岛屿实验分析&#34; 算法用于&#160;高通量、自动化的岛状结构实验数据处理与定量分析。在该系统中，一台简单的网络摄像头连接至笔记本电脑，在实验进行过程中持续采集平台的图像序列。 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 为开源软件 Fiji 开发的算法可处理这些图像序列，并针对每种实验条件，量化随时间变化停留在平台上的果蝇数量。 &#34;岛屿实验分析&#34; 一种与免费软件 R 兼容的脚本被开发用于自动处理所获得的数据，并计算不同处理/基因型之间是否存在统计学差异。这显著提高了岛式实验的效率，使其成为检测果蝇基本运动和飞行行为的有力指标。因此，该方法可应用于大规模筛选果蝇运动能力的研究。 果蝇 运动障碍模型及药物疗效评估

在本方案中，Drosophila 岛实验数据的获取与处理分为三个步骤。首先，将 Drosophila 投放到岛状平台后，使用网络摄像头记录其飞行逃避反应，并以单个 .bmp 图像文件形式存储（方案第 1–7 节）。其次，“Drosophila 岛实验”宏（第 8 步）处理这些图像帧，生成一个“result.txt”文本文件 (表 1)，其中汇总了每帧中检测到的物体数量，同时生成一个图像堆栈“Result_stack.tiff”，显示每帧中在平台区域内检测到的物体。第三，“岛实验分析”脚本（方案第 9 节）处理存储在各个实验“results.txt”文件中的宏输出数据。该脚本包含多个步骤，用于对数据进行筛选和整合，以进行统计分析。脚本会识别出果蝇被投放到平台上的第一帧，并将其定义为时间点 1；早于该帧的所有帧将从数据集中剔除。随后选取时间点 1 之后的 100 帧（对应 10 秒）用于分析。若检测到平台上初始果蝇数量少于 5 只，则该实验自动被排除，以剔除因样本量不足而导致结果不可靠的实验。若检测到的初始果蝇数量超过设定的“每管果蝇数量”加 3 只的容差范围，该实验也将被排除，以消除因将噪声颗粒误识别为果蝇而造成的误差。接着，脚本计算每个时间点检测到的果蝇数量占该序列中最大检测数量的百分比。对于因果蝇进出感兴趣区域（ROI）导致的数据错误（表现为平台上的果蝇百分比先下降后上升），脚本会将其修正为在早期阶段始终存在于平台上的状态。所有属于特定实验条件的重复数据集将在主目录中被合并，并导出至“data_all_conditions.csv”文件，其列对应 表 2 中描述的变量。脚本还将为每个实验条件生成一条折线图，图名根据包含数据的文件夹命名。该图显示相应文件夹中各实验重复组在时间进程中停留在平台上的果蝇百分比（即飞行逃避反应）(图 3A-B)。各实验条件的均值、标准差（SD）和标准误（SEM）将被计算并汇总至“Statistics summary.csv”文件中。一张名为“Escape_response_all_conditions.tiff”的折线图展示了主文件夹中最多 12 个实验条件的平均飞行逃避反应 (图 3C)。最后，计算主文件夹中所有实验条件的曲线下面积（AUC），并汇总至“AUC.csv”文件中。根据主文件夹中实验条件的数量，脚本将执行双尾非配对 Welch t 检验（2 个条件）或带 Tukey 多重检验校正的方差分析（ANOVA）（超过 2 个条件），以判断不同实验条件之间是否存在显著差异。这些结果分别汇总在“Welch_t-test_results.txt”或“AUC_anova_results.txt”文件中。执行方差分析时，脚本还会导出一个“AUC_anova.tiff”文件，展示被比较实验条件之间的平均 AUC 差异及其 95% 置信区间。所有实验条件下各实验重复组的绝对曲线下面积值将以单个数据点形式展示，并在“AUC.tiff”图中标出中位数 图 3D。
共济失调毛细血管扩张症（Ataxia Telangiectasia, AT）是一种常染色体隐性遗传运动障碍，由共济失调毛细血管扩张突变基因（Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM）突变引起，其特征为早发性小脑共济失调。ATM) 基因14. 突变体的 果蝇 同源基因 ATM, tefu，表现出运动能力和寿命的缺陷15. 为了评估 &#34;果蝇 岛屿实验&#34; 宏观，a 果蝇 AT 模型在岛状实验中进行了测试，将宏程序输出的数据与人工计数结果进行了比较。结果表明，广泛存在的 tefu 基因敲低（w-；肌动蛋白-Gal4/GD11950） 显著降低了这些果蝇离开平台的能力，与其遗传背景对照（w）相比-；肌动蛋白-Gal4/+) (图4). 1秒后，对照组果蝇有50%已逃离平台，而 &#60;1% tefu-RNAi 果蝇。重要的是，利用宏程序获得的数据与手动计数获得的数据高度一致，表明该宏程序是一种可靠的工具，可用于岛屿实验数据的定量分析及运动缺陷的评估 (图4 A-B).
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg" /> 
图1：岛屿实验的需求、实验流程及分析流程图。（A）岛屿实验设备。（B）岛屿实验的实验装置。（C）岛屿实验。（D）使用“Drosophila Island Assay”宏处理岛屿实验数据。“Drosophila Island Assay”宏由3个子宏组成：1）生成图像栈与投影图，2）定义平台区域，3）分析。（E）使用“Island Assay Analysis”脚本进行数据处理与统计评估。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg" /> 
图2：实验流程中所需的不同调整示例。（A）岛屿实验数据处理与分析时必须采用的目录结构。（B）调整视频设置时，果蝇应在白色背景上呈现为黑色。（C）由本文所述图像记录软件保存的图像帧输出文件。（D）黄色轮廓显示了平台的选择区域，“ROI Manager”中已保存的平台选择区域以蓝色高亮显示。（E）在调整“最小果蝇尺寸设置”时，果蝇以白色圆点表示。结果窗口显示果蝇面积（单位：像素）。（F）单帧原始记录图像（左图）与使用“Drosophila Island Assay”宏处理后所得图像堆栈中的对应帧（右图）的示例。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg" /> 
图3：使用“Island Assay Analysis”脚本进行数据处理后获得的结果图像。（A）显示各对照组实验重复样本飞行逃避反应的折线图。（B）显示各tefu RNAi实验重复样本飞行逃避反应的折线图。（C）不同实验条件下平均飞行逃避反应；误差线表示标准误（SEM）。（D）点图表示对照组与突变组条件下曲线下面积的分布情况。tefu RNAi组和对照组的实验重复均以单个数据点（黑色）显示，中位数用红线表示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg" /> 
图4：普遍性敲低tefu基因的果蝇表现出显著降低的离台能力。 数据表示对照组（w-; Actin-Gal4/+）和tefu RNAi组（w-; Actin-Gal4/GD11950）果蝇在平台上停留的比例随时间（秒）的变化情况（重复次数 = 5；误差棒表示标准误SEM）。(A) 使用“Drosophila Island Assay”宏获得的原始数据。(B) 使用“Drosophila Island Assay”宏生成的对照组与tefu RNAi条件下的曲线下面积分布点图（Welch非配对t检验，**p &lt;0.01）。(C) 通过人工逐秒计数岛上果蝇数量获得的原始数据。(D) 通过手动计数获得的对照组与Tefu RNAi条件下的曲线下面积分布点图（Welch非配对t检验，**p &lt;0.01）。误差棒表示标准误SEM。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名称</td>
			<td colspan="3">描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>切片</td>
			<td colspan="3">帧名称。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>计数</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内检测到的对象数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总面积</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内检测到的对象的总面积（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均大小</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内检测到的对象的总面积除以对象数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 面积</td>
			<td colspan="3">对象所占面积占平台（ROI）总面积的百分比。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>周长</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内检测到的对象的总周长（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最小果蝇大小</td>
			<td colspan="3">用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的最小果蝇大小（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROI 面积</td>
			<td colspan="3">在运行子宏“define platform”期间由用户定义的平台（ROI）面积（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>果蝇数量</td>
			<td colspan="3">用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的每次实验所使用的果蝇数量。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：由“Drosophila Island Assay”宏测量的参数。 本表中描述的参数将在运行“Drosophila Island Assay”宏后出现在“results.txt”文件中。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列名</td>
			<td colspan="3">描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice</td>
			<td colspan="3">帧编号。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内，当前帧中检测到的果蝇数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">在平台（ROI）范围内，当前帧中检测到的果蝇总面积（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. Fly Size</td>
			<td colspan="3">用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的最小果蝇尺寸（以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area ROI</td>
			<td colspan="3">用户运行子宏“define platform”时定义的平台区域（ROI，以像素为单位）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Number of Flies</td>
			<td colspan="3">用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的每次实验所使用的果蝇数量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">相对于实验过程中在平台上检测到的最多果蝇数，当前切片/帧中位于平台上的果蝇所占百分比。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">时间点1表示被分析的第一帧，对应果蝇首次出现在平台上的帧。每份重复样本共分析100帧（在使用所述设置时，相当于10秒）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td colspan="3">每种条件下重复实验的次数。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condition</td>
			<td colspan="3">表示实验条件的名称（根据包含数据的文件夹的用户自定义名称确定）。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：使用“Island Assay Analysis”脚本处理数据后获得的变量说明。 本表中描述的参数在使用“Island Assay Analysis”脚本处理数据后，会出现在“data_all_conditions.csv”文件中。

孤岛实验是一种相对较新且成本效益较高的检测方法，可用于评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基本运动行为。本文描述了用于自动处理数据和客观量化孤岛实验数据的算法，使该实验成为适用于大规模遗传学或药理学筛选的灵敏、高通量检测手段。

下一代测序技术的进步有助于识别运动障碍及其他疾病的相关（候选）致病基因

岛屿实验（Island Assay）的总体目标是通过自动数据处理和客观量化方法，评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基本运动行为。该方法可用于鉴定运动行为的关键调控因子，例如与运动障碍相关的基因，也可用于测试可能逆转此类缺陷的药物。该技术的主要优势在于能够实现对果蝇运动行为的高通量定量分析，因此适用于大规模筛选研究。我们决定开发这一方法学，以能够分析大量的疾病模型。为此，我们需要自动化的图像数据分析手段，从而使该目标得以实现。该方法的可视化演示非常有帮助。β处理过程中的多个步骤十分关键，对于新用户而言可能较难掌握，尤其是那些不熟悉所用软件包的用户。首先，每种实验条件至少准备三个试管作为生物学重复。每个文件应包含约15只相同性别且年龄相近的果蝇。重要的是，果蝇必须具有完整的翅膀。创建文件夹以存储实验数据。根据实验条件和重复次数定义的目录结构生成这些文件。例如，如果实验包含两种基因型，每种基因型有五个重复，则创建一个以实验日期命名的主文件夹，在该主文件夹内分别为每种基因型创建一个子文件夹；然后，在每个基因型子文件夹内，再为每个重复创建相应的子文件夹。接下来，设置测试装置。在浴槽托盘中加入少量肥皂的冷水，并将平台置于浴槽中央（如果尚未固定在浴槽中）。用一个透明盒子盖住托盘和平台。为了照亮平台，将一个冷光源灯（例如普通的 12 伏 LED 灯）放置在平台上方。同时，将一台连接到计算机的网络摄像头直接置于平台正上方。在计算机上打开图像记录软件。在菜单系统中，选择合适的网络摄像头作为采集设备。将一只死亡的果蝇放置在拍摄台中央，以调整视频参数。在软件中调节亮度、对比度和颜色，使死亡的果蝇在白色背景上呈现为黑色。接下来，调整延时摄影设置，将视频保存为 AVI 文件格式。然后，浏览至数据应保存的目录，并定义视频的名称。保存这些更改。对于图像数据的压缩，请选择 Intel IYUV 编码。将录制速度设置为每 0.1 秒一帧，并将相应的播放速率调整为每秒 10 帧。最后，进入高级设置，选择为每个捕获的帧创建一个 bmp 图像。然后，浏览至您选择用于存储 AVI 文件的同一目录，然后按确定。开始前，请确保培养皿中的小岛区域干净且无任何物体。接着，在图像采集软件的时间序列图像界面中开始录制。取一个装有果蝇的小瓶，轻敲两到三次，使所有果蝇震落到瓶底。然后迅速拔去瓶塞，用力将果蝇敲击到平台上。果蝇应大致同时落在平台表面。让果蝇最多离开平台30秒，然后停止录制。如有必要，手动移除平台上残留的果蝇。在进行下一个实验之前，务必重新定义下一组数据的存储目录。第一步是生成所采集图像序列的堆栈和投影。在 Fiji 中打开果蝇岛屿实验。在新窗口中，输入第一组图像时间序列的标识符。接下来，仅选择创建堆栈和投影子宏。点击“确定”，并指示计算机定位到包含所有单个岛状实验子文件夹的文件夹。数据处理完成后，每个独立的实验子文件夹中将生成两个新文件。下一步任务是确定图像中平台的精确位置。打开图形界面，选中“define platform”复选框，然后选择存储实验子文件夹的目录。投影图像和两个窗口将打开。在第一幅图像中，使用多边形选择工具在岛屿状平台区域上绘制一个多边形。请注意，不要将平台边缘的边界线包含在该选区中。通过点击 ROI 管理器窗口中的“添加”按钮，将选区加入 ROI 管理器窗口。将选区添加至 ROI 管理器后，其将显示为一组数值。然后，在“定义平台”窗口中点击“确定”。软件将进入文件夹中存储的下一张投影图像。通过在 ROI 管理器中选择已保存的平台 ROI，并在“定义平台”窗口中确认该 ROI，将其应用于下一张投影图像。在进入下一张投影图像之前，务必确认实验过程中平台未发生移动。如果平台的位置确实发生了移动，请在选区中心左键单击并将其拖动至所需位置。如果选区框与平台不匹配，请在选区外左键单击，并使用多边形工具重新勾画平台的新选区。将此新选区添加到 ROI 管理器中。然后，在“定义平台”窗口中点击“确定”以确认新的选择，并继续该流程，直至所有图像中的平台均已正确定义。在处理数据前的最后一项任务是定义果蝇的最小尺寸，具体操作详见文本方案。为了量化从平台逃离的果蝇数量，首先设置果蝇的最小尺寸。然后，指定实验系列中单个文件内果蝇的最大数量。启动分析功能，在提示下选择实验的主目录。运行宏后，注意每个文件夹中均出现了一个新的结果文件和一个新的图像堆栈。打开这些文件以确保操作正确执行。启动 R 或 RStudio 软件包，并打开 Island Assay 分析脚本以同时处理所有实验。必须正确编辑脚本才能使分析成功。在脚本的第 16 行插入包含待分析实验的主目录路径。在第 19 行插入分析结果文件的存储文件夹路径。后者必须是与待分析图像数据所在目录不同的位置。现在，从工具栏运行该脚本，并继续分析结果。该脚本“Island Assay analysis”会为每个实验条件导出一条折线图。该图显示了在每个实验重复条件下，随时间推移仍停留在平台上的果蝇百分比。导出的折线图“逃避反应：所有条件”总结了主文件夹中前12个实验条件的平均飞行逃避反应及其平均值的标准误差。通过计算每个实验重复的曲线下面积，以确定不同实验条件之间是否存在显著差异。每种实验条件的曲线下面积和中位数值均以图表形式导出。根据主文件夹中实验条件的数量，脚本将对两种条件执行双尾非配对 Welch T 检验，或对多于两种条件执行方差分析（ANOVA）并进行两项关键校正。脚本“Island Assay analysis”计算的所有数值数据也会被导出，并保存为数据输出文件夹中的 csv 或 txt 文件。共济失调毛细血管扩张症是一种由ATM基因突变引起的常染色体隐性遗传运动障碍疾病，其特征是小脑性共济失调早期发病。通过岛屿实验检测了在果蝇中普遍敲低ATM同源基因的效果，并与对照组进行了比较。总体而言，与遗传背景对照相比，广泛性敲低果蝇 ATM 同源基因 Tefu 显著降低了果蝇在孤岛实验中的运动能力。对记录的孤岛实验数据进行人工分析所得结果与自动分析结果一致。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展孤岛实验、如何运行果蝇孤岛实验宏程序，以及如何操作孤岛实验分析脚本。在进行本方案时，需要牢记图像分割的质量与视频的质量密切相关。对比度越高，分析过程越顺畅。该技术开发完成后，将为研究人员以高通量方式探索果蝇的运动能力开辟新的途径。使用本实验方法后，可进一步采用其他检测方法，例如负向趋地性检测，以深入研究运动缺陷。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

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