从小鼠骨骼肌分离I型和II型周细胞

该程序的总体目标是使用 FACS 从骨骼肌中分离周细胞亚群。这种方法可以帮助回答周细胞生物学领域的主要问题，例如 I 型和 II 型周细胞之间的生物学差异是什么？该方案的主要优点是它允许在不使用 NG2 dsRED 转基因的情况下同时分离 I 型和 II 型周细胞。

该协议的应用不仅限于骨骼肌。它还可用于从其他器官（如大脑）中分离周细胞。首先，首先从巢蛋白-GFP 转基因小鼠获得所需的组织，然后在含有抗生素的冰冷 PBS 中洗涤组织两次。

然后将样品转移到无菌的 10 厘米板中。接下来，使用无菌剪刀和刀片，将肌肉切成一到两毫米的立方体。如果需要，添加少量 DMEM 以防止组织变干。

通过 10 毫米血清移液管上下移液组织以机械破坏它。然后，向混合物中加入新鲜的消化溶液，即补充有 0.2% 2 型胶原酶的 DMEM，并将样品在 37 摄氏度下以 35 RPM 孵育 2 小时。孵育 2 小时后，用 18 号针头滴定混合物，并以 500 x g 离心所得悬浮液 5 分钟。

然后，将沉淀重悬于 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 中，并将样品在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。接下来，加入 10 毫升添加 20% FBS 的 DMEM，并以 500 x g 的速度离心样品 5 分钟。沉淀后，将细胞重悬于 10 mL 红细胞裂解缓冲液中，并以 500 x g 的离心速度旋转悬浮液 5 分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml 分选缓冲液中。然后，通过 40 微米细胞过滤器过滤混合物，并将获得的单细胞悬液以 500 x g 的速度再次离心 5 分钟。将沉淀的细胞重悬于一毫升分选缓冲液中，用血细胞计数器计数，并进一步稀释以获得每毫升细胞的 5 乘以 10 至 6 个细胞的悬浮液。

在细胞分选之前，按照文本方案中的说明准备对照并对样品进行染色。打开分拣机和软件，当询问时，扫描并插入 100 微米的分拣芯片。然后，加载自动设置微珠以执行自动设置。

自动设置完成后，打开 Experiment 选项卡，然后单击 Blank Template。接下来，在 Measurement Settings 中，为 FL1 输入 DAPI，为 FL2 输入 Nestin-GFP，为 FL3 输入 PDGFR-beta，并取消选中其余通道的复选框。激活 405、488 和 561 激光器，然后单击 Create New Experiment（创建新实验）。

然后，单击 Start Compensation Wizard 选项，然后按照 Compensation Wizard 软件命令进行作。加载未染色的对照后，单击"开始"，然后选择"检测器阈值设置"以设置 FSC 和 BSC 检测器的传感器增益，并在刻度上可视化种群。调整荧光通道的增益水平，将阴性群体定位在直方图的左侧，然后单击 Record 按钮记录数据。

当软件询问时，加载单色控件，然后单击 Start 开始 和 Record 记录数据。然后，在直方图中对正总体进行门控，然后单击 Next。要执行补偿，请打开补偿选项卡，选择计算矩阵，然后打开计算补偿设置面板并单击计算。

计算完成后，单击 Finish 关闭 Compensation Wizard。现在已经进行了补偿，加载 PDGFR-β 染色的 FMO 对照。单击 Start（开始）。

在 All Events 图中，双击 Gate A 以生成子总体图。然后，将子图的 y 轴分配给 DAPI，并绘制仅包含活细胞的门 B。创建另一个子图后，将其 x 轴分配给 FSC-H，将其 y 轴分配给 FSC-W，并在单个细胞群周围绘制门 C。

对于门 C，生成 PDGFR-β 与 Nestin-GFP 的子图。然后，点击 Record 按钮记录数据。最后，加载样本，记录数据，然后单击 Pause（暂停）以保留样本。

为 PDGFR-β 阳性和 Nestin-GFP 阳性细胞设置门控边界，并为 I 型和 II 型周细胞群创建门控。这里显示了 PDGFR-β-PE-FMO 对照中 I 型和 II 型周细胞的门控边界。在 Sorting Method 选项卡中，选择 Two Way Tubes 并将 I 型和 II 型周细胞分配给左侧和右侧收集管。

将预先填充了 5 mL 分选缓冲液的 15 mL 收集管放在收集台上，然后单击 Load Collection（加载收集）按钮。单击 Resume 按钮运行样本，然后单击 Start Sort 收集单元格。分选后，将细胞以 500 x g 离心 5 分钟。

所得沉淀重悬于一毫升周细胞培养基中，并在血细胞计数器中计数细胞。将两种类型的周细胞接种在 24 孔板中，该板含有预涂有聚-D-赖氨酸的盖玻片，密度约为每平方厘米 10 至 4 个细胞的 1 倍。将细胞在 0.5 毫升周细胞培养基中于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 3 天。

孵育 3 天后，检查周细胞形态，并在荧光显微镜下评估它们巢蛋白 GFP 的内源性表达。然后，用 0.5 mL 的成脂或肌原培养基替换周细胞培养基以启动细胞分化。每两到三天更换一次培养基。

分化 14 天后，对周细胞进行染色以观察 perilipin 和 s-myosin 并在荧光显微镜下对细胞进行成像。这里展示的是 I 型和 II 型周细胞的显微镜图像，分离后，它们在周细胞培养基中生长了 3 天。I 型周细胞的特征是圆形细胞体，突起短，缺乏内源性 GFP 表达。

II 型周细胞具有小细胞体，具有长而薄的过程，并显示出内源性 GFP 表达。当两种细胞类型在双细胞生成培养基中培养时，I 型周细胞分化为脂肪细胞，脂肪细胞标志物 perilipin 的显着表达证明了这一点。相反，II 型周细胞对二序细胞分化没有反应。

最后，两种类型的周细胞都显示出对生肌培养基的不同反应。I 型周细胞没有分化成肌细胞，而 II 型周细胞形成肌管，如 s-肌球蛋白阳性染色所证明的那样，证实了它们的肌原活性。在尝试此过程时，请务必包括 FMO 控件以确定门控边界。

看完这个视频，你应该对如何通过荧光激活细胞分选从骨骼肌中分离 I 型和 II 型周细胞有了很好的了解。