Name: 流感病毒在小鼠感染模型中的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解甲型流感病毒在小鼠模型中的致病机制、体液免疫反应及疫苗保护效力评估方法。该技术利用C57B6小鼠研究病毒病理学与免疫应答，为流感疫苗开发和抗病毒治疗提供重要的临床前研究基础。

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LM-S 实验室的流感病毒研究部分由纽约流感卓越中心（NYICE）资助，该中心是美国国家过敏与传染病研究所流感研究与监测卓越中心（CEIRS）的成员。我们感谢 Wendy Bates 在稿件修改过程中提供的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

IAV 的小鼠模型被广泛用于 IAV 致病性、免疫原性和保护效力的 体内 研究。与其他动物模型（如雪貂或豚鼠）相比，小鼠体型小，易于操作和饲养。此外，由于其动物成本低、饲养方便且繁殖能力强，适合用于需要大量动物的临床前疫苗试验。值得注意的是，由于小鼠已被广泛应用于多个研究领域，目前已有多样化的分子与免疫学小鼠试剂可供使用，从而促进其在 IAV 研究中的应用。此外，小鼠宿主变异程度低，且其免疫系统在进化上与人类免疫系统具有相似性，使其成为研究 IAV 的可靠小型动物模型。最后，通过使用基因敲除（KO）小鼠，目前可实现对宿主-病毒蛋白相互作用及其在病毒致病过程中作用的研究。然而，尽管小鼠在 IAV 研究中具有多种优势，却不适用于 IAV 传播研究。因此，雪貂或豚鼠是研究 IAV 传播更为合适的动物模型。感染 IAV 的小鼠通常在感染后 2 至 3 天出现临床症状，但具体时间可能因小鼠年龄、免疫状态、性别、遗传背景和品系，以及所用病毒株和剂量的不同而有所差异。症状包括厌食、嗜睡、蜷缩、毛发竖立、体重下降和死亡16,17<...

甲型流感病毒（IAVs）属于有包膜病毒，归类于Orthomyxoviridae科3。其基因组由八条单链负链RNA分子组成3。在人类中，当新型病毒传入人群时，IAVs可引起季节性流行，并偶尔导致具有重大影响的全球大流行4。此外，季节性IAVs在人与人之间传播能力强且迅速，每年在全球范围内造成巨大的经济损失2,5。IAVs感染的症状包括咳嗽、鼻塞、发热、不适、头痛、食欲减退和肌痛，但在免疫功能低下患者中，该病毒还可引发更严重的疾病6。事实上，世界卫生组织（WHO）估计，季节性流感病毒每年在全球导致30万至50万人死亡1。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准了两类用于人类流感预防和治疗的药物：神经氨酸酶（NA）抑制剂（例如，奥司他韦）和M2离子通道阻断剂（例如，金刚烷胺）；然而，耐药病毒株的出现日益令人担忧。因此，接种疫苗仍是预防人类IAVs感染的最佳医学手段。截至目前，FDA已批准三种可用于人类的流感疫苗：重组病毒血凝素（HA）蛋白疫苗、灭活流感疫苗（IIV）和减毒活流感疫苗（LAIV）5,7。这三种疫苗的设计均旨在诱导针对病毒HA蛋白的适应性免疫应答，而HA蛋白是抗IAVs中和抗体的主要靶标。
一种经验证的小鼠模型用于研究甲型流感病毒感染 体内
动物模型已被用于研究流感病毒（IAV）的致病机制8,9,10,11、参与疾病发展的病毒因子12和/或病毒传播能力13,14，以及评估新型疫苗或抗病毒药物的有效性9,10,15。小鼠（Mus musculus）是目前IAV研究中应用最广泛的动物模型，原因包括：1）其免疫系统在进化上与人类的免疫系统相似；2）饲养成本低，包括购买、饲养和繁殖费用较低；3）体型小，便于操作和保存；4）宿主个体间差异小，可获得均一的反应和实验结果；5）对小鼠生物学特性已有大量研究积累，包括基因组序列信息；6）有丰富的分子生物学和/或免疫学试剂可供使用；7）存在多种基因敲除（KO）小鼠模型，可用于研究特定宿主蛋白在病毒感染中的作用；8）拥有多种不同的小鼠品系，可用于探究感染的遗传基础。
目前有多种小鼠品系可用于研究甲型流感病毒（IAV） 体内年龄、免疫状态、性别、遗传背景和小鼠品系，以及感染途径、剂量和病毒株，均会影响小鼠感染甲型流感病毒（IAV）后的结果。IAV 研究中最常用的小鼠品系为 C57BL/6、BALB/c，以及近年来更易感 IAV 疾病的 DBA.2 小鼠，其易感性高于前两种品系。16,17,18,19,20重要的是，免疫反应也可能因小鼠品系的不同而有所差异18,19,20因此，为了选择最适合待开展实验的方案，获取有关小鼠和IAV毒株的所有可用信息至关重要。
尽管小鼠是感染研究的良好动物模型 体内 在使用小鼠进行甲型流感病毒（IAV）研究时，存在若干局限性，这些局限性在实验设计中需要予以考虑。例如，使用小鼠的一个主要局限性在于 体内 研究的一个问题是，IAVs 在小鼠之间不会传播。因此，对于传播研究，更被接受的动物模型（例如，雪貂或豚鼠）被使用16,17,21此外，小鼠与人类感染甲型流感病毒（IAV）后的表现存在若干差异。与人类不同，小鼠在感染IAV后不会出现发热，反而表现为体温过低。16,17在小鼠中，甲型流感病毒（IAV）的复制主要集中于下呼吸道（肺部），而非上呼吸道。因此，IAV在小鼠中的毒力并不总是与在人类中的表现相关。总体而言，由于优势超过局限性，小鼠成为评估流感病毒致病机制、免疫原性以及疫苗和抗病毒药物保护效果的首选动物模型。此外，在缺乏小动物模型中IAV感染的前期证据时，使用大型动物模型开展IAV相关研究在伦理上是不可接受的。本文中，我们描述了如何通过鼻内途径（i.n.）感染小鼠，如何监测病毒感染的严重程度和进展过程，以及如何开展评估体液免疫反应和保护效力所需的实验。

<table><tbody><tr><td>Madin-Darby 犬肾（MDCK）上皮细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>6至8周龄雌性C57BL/6小鼠</td><td>美国国家癌症研究所（NCI）</td><td>01XBE</td><td></td></tr><tr><td>火鸡红细胞</td><td>Biolink 公司</td><td></td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液</td><td>康宁</td><td>30-009-CI</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液</td><td>康宁</td><td>30-00-CI</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液（BA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>单克隆抗体抗甲型流感病毒NP HB-65</td><td>ATTC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/FITC</td><td>Dako</td><td>F0261</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ECL 抗小鼠 IgG，辣根过氧化物酶标记的完整抗体</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA931V/AG</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TMB底物试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>421101</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vmax 动力学酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>邓斯组织研磨器</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>受体破坏酶，RDE（II）</td><td>Denka Seiken Co.</td><td>370013</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96孔聚苯乙烯锥底微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>249570</td><td></td></tr><tr><td>Puralub Vet 软膏</td><td>德克拉</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>奥林巴斯 IX81</td><td></td></tr></tbody></table>

流感a病毒在感染小鼠模型中的研究

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

流感病毒在全球范围内每年导致超过50万人死亡1，仅在美国，考虑到直接的医疗和住院费用以及因病缺勤，每年造成的经济损失达120至140亿美元2。在甲型流感病毒（IAV）研究中，动物模型对于评估病毒致病性、宿主与病原体相互作用、免疫应答以及现有或新型疫苗策略和抗病毒药物的有效性至关重要。小鼠是一种具有优势的小型动物模型，因为其免疫系统在进化上与人类相似，可从商业供应商处获得遗传背景一致的个体，存在多种品系可用于探究感染的遗传基础，且饲养成本相对较低，操作简便。为了通过呼吸道模拟人类IAV感染，需在适当的生物安全防护条件下，先对小鼠进行麻醉，再经鼻内接种具有感染性的IAV。感染后，通过每日监测小鼠的发病情况（体重减轻）和死亡率（存活率）来评估IAV的致病性。此外，还可通过检测感染小鼠上呼吸道（鼻黏膜）或下呼吸道（肺部）中的病毒复制水平来评估病毒致病性。IAV感染后的体液免疫应答可通过无创采血结合次级抗体检测方法快速评估，以检测总抗体或中和抗体的存在。本文描述了经鼻内（i.n.）途径感染小鼠并评估其致病性、体液免疫应答及保护效力的常用方法。

小鼠中病毒致病机制的表征
甲型流感病毒（IAV）的致病机制与其感染所导致的发病率和死亡率相关。这两个参数可在小鼠中轻松评估：IAV的发病率与感染小鼠的体重下降有关，而存活率百分比则反映死亡率（图1）。通常在感染后至少两周内每天监测IAV感染小鼠的体重变化和存活情况8,9,10,29。所获得的存活数据可用于确定半数致死剂量（MLD50），该值通过Reed和Muench方法计算得出25。另一个与IAV致病性相关的指标是病毒在下呼吸道（肺）和上呼吸道（鼻黏膜）的复制情况（<stron...

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

流感病毒在全球范围内每年导致超过50万人死亡1，仅在美国就与每年120亿至140亿美元的经济损失相关……

本实验方案的总体目标是利用小鼠感染模型评估甲型流感病毒野生株或甲型流感疫苗所诱导的致病机制、体液免疫反应及保护效果。该方法有助于回答有关甲型流感病毒生物学方面的问题，例如病毒致病性、免疫应答以及流感疫苗和抗病毒药物的有效性。该技术的主要优势在于小鼠具有与人类相似的免疫系统，且存在多种品系可供使用，可用于探究甲型流感病毒感染的遗传学基础。由于该方法可为评估新型流感疫苗的有效性提供依据，因此也可应用于其他较早的系统，例如评价潜在的抗病毒治疗方法，包括抗体或药物。在无病原体条件下饲养并标记6至8周龄的C57B6小鼠，并在无菌条件下制备流感病毒A（Influenza A virus, IAV）的稀释液后，使用天平称量小鼠体重并记录数据。当小鼠麻醉后，根据文本方案确认麻醉深度，将小鼠置于仰卧位。将含有30微升病毒接种物的移液器吸头插入鼻孔，缓慢但持续地推出溶液。为评估发病和死亡情况，按照文本方案所述，用10个完整剂量的PR8野生型病毒分别感染3至4组雌性小鼠。在接下来的14天内，于大致相同的时间点监测并称量小鼠体重，以尽量减少因摄食导致的体重波动。处死在病毒感染后存活的小鼠，并根据正文方案计算病毒的50%小鼠致死剂量（MLD50）。用10至10的4次方荧光形成单位（FFU）的PR8野生型病毒剂量感染6至8周龄的雌性小鼠。在第2天和第4天，采集小鼠肺组织和鼻黏膜用于评估。安乐死后，将动物置于仰卧位，并使用70%乙醇对胸部区域的毛发进行消毒。使用剪刀从腹部基部向胸骨方向剪开皮肤。然后，用剪刀从切口基部向小鼠两侧各做一条1厘米长的切口。将小鼠上半身的皮肤完全剥离，直至腹部切口的起始位置。接着用剪刀剪下头部，并将其放入一个干燥无菌的培养皿中。使用剪刀剪断上颌与下颌之间的连接处，并弃去下颌。然后用剪刀在颧弓末端进行两处剪切，移除颧弓。使用解剖镊去除眼球。接下来，用解剖镊夹住颅骨，使用手术刀沿矢状缝切开颅骨。用镊子提起带有脑组织的两半颅骨，以观察鼻黏膜。使用手术刀将带有脑组织的颅骨部分剪下并弃去。将剩余的颅骨连同鼻黏膜置于无菌管中。若样品在同日处理，则将试管置于冰上保存；若需后续处理，则迅速用干冰冷冻。为避免样品污染，每次获取组织及每只动物解剖之间，均须使用二氧化氯消毒剂清洁和消毒解剖工具。然后，为了采集肺脏，将动物置于仰卧位，用剪刀剪开胸膜。从肋骨底部开始，沿胸骨两侧各1厘米处用剪刀剪断肋骨，直至肋骨上部。在肋骨上部的两处切口之间用剪刀横向剪开，移除胸骨板。用镊子夹住肺组织，在气管末端靠近肺部处剪开，将肺放入无菌管中。将肺或鼻黏膜组织放入无菌的Dounce匀浆器中，加入1毫升冷感染培养基。在室温下上下移动研杵约1分钟，直至肺组织完全破碎，完成样品匀浆。将匀浆后的样品放入无菌离心管中。在室温下以 300 × g 离心 5 至 10 分钟。收集上清液至新的无菌离心管中，弃去沉淀。如

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

流感病毒在小鼠感染模型中的研究

流感病毒A型的并发感染是无症状携带Streptococcus...

利用生物发光成像研究协同作用 肺炎链球菌 以及流感病毒A在幼鼠中的研究

来源： Lenhard, A. 等 一种小鼠模型用于研究转变过程 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程 视频实验杂志 (2022)本视频展示了一种小鼠共感染模型，其中流感病毒引发向 肺炎链球菌...

一种用于研究致病性转变的小鼠模型 肺炎链球菌 继发性病毒感染

来源：Wang, M., 等，小鼠流感病毒A感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估。 J. Vis. Exp.

小鼠鼻腔感染致病性流感病毒

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

一种带有荧光素酶-荧光报告基因的流感病毒用于追踪病毒感染

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。...

在嵌合小鼠模型中通过鼻内给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫

展示了用于人类甲型流感病毒的全身性及局部感染斑马鱼模型。利用全身性感染模型，可将斑马鱼用于抗病毒药物的筛选；利用局部感染模型，可将斑马鱼用于宿主免疫细胞反应的表征。...

利用斑马鱼模型研究人类甲型流感病毒感染以筛选抗病毒药物并表征宿主免疫细胞反应

本研究中，我们介绍了一种在流感病毒感染后对小鼠气管黏膜进行双光子活体成像及细胞相互作用分析的实验方案。该方案对于研究呼吸道感染过程中免疫细胞动态变化的研究人员具有重要意义。...

利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用

甲型流感病毒（IAV）是具有传染性的呼吸道病原体，可引起每年的流行和偶发的大流行。本文介绍了一种利用新型重组荧光素酶和荧光双报告甲型流感病毒（BIRFLU）在活体中追踪病毒感染的实验方案。该方法为研究人员提供了在活体内研究甲型流感病毒的优良工具。...

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和生发中心B细胞反应的实验方案。...

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估

本文描述了一种新型小鼠模型，用于研究肺炎链球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病性病原体的过程。该模型可轻松适用于研究疾病进展不同阶段以及多种宿主中多微生物与宿主-病原体之间的相互作用。...

小鼠模型在转变过程中的应用 肺炎链球菌 从定植者到病原体：病毒共感染重现年龄加剧的疾病进程

本方案提供了流感病毒（IAV）鼻内接种小鼠以及对小鼠肺组织损伤和肺细胞类型相关转录变化进行后续分析的操作说明。...

模拟流感感染后肺泡的发育异常与功能性修复

了解甲型流感病毒在小鼠模型中的致病机制、体液免疫反应及疫苗保护效力评估方法。该技术利用C57B6小鼠研究病毒病理学与免疫应答，为流感疫苗开发和抗病毒治疗提供重要的临床前研究基础。

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

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