高通量分析运动行为的 果蝇 岛屿实验

岛屿实验（Island Assay）的总体目标是通过自动数据处理和客观量化方法，评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基本运动行为。该方法可用于鉴定运动行为的关键调控因子，例如与运动障碍相关的基因，也可用于测试可能逆转此类缺陷的药物。

该技术的主要优势在于能够实现对果蝇运动行为的高通量定量分析，因此适用于大规模筛选研究。我们决定开发这一方法学，以能够分析大量的疾病模型。为此，我们需要自动化的图像数据分析手段，从而使该目标得以实现。

该方法的可视化演示非常有帮助。β处理过程中的多个步骤十分关键，对于新用户而言可能较难掌握，尤其是那些不熟悉所用软件包的用户。首先，每种实验条件至少准备三个试管作为生物学重复。

每个文件应包含约15只相同性别且年龄相近的果蝇。重要的是，果蝇必须具有完整的翅膀。创建文件夹以存储实验数据。

根据实验条件和重复次数定义的目录结构生成这些文件。例如，如果实验包含两种基因型，每种基因型有五个重复，则创建一个以实验日期命名的主文件夹，在该主文件夹内分别为每种基因型创建一个子文件夹；然后，在每个基因型子文件夹内，再为每个重复创建相应的子文件夹。

接下来，设置测试装置。在浴槽托盘中加入少量肥皂的冷水，并将平台置于浴槽中央（如果尚未固定在浴槽中）。用一个透明盒子盖住托盘和平台。

为了照亮平台，将一个冷光源灯（例如普通的 12 伏 LED 灯）放置在平台上方。同时，将一台连接到计算机的网络摄像头直接置于平台正上方。在计算机上打开图像记录软件。

在菜单系统中，选择合适的网络摄像头作为采集设备。将一只死亡的果蝇放置在拍摄台中央，以调整视频参数。在软件中调节亮度、对比度和颜色，使死亡的果蝇在白色背景上呈现为黑色。

接下来，调整延时摄影设置，将视频保存为 AVI 文件格式。然后，浏览至数据应保存的目录，并定义视频的名称。保存这些更改。

对于图像数据的压缩，请选择 Intel IYUV 编码。将录制速度设置为每 0.1 秒一帧，并将相应的播放速率调整为每秒 10 帧。最后，进入高级设置，选择为每个捕获的帧创建一个 bmp 图像。

然后，浏览至您选择用于存储 AVI 文件的同一目录，然后按确定。开始前，请确保培养皿中的小岛区域干净且无任何物体。接着，在图像采集软件的时间序列图像界面中开始录制。

取一个装有果蝇的小瓶，轻敲两到三次，使所有果蝇震落到瓶底。然后迅速拔去瓶塞，用力将果蝇敲击到平台上。果蝇应大致同时落在平台表面。

让果蝇最多离开平台30秒，然后停止录制。如有必要，手动移除平台上残留的果蝇。在进行下一个实验之前，务必重新定义下一组数据的存储目录。

第一步是生成所采集图像序列的堆栈和投影。在 Fiji 中打开果蝇岛屿实验。在新窗口中，输入第一组图像时间序列的标识符。

接下来，仅选择创建堆栈和投影子宏。点击“确定”，并指示计算机定位到包含所有单个岛状实验子文件夹的文件夹。数据处理完成后，每个独立的实验子文件夹中将生成两个新文件。

下一步任务是确定图像中平台的精确位置。打开图形界面，选中“define platform”复选框，然后选择存储实验子文件夹的目录。

投影图像和两个窗口将打开。在第一幅图像中，使用多边形选择工具在岛屿状平台区域上绘制一个多边形。请注意，不要将平台边缘的边界线包含在该选区中。

通过点击 ROI 管理器窗口中的“添加”按钮，将选区加入 ROI 管理器窗口。将选区添加至 ROI 管理器后，其将显示为一组数值。然后，在“定义平台”窗口中点击“确定”。

软件将进入文件夹中存储的下一张投影图像。通过在 ROI 管理器中选择已保存的平台 ROI，并在“定义平台”窗口中确认该 ROI，将其应用于下一张投影图像。在进入下一张投影图像之前，务必确认实验过程中平台未发生移动。

如果平台的位置确实发生了移动，请在选区中心左键单击并将其拖动至所需位置。如果选区框与平台不匹配，请在选区外左键单击，并使用多边形工具重新勾画平台的新选区。将此新选区添加到 ROI 管理器中。

然后，在“定义平台”窗口中点击“确定”以确认新的选择，并继续该流程，直至所有图像中的平台均已正确定义。在处理数据前的最后一项任务是定义果蝇的最小尺寸，具体操作详见文本方案。

为了量化从平台逃离的果蝇数量，首先设置果蝇的最小尺寸。然后，指定实验系列中单个文件内果蝇的最大数量。启动分析功能，在提示下选择实验的主目录。

运行宏后，注意每个文件夹中均出现了一个新的结果文件和一个新的图像堆栈。打开这些文件以确保操作正确执行。启动 R 或 RStudio 软件包，并打开 Island Assay 分析脚本以同时处理所有实验。

必须正确编辑脚本才能使分析成功。在脚本的第 16 行插入包含待分析实验的主目录路径。在第 19 行插入分析结果文件的存储文件夹路径。

后者必须是与待分析图像数据所在目录不同的位置。现在，从工具栏运行该脚本，并继续分析结果。该脚本“Island Assay analysis”会为每个实验条件导出一条折线图。

该图显示了在每个实验重复条件下，随时间推移仍停留在平台上的果蝇百分比。导出的折线图“逃避反应：所有条件”总结了主文件夹中前12个实验条件的平均飞行逃避反应及其平均值的标准误差。通过计算每个实验重复的曲线下面积，以确定不同实验条件之间是否存在显著差异。

每种实验条件的曲线下面积和中位数值均以图表形式导出。根据主文件夹中实验条件的数量，脚本将对两种条件执行双尾非配对 Welch T 检验，或对多于两种条件执行方差分析（ANOVA）并进行两项关键校正。脚本“Island Assay analysis”计算的所有数值数据也会被导出，并保存为数据输出文件夹中的 csv 或 txt 文件。

共济失调毛细血管扩张症是一种由ATM基因突变引起的常染色体隐性遗传运动障碍疾病，其特征是小脑性共济失调早期发病。通过岛屿实验检测了在果蝇中普遍敲低ATM同源基因的效果，并与对照组进行了比较。

总体而言，与遗传背景对照相比，广泛性敲低果蝇 ATM 同源基因 Tefu 显著降低了果蝇在孤岛实验中的运动能力。对记录的孤岛实验数据进行人工分析所得结果与自动分析结果一致。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展孤岛实验、如何运行果蝇孤岛实验宏程序，以及如何操作孤岛实验分析脚本。

在进行本方案时，需要牢记图像分割的质量与视频的质量密切相关。对比度越高，分析过程越顺畅。该技术开发完成后，将为研究人员以高通量方式探索果蝇的运动能力开辟新的途径。

使用本实验方法后，可进一步采用其他检测方法，例如负向趋地性检测，以深入研究运动缺陷。