超高分辨率小鼠光学相干断层扫描技术在视网膜基因治疗研究中辅助眼内注射

本项视网膜下注射操作的总体目标是以微创且可重复的方式将载体递送至视网膜，并实现对过程的实时观察。您好，该方法可用于回答基因治疗研究中的关键问题，例如载体递送效率和治疗剂毒性。该技术的一些优势包括对视网膜及其他眼部结构造成的损伤最小、精确的注射位点定位，以及严格的体内定量测量，从而支持可靠的统计推断。

进行眼内转基因注射时，首先将麻醉后的小鼠放置在视网膜成像系统显微镜的观察台上，将无菌钝头虹膜镊的尖端置于眼睑的7点和10点位置，同时将镊子张开并向下推，以轻柔地诱导眼球突出。使用镊子将眼睑引导至眼球下方，并将针头尖端指向角膜缘边缘下方约1至1.5毫米处。接着，在眼球表面滴加一滴无菌PBS溶液，并用无菌盖玻片覆盖眼球。

通过结膜将针头小心地刺入眼球，直至形成巩膜凹陷。使用显微操作器将眼球向上旋转，直到巩膜凹陷处于焦点位置，然后将针头向前推进，用针尖在视网膜上形成一个尖锐的隆起。使用持针器轻轻旋转针头，直至针尖穿透巩膜和视网膜色素上皮（RPE），使针尖内的荧光素在视网膜组织下方、紧邻视网膜下腔及视网膜色素上皮细胞单层处可见。

将针尖向下推进，使其与眼球表面相切，然后用脚踏开关启动注射泵。当0.5至1微升的转基因溶液被注入视网膜下腔后，撤出针头，并确认血液稳定且注射通道无液体渗出。为确认注射是否成功，记录矩形体积的OCT图像，并将图像与不同可能注射结果的图像进行比较。

确认注射位置正确后，使用该矩形OCT图像将隆起范围映射到眼底图像上。为映射视网膜下隆起的范围，打开隆起部位的矩形体积OCT图像，确保图像中包含眼内可识别的解剖标志。根据需要添加多个卡尺，以确定B扫描左右边缘的位置，以及视神经乳头（ONH）（若存在）和视网膜从视网膜色素上皮层（RPE）及脉络膜分离处的拐点位置，然后保存数据。

然后编译保存的文件并绘制数据，从而将注射隆起区域有效映射到 en face OCT 图像上。将绘制的数据叠加到包含注射部位的眼底图像上，并保存合并后的图像。在后续的 OCT 成像过程中，使用该图像定位感兴趣区域。

为了评估注射后的视网膜变性，首先打开已记录的高分辨率谱域光学相干断层扫描（HRSD OCT）矩形体积图像，并选择一个待测量的B扫描图像。放大所选图像直至其充满屏幕，然后右键单击该图像。点击“卡尺”工具以选择适当数量的卡尺，接着使用“配置卡尺”功能，在角度块列中将卡尺设置为垂直方向，并开启“显示卡尺位置”功能，以便在视网膜范围内实现卡尺位置的一致性放置。

单击“应用”，然后将每个卡尺移动到B扫描图像上相距0.1至0.2毫米的适当位置，必要时将其中一个卡尺置于视盘中心。当所有卡尺放置完毕后，单击并拖动每个卡尺，使其覆盖目标区域的长度范围，并将未覆盖可测量B扫描区域的卡尺任意设置为最大长度。为测量外界膜核层厚度，将每个卡尺的顶部置于外界膜，底部置于外丛状层底部，沿视网膜以0.1至0.2毫米的间隔进行测量。

在放置并调整好所有卡尺后，右键单击图像，然后单击“保存卡尺数据”；接着按照上述方法，每隔十个B扫描重复一次测量，保持卡尺处于打开状态，并位于x轴相同位置，根据需要调整卡尺长度，但不得在x方向上移动卡尺。当所有扫描测量完成后，打开已保存的数据文件，单击“修改日期”以按保存时间顺序排列文件。打开每个已测量B扫描对应的数据文件，将各B扫描的原始数据按帧编号从低到高整合到一个单一文件中，并选中包含卡尺名称、长度和中心X坐标的数据列。

确保在处理每个矩形体积OCT图像时，所有B扫描的中心X坐标保持一致，并删除未用于记录测量值的游标数据。将位于视盘中心的游标设为零，绘制X与多个Y数据集的关系图，以获得外核层或其他任何测量视网膜层厚度的三维图函数。然后比较相同年龄的对照组与实验组动物之间的外核层测量值，以确定潜在视网膜变性的速率和均匀性。

为了进行视网膜测量的三维定位，需回顾注射后的OCT图像，记录任何可识别的解剖标志，然后调整动物位置，对同一区域获取随访的SDOCT图像，注意包含相同的可识别标志，并按前述方法处理所记录的图像。获取包含可识别解剖标志的高质量OCT图像至关重要，这有助于重新成像先前注射的视网膜区域。为了测量外界节段（OS）长度的变化，使用游标卡尺工具从外界膜（external limiting membrane）量至布鲁克膜（Brooks membrane），由于这些层次在OCT图像中易于识别，因此可实现可靠的测量。

不同小鼠品系间这些层次测量值的差异归因于外节段长度较短。如果视网膜下注射操作成功，视网膜下腔的打开会诱导形成一个隆起（bleb），该隆起可在HRSD OCT成像仪的俯视图和B扫描图像中清晰观察到。叠加注射部位的边界图，可对视网膜组织测量数据和游标位置数据集进行分割，从而进一步对特定治疗药物对视网膜变性的影响进行统计学分析。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在十分钟内完成。在实施该手术过程中，重要的是始终牢记保持手术环境的清洁与无菌。该技术在建立后，为基因治疗领域的研究人员提供了实时监测整个视网膜下注射手术过程的途径，并创建了一种在活体中立即判定手术成功与否的方法。

完成此注射操作后，可进一步进行光学相干断层扫描（OCT）及其他方法（如视网膜电图）以探讨转基因功能挽救和/或毒性的相关问题。观看本视频后，您应掌握经巩膜和经脉络膜的视网膜下注射操作方法，学会如何根据图像将注射隆起范围对应至OCT图像，并对视网膜外层进行精确测量。请务必注意，操作基因治疗载体可能存在风险，进行该操作时应始终采取预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备。