Name: 诱导和诊断肿瘤果蝇 Imaginal Disc Epithelia (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解利用GAL4-UAS系统在果蝇翅成虫盘中诱导肿瘤马赛克克隆的方法。该技术通过简单遗传操作实现肿瘤分期分类，为癌症建模研究提供可靠工具。

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感谢 J. Vaughen 对手稿的审阅。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号 26891025、15H01500 以及武田科学财团研究基金对 Y.T. 的资助。

1. 果蝇杂交与克隆诱导
<ol>
	<li>在收集 virgin 果蝇前 12 小时，移除小瓶中的所有果蝇。</li>
	<li>通过注入 CO2 气体使小瓶中的果蝇麻醉，并将果蝇转移至 CO2 麻醉板上。</li>
	<li>从 CO2 麻醉板上转移 10 - 20 只 virgin 雌蝇和 10 只雄蝇至一个新鲜小瓶中，在 25 °C 下培养 1 天。</li>
	<li>将这些果蝇转移至一个新的小瓶中，在 25 °C 下继续培养 12 小时。 
	注意：丢弃第一个小瓶，因为 virgin 雌蝇在第一天产卵量不足。</li>
	<li>对于 enhancer-GAL4 品系，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下继续培养至解剖阶段。</li>
	<li>对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下培养 2 - 4 天。热激前的培养时间取决于实验目的：在产卵后 2 天（AED）进行热激，可在未成熟的二龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆；在产卵后 3 或 4 天进行热激，则可在已分化的早期至中期三龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆。 
	注意：重要的是要考察不同热激时间对肿瘤表型的影响。</li>
	<li>对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，将小瓶浸入 37 °C 水浴中进行 10 - 45 分钟的热激处理，随后在 25 °C 下培养 2 - 3 天。 
	注意：各实验中的热激时长、时机及培养时间信息详见图注。</li>
</ol>
2. 幼虫解剖
<ol>
	<li>使用木棒或钝头镊子收集游走期三龄幼虫，在荧光体视显微镜下通过适当的荧光标记（例如，EGFP）鉴定其基因型，并将其放入含有PBS（磷酸盐缓冲液）的解剖皿中。</li>
	<li>用2 mL塑料移液管吸取PBS清洗幼虫。</li>
	<li>用一把镊子夹住幼虫中部，用另一把镊子将虫体撕成两半。</li>
	<li>用一把镊子夹住前半段的口钩，用另一把镊子将口部推向虫体，使虫体外翻。</li>
	<li>用镊子去除唾液腺或脂肪体等不需要的组织。</li>
</ol>
3. 固定与抗体染色
<ol>
	<li>将解剖得到的幼虫体前半部分（包括翅成虫盘）转移至1.5 mL塑料离心管中，加入1 mL固定液（含4%甲醛的PBS），于室温避光、轻柔旋转条件下固定10分钟。 
	注意：甲醛具有毒性并可能致癌。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。 
	备注：本部分所有步骤均在室温避光条件下于旋转仪上进行，除非另有说明。</li>
	<li>移除固定液并弃去。用1 mL PBT（含0.3% Triton X-100的PBS）洗涤组织，每次15分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>移除PBT，加入1 mL PBTG（含0.2%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清的PBT）进行封闭，于室温旋转孵育1小时，或于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>移除PBTG，加入用PBTG适当稀释的一抗溶液（参见材料表），于4 °C旋转孵育过夜。</li>
	<li>移除一抗溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>移除PBT，加入用PBTG适当稀释的二抗溶液（1:400）。于室温旋转孵育2小时，或于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>移除二抗溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。</li>
	<li>如需对F-肌动蛋白染色，移除PBT，加入用PBS适当稀释的鬼笔环肽（Phalloidin）溶液（1:40），旋转孵育20分钟。随后移除鬼笔环肽溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。</li>
	<li>如需对细胞核DNA进行复染，移除PBT，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（含0.5 µg/mL DAPI的PBS），旋转孵育10分钟。 
	注意：DAPI具有潜在致癌性。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。</li>
	<li>移除DAPI溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。</li>
	<li>用1 mL PBS在室温下漂洗一次，持续10分钟。</li>
	<li>移除PBS，加入500 µL 100%甘油作为预封片介质。</li>
</ol>
4. 载玻片封片
<ol>
	<li>使用2 mL塑料移液管将染色的组织置于显微镜载玻片上。</li>
	<li>用镊子将组织转移到另一张载玻片上的封片剂液滴中。</li>
	<li>用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻剥离脑组织及眼-触角原基盘。 
	注意：保留解剖得到的脑组织，并将其放置在翅成虫盘附近。脑组织可作为支撑平台，防止盖玻片压碎翅成虫盘。</li>
	<li>为分离翅成虫盘，用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻刮擦体壁并撕下成虫盘。 
	注意：若难以找到翅成虫盘，可从后向前剥离气管，翅成虫盘通常附着于气管上。</li>
	<li>轻柔地用盖玻片覆盖成虫盘，并用指甲油封片；于4 °C保存。</li>
</ol>
5. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜获取共聚焦图像时，设置图像采集参数，包括发射波长范围、激光强度、增益、偏移量、扫描速度和图像尺寸24。 
	注意：有关图像采集设置的详细步骤，请参考各显微镜制造商提供的使用说明书。</li>
	<li>为获取整个翅成虫盘的单个共聚焦光学切片，使用20倍物镜。</li>
	<li>使用40倍或60倍物镜，以0.5 - 1.0 µm的步长进行z轴堆栈扫描，获取三维图像。 
	注意：为高分辨率分析细胞表型，图像尺寸应大于512 x 512像素。</li>
</ol>
6. 使用 ImageJ 进行图像分析
<ol>
	<li>使用 Fiji（一种专注于生物图像分析的开源 ImageJ 软件，https://fiji.sc/）25 来获取和分析共聚焦 z 轴层析图像。</li>
	<li>为获取垂直切面，在 ImageJ 中打开 z 轴层析图像，并选择菜单项 &#34;Image/Stacks/Reslice&#34;。 
	注意：在 Reslice 菜单中可选择 X-Z 轴或 Y-Z 轴。也可通过在 z 轴层析图像上绘制一条直线或矩形，沿任意方向获得垂直切面。</li>
</ol>
7. 肿瘤表型的诊断
<ol>
	<li>打开从一组z轴层扫图像获得的垂直切面（X-Z或Y-Z轴），分析形态学表型和抗体染色结果。</li>
	<li>在诊断肿瘤表型时，主要关注以下三点：（1）细胞团块（包括敲低克隆）是否偏离主要上皮层；（2）该细胞团块中连接蛋白的亚细胞定位是否发生改变；（3）该细胞团块的直径是否大于4个细胞。</li>
	<li>根据图1中描述的流程图对肿瘤表型进行分类。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

GAL4-UAS 系统是用于靶向基因表达的最强大的遗传工具之一 果蝇 26 并极大地促进了肿瘤细胞的诱导与分析 体内 4该系统能够在野生型上皮组织中产生携带肿瘤抑制基因敲低或癌基因过表达的克隆，这种情况与人类癌症的早期阶段高度相似，即发生转化的促肿瘤细胞被正常上皮细胞所包围。由增强子序列调控的GAL4驱动品系，例如GAL4增强子捕获品系或Janelia GAL4品系 27 具有独特且在时空上受限的表达模式。因此，这些增强子-GAL4品系可用于在成虫盘的特定区域持续诱导肿瘤形成。此外 sd-GAL4 和 upd-GAL4 本研究中，我们证实了 lgl-由其他增强子捕获型GAL4品系诱导的基因敲低包括 engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor-blind...

上皮组织是高度有序的系统，具有显著的稳态能力，能够在发育和细胞更替过程中维持其结构完整性。然而，这种强大的自我组织系统在肿瘤发生过程中会逐渐被破坏。在肿瘤发生的初期，由于癌基因激活或抑癌基因失活，上皮层内会出现单个突变细胞。当这种转化的&#34;促肿瘤细胞&#34;逃避抑制性环境，破坏上皮组织结构并开始不受控制地增殖时，便引发肿瘤形成1。在过去的几十年中，遗传学和分子生物学领域的杰出技术进步极大地推动了癌症研究的发展。特别是近年来利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的遗传镶嵌分析工具，如FLP-FRT（翻转酶重组酶/翻转酶重组靶点）有丝分裂重组系统2和翻出式GAL4-UAS（上游激活序列）系统3，显著增进了人们对肿瘤形成及转移过程中相关遗传机制的理解4,5,6。
对一组保守序列的研究 果蝇 肿瘤抑制基因 致命性巨大幼虫 (lgl), discs large (dlg），以及 涂鸦 (scrib)，强调了上皮组织结构紊乱与肿瘤发生之间的关键关系，因为这些基因在调控上皮组织细胞的顶-基底极性和细胞增殖中发挥重要作用 7。尽管 果蝇 成体盘通常为单层上皮组织，这三个基因中任何一个的纯合突变均会导致细胞失去结构和极性，无法正常分化，过度增殖，最终形成多层无定形团块，并与邻近组织融合 7同样，这些基因在哺乳动物中的失活与恶性肿瘤的发生有关 8,9突变组织所表现出的肿瘤表型使得这三个基因被归类为保守的新生肿瘤抑制基因（nTSGs）。 7,8然而，当利用FLP-FRT介导的有丝分裂重组在发育中的野生型成虫盘中零星产生纯合nTSG突变细胞时，这些突变细胞会通过依赖c-Jun氨基末端激酶（JNK）的细胞凋亡被从组织中清除 10,11,12,13,14，挤出 15,16，或被邻近细胞吞噬和胞吞 17在这些遗传嵌合上皮中，细胞凋亡主要出现在位于克隆边界处的nTSG突变细胞中，表明邻近的正常细胞会诱导nTSG突变细胞发生凋亡 10,11,12,18最近在哺乳动物细胞中的研究证实，这种依赖细胞竞争的促肿瘤细胞清除机制是一种在进化上保守的上皮细胞抗癌症自我防御机制 19,20,21,22,23.
然而，最近一项关于果蝇（Drosophila）成虫盘的研究表明，在翅成虫盘的特定区域，镶嵌型核肿瘤抑制基因（nTSG）敲低克隆可诱导形成肿瘤性肿瘤16。肿瘤的初始形成始终出现在翅盘上皮的外周“铰链”（&#34;hinge&#34;）区域，而从未在中央“囊区”（&#34;pouch&#34;）区域中观察到，这表明nTSG敲低细胞的致瘤潜能依赖于局部微环境。中央囊区发挥着“肿瘤冷区”（&#34;tumor coldspot&#34;）的作用，其中促肿瘤细胞不会表现出发育异常性过度增殖；而外周铰链区则表现为“肿瘤热区”（&#34;tumor hotspot&#34;）16。在“冷区”（&#34;coldspot&#34;）囊区，nTSG敲低细胞从基底侧脱离并发生凋亡。相反，由于“热区”（&#34;hotspot&#34;）铰链细胞在基底侧具有坚固的细胞骨架结构网络，nTSG敲低细胞则从上皮的顶端侧脱离，并启动致瘤性过度增殖16。因此，对成虫盘中肿瘤表型的分析必须仔细考虑不同区域对致瘤刺激的特异性易感性。
本文介绍了一种利用GAL4-UAS-RNAi系统在Drosophila翅成虫盘中诱导肿瘤形成的实验方案，该方法可在正常的翅成虫盘上皮组织中产生肿瘤抑制基因（nTSG）敲低的细胞。尽管此类实验体系可用于研究癌症的早期阶段，但此前尚未明确建立一套清晰的分类方法，用以评估成虫盘上皮组织中肿瘤进展的各个阶段。因此，我们还提出了一种诊断方法，将翅成虫盘上皮中诱导产生的促肿瘤克隆表型分为三类：增生（表现为形态正常的细胞数量异常增多且增殖增强）、发育不良（由形态异常细胞构成的癌前病变组织）和肿瘤形成（由形态异常且增殖模式异常的细胞组成的良性或恶性肿瘤）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>和光</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>封片剂，Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗Dlg 4F3</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>4F3 抗 Discs large，RRID:AB_528203</td><td>在 PBTG 中按 1:40 稀释</td></tr><tr><td>小鼠抗MMP1</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>3A6B4，RRID:AB_579780</td><td>3 种抗体等量混合后，用 PBTG 以 1:40 比例稀释</td></tr><tr><td>鼠抗MMP1</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>3B8D12，RRID:AB_579781</td><td>3 种抗体等量混合，用 PBTG 按 1:40 稀释</td></tr><tr><td>小鼠抗MMP1</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>5H7B11，RRID:AB_579779</td><td>3 种抗体等量混合（1:1:1），用 PBTG 稀释至 1:40</td></tr><tr><td>鼠抗-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;微管蛋白&lt;/span&gt;</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>AA4.3，RRID:AB_579793</td><td>在 PBTG 中按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 鬼笔环肽</td><td>分子探针</td><td>A22283</td><td>用 PBS 稀释，1:40</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG抗体，Alexa Fluor 546</td><td>分子探针</td><td>A11030</td><td>在 PBTG 中按 1:400 稀释</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#8609</td><td>重组于 &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>#26796</td><td>重组于 &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>维也纳果蝇RNAi中心</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>维也纳果蝇RNAi中心</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;步骤&gt;CD2&gt;GAL4（翻转-out GAL4）&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#4780</td><td>重组于 &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>#5428</td><td>X染色体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#6658</td><td>第三染色体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇品系中心</td><td>#24650</td><td>第二染色体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#24651</td><td>第三染色体</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin 等，2001</td><td></td><td>GFP蛋白捕获</td></tr></tbody></table>

在 drosophila 幼虫盘上皮中诱导与诊断肿瘤

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

在癌症早期阶段，发生转化的突变细胞表现出细胞学异常，开始不受控制地过度增殖，并逐渐破坏组织结构。 黑腹果蝇 已成为癌症生物学中研究肿瘤发生遗传和细胞机制的常用实验模型系统。特别是，用于遗传操作的工具 黑腹果蝇 幼虫中的成虫盘（幼虫期的发育上皮组织）能够在正常上皮组织中产生转化的肿瘤前体细胞，这种情况类似于人类癌症的初始阶段。最近一项关于肿瘤发生的研究所 黑腹果蝇 然而，对翅成虫盘的研究表明，肿瘤的启动依赖于组织内在的细胞结构以及局部微环境，提示在评估成虫盘中的肿瘤表型时，需考虑不同区域对致瘤刺激的易感性差异。为便于对成虫盘中肿瘤进展的表型进行分析，本文描述了一种利用GAL4-UAS系统在翅成虫盘中诱导肿瘤性肿瘤的遗传学实验方案。此外，我们还引入了一种诊断方法，用于对成虫盘上皮中诱导产生的克隆病变表型进行分类，因为此前尚未建立能够明确区分肿瘤进展不同阶段（如增生、发育不良或肿瘤性病变）的分类方法。这些方法可能广泛适用于多种器官中肿瘤表型的克隆分析 果蝇.

通过实验诱导展示肿瘤的形成 RNA干扰介导的nTSG基因敲低 果蝇 翅成虫盘，使用了三种不同的GAL4驱动器来表达 UAS-RNAi 用于 lgl 或 scrib: (1) sd-GAL4, 在翅囊区域驱动强烈的UAS表达，在铰链区域则表达较弱（图2 和 图3A); (2) upd-GAL4, 包括背侧中褶的两个区域强表达、一个前外侧区域轻度表达以及腹侧后部区域弱表达图2 和 图3C）；以及（3）热激诱导的翻转 GAL4，可产生随机嵌合克隆并表达 UAS-基因（图4 和 图5）。在所有实验中， ...

嵌合克隆分析在 果蝇 成虫盘上皮是研究肿瘤发生遗传与细胞机制的有力模型系统。本文介绍了一种在成虫盘中诱导肿瘤的实验方案 果蝇 利用GAL4-UAS系统标记翅成虫盘，并引入一种用于分类肿瘤表型的诊断方法。

在 Drosophila 幼虫盘上皮中诱导与诊断肿瘤

在癌症早期阶段，发生转化的突变细胞表现出细胞学异常，开始不受控制地过度增殖，并逐步破坏组织结构。

本实验的总体目标是在发育中的黑腹果蝇成虫盘中产生致瘤性镶嵌克隆，并将克隆性病变分类为肿瘤发展的不同阶段。该方法有助于回答癌症建模中的一个关键问题，例如如何稳定地诱导肿瘤，以及如何对肿瘤进展阶段进行分类。该技术的主要优势在于，利用简单的果蝇遗传学方法即可完成对果蝇翅成虫盘的肿瘤注射，且肿瘤发育阶段的分类是一种简单的诊断过程。与森本健太（Kenta Morimoto）一同演示该实验步骤的，还有来自我实验室的技术员森本公美子（Kimiko Morimoto）。首先进行遗传杂交的设置。在收集 virgin 果蝇进行杂交前 12 小时，清除含有成熟蛹的试管中的所有成年果蝇。次日，设置杂交以产生基因嵌合的子代。将 12 至 20 只 virgin 雌蝇和 10 只雄蝇转移到新的试管中，在 25 摄氏度下培养一天。24小时后，将果蝇转移到新的培养管中，并丢弃其最初繁殖的第一支培养管。再过12小时后，将开始有卵出现。此后每间隔12小时将成虫转移至新的培养管中，并利用其子代进行实验。将装有卵的试剂管在25摄氏度下孵育两到四天后，使用37摄氏度水浴对幼虫进行10至45分钟的热激处理，以通过flip-out GAL4系统诱导嵌合克隆。在发育两天时进行热激，将在未成熟的成虫盘中产生克隆；而在发育三天或四天时进行热激，则将在更晚期阶段的成虫盘中产生克隆。热激后，将小管放回25摄氏度的培养箱中，直至获得三龄幼虫。开始时，使用木棒或钝头镊子将游走期三龄幼虫转移至含有PBS的培养皿中。然后在荧光灯下进行基因型鉴定，以识别嵌合幼虫的适当荧光标记。操作前，先用 PBS 清洗幼虫。然后在解剖显微镜下，用两对镊子夹住幼虫中部，将虫体撕成两半。接着夹住口钩，同时将口部向虫体内推压，使虫体翻转内翻。然后，去除不必要的组织，如唾液腺和脂肪体。幼虫现已准备好进行固定和抗体染色，具体步骤详见文中的实验方案。使用2毫升塑料移液器将染色后的组织样本转移至显微镜载玻片上。然后，使用镊子将单个幼虫移至载玻片上的一滴封片剂中。接着，用镊子分离成虫盘。先用镊子固定解剖后组织的一端，再用另一把镊子将脑和眼-触角成虫盘拉离。将脑组织保持备用。现在定位翅成虫盘。翅成虫盘附着在解剖组织的侧面。接下来，用一把镊子固定组织，轻轻刮除翅盘。然后将脑组织置于翅盘附近，以防止其被盖玻片压碎。现在，用盖玻片轻轻覆盖这些结构，并用指甲油密封盖玻片。将载玻片置于 4 摄氏度保存。使用共聚焦显微镜获取共聚焦 Z 轴层扫图像后，在 ImageJ 中打开图像，并使用“重新切片”命令创建虚拟切片。虚拟切片可在 X-Z 轴、Y-Z 轴或自定义平面上进行。要创建自定义平面，可在Z轴堆栈图像上绘制一条直线或矩形，然后按照提示让计算机生成其切面。使用此类切面来诊断组织的肿瘤表型。首先，识别出偏离主上皮层或从主上皮层突出的细胞团块。然后，针对每个肿块，判断其连接蛋白的亚细胞定位是否正常。其他需考虑的因素包括肿块的大小，以及肿块内细胞增殖是否增加的迹象。由此确定肿瘤类型。在此示例中，利用成像软件生成的垂直切片对四个克隆进行了分类。其中两个被归类为发育异常，因为标记的DLG蛋白发生错位。克隆B的大小不足四个细胞，而克隆C未偏离上皮结构。因此，B和C均未被归类为肿瘤。另外两个克隆也表现出DLG的错位定位，并在上皮外形成了肿瘤样细胞团。由于这些异位肿瘤克隆的直径超过四个细胞，故被归类为肿瘤性克隆。利用所述方法，通过由 sd-GAL4 驱动的 RNAi 在翅囊和翅 hinge 区域中对 LGL 基因进行敲低。在不含 RNAi 转基因的对照组中，三龄幼虫翅盘未出现形态学改变。在基因敲低样本中，翅 hinge 的某些区域明显出现上皮变形和肿瘤性过度生长。然而，在翅囊区域未观察到发育异常的过度生长。这与这些区域中MMP1的表达呈负相关：MMP1是一种赋予细胞转移能力的蛋白质。为了监测由LGL基因敲低诱导的肿瘤生长进程，按照所述方法在翅盘中产生了表达LGL-RNAi的散在克隆。热激二龄幼虫两天后，部分铰链区的敲低克隆出现偏离上皮层顶端侧的现象。热激诱导四天后，铰链区的发育异常病灶变得明显，提示LGL敲低克隆在脱离顶端侧后于管腔内增殖。热激诱导七天后，肿瘤样过度生长占据主导地位，集中于铰链区域。使用翻转式GAL4系统时，需注意考察改变热激时间对克隆表型的影响，因为成虫盘细胞的致瘤潜能可能依赖于发育阶段、内源性信号事件或细胞分化状态。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

诱导和诊断肿瘤<em&gt;果蝇</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

本实验方案演示了从三龄幼虫阶段的果蝇幼虫中分离成虫盘的解剖技术。在解剖后，直接在显微镜载玻片上对组织进行固定，并展示去除翅、腿和眼成虫盘的方法，以便后续观察。...

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本文介绍了一种捕获果蝇（Drosophila）原肠胚形成过程的活体成像方法。该技术使我们能够更深入地理解早期发育过程中所涉及的顶端收缩现象，并进一步分析组织结构重塑期间调控细胞运动的机制。...

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本方案旨在对细胞取向和组织生长动态进行成像与分析 果蝇 果蝇在变态过程中腹部上皮的变化。本文所述方法可应用于研究不同发育阶段、组织及亚细胞结构 黑腹果蝇...

成像与分析发育过程中组织方向性与生长动态 黑腹果蝇 蛹期上皮组织

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在 Drosophila 幼虫盘上皮中诱导与诊断肿瘤

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