流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

本实验方案的总体目标是利用小鼠感染模型评估甲型流感病毒（Influenza A）野生型病毒或流感疫苗所诱导的致病机制、体液免疫反应及保护效力。该方法有助于解答有关甲型流感病毒生物学方面的问题，例如病毒致病性、免疫反应以及流感疫苗和抗病毒药物的有效性。该技术的主要优势在于小鼠具有与人类相似的免疫系统，且存在多种可利用的小鼠品系，可用于探究甲型流感病毒感染的遗传基础。

由于该方法可为评估新型流感疫苗的有效性提供依据，因此也可应用于较早的实验体系，例如评价潜在的抗病毒治疗方法，包括抗体或药物。在无病原体条件下饲养并标记6至8周龄的C57B6小鼠，并在无菌条件下制备甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）稀释液后，使用天平称量小鼠体重并记录数据。

当小鼠麻醉后，根据文本方案确认麻醉深度，将小鼠置于仰卧位。将含有30微升病毒接种物的移液器吸头插入鼻孔，并缓慢但持续地将溶液推出。为评估发病情况和死亡率，按照文本方案所述，用10个完整剂量的PR8野生型病毒分别感染三至四组雌性小鼠。

在接下来的14天内，每天大致相同时间监测并称量小鼠体重，以尽量减少因进食导致的体重波动。在处死存活的小鼠后，根据文本方案计算病毒的50%小鼠致死剂量（MLD50）。使用10至10的4次方荧光形成单位（FFU）的PR8野生型病毒剂量感染6至8周龄的雌性小鼠。

在第2天和第4天，收集小鼠肺组织和鼻黏膜进行评估。安乐死后，将动物置于仰卧位，并使用70%乙醇对胸部区域的毛发进行消毒。使用剪刀从腹部基部向胸骨方向剪开皮肤。

然后，用剪刀从切口基部向小鼠两侧每隔1厘米做一次剪切。将小鼠上半身的皮肤完全剥离，直至腹部切口起始处。接着用剪刀剪下头部，并将其放入一个干燥的无菌培养皿中。

使用剪刀剪断上颌骨与下颌骨之间的连接处，并弃去下颌骨。然后，用剪刀在颧弓末端进行两处剪切，移除颧弓。使用解剖镊去除眼球。

接下来，用解剖镊夹住颅骨，使用手术刀沿矢状缝切开颅骨。用镊子提起带有脑组织的两半颅骨，以观察鼻黏膜。使用手术刀将带有脑组织的颅骨部分剪下并弃去。

将剩余的颅骨连同鼻黏膜放入无菌管中。如果样本在同一天处理，则将试管置于冰上保存；如果稍后处理，则需迅速用干冰冷冻。为避免样本污染，在每次获取组织及每只动物解剖之间，使用二氧化氯消毒剂清洁和消毒解剖工具。

然后，为了采集肺脏，将动物置于仰卧位，用剪刀剪开胸膜。从肋骨底部开始，沿胸骨两侧各1厘米处用剪刀剪断肋骨，直至肋骨上部。在肋骨上部的两处切口之间用剪刀横向剪开，移除胸骨盖板。

用镊子夹住肺组织，在气管末端靠近肺部的位置剪开，将肺放入无菌管中。将肺组织或鼻黏膜放入无菌的Dounce匀浆器中，加入1毫升冷感染培养基。在室温下上下移动研杵约1分钟，直至肺组织完全破碎，完成样品匀浆。

将匀浆后的样品放入无菌离心管中。在室温下以 300 × g 离心 5 至 10 分钟。收集上清液至新的无菌离心管中，弃去沉淀。

如果当天进行病毒滴度测定，将上清液在4°C保存。滴定前一天，在96孔板中用组织培养基接种MDCK上皮细胞，使其达到约80%至90%的融合度。将细胞在37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。

为制备肺组织或鼻黏膜样本匀浆液的1至10倍稀释液，向96孔板的每个孔中加入90微升感染培养基。取一份匀浆样本的上清液10微升，加入孔A1、A2和A3中，以评估每个样本的病毒滴度并设置三复孔。然后，取另一份匀浆样本的上清液10微升，加入孔A4、A5和A6中。在将样本上清液加入A行各孔后，使用多通道移液器通过反复吹打进行混匀。

从A行转移10微升至B行，并充分混匀。每次稀释之间更换吸头，然后从B行转移至C行，依此类推，直至最后一行H。使用真空多通道移液器适配器，从96孔板中的MDCK细胞中吸除组织培养基，并每孔加入100微升1×PBS洗涤细胞两次。从高稀释度开始，逐步向低稀释度进行，将匀浆样品的连续稀释上清液每孔50微升加入MDCK细胞的96孔板中，即从H行向A行细胞依次转移高稀释度样品。

将96孔板置于摇床上，室温孵育1小时，以促进病毒吸附。随后，使用真空多通道移液器吸头去除接种液，并向每孔加入100 µL感染后培养基。将感染的细胞在含5% CO₂的33 °C或37 °C培养箱中孵育8小时。

按照文本方案中所述步骤进行固定、染色、成像及病毒滴度计算。在本实验中，小鼠被接种不同剂量的PR8野生型病毒，每组五只小鼠，于感染后14天内持续监测其体重变化和存活情况。

使用较高空斑形成单位（FFU）的PR8野生型病毒免疫的小鼠，体重下降更快且更严重，最终全部死亡。本实验中，采用Reed和Muench法计算的PR8野生型病毒半数致死量（MLD50）为1.5 × 10² FFU。为了分析针对流感病毒（IV）感染诱导的体液免疫应答，在免疫后第14天采集小鼠血液，检测针对全部病毒蛋白的抗体以及靶向病毒血凝素（HA）蛋白的中和抗体的存在情况，分别采用血凝抑制（HAI）试验和病毒微量中和（VN）试验。

如图所示，实验结果表明，用较高剂量 PR8 减毒活流感病毒（LAIV）免疫的小鼠血清，其针对总 PR8 蛋白的抗体滴度高于用较低剂量免疫的小鼠血清。通过血凝抑制（HAI）和病毒中和（VN）实验发现，接受最高剂量 PR8 LAIV 免疫的小鼠血清具有更高的中和抗体滴度，而接受较低剂量免疫的小鼠血清对 PR8 的中和抗体滴度最低。观看本视频后，您应能够充分掌握如何用甲型流感病毒感染小鼠，以及如何评估其在上、下呼吸道中的致病性、体液免疫与免疫应答和病毒复制情况。

该技术建立后，为流感病毒A型领域的研究人员利用小鼠感染模型探索活体抗体疫苗的致病性、免疫原性及保护效力奠定了基础。