Name: 肌肉干细胞中自噬的原位免疫荧光染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习原位免疫荧光染色技术检测肌肉干细胞中的自噬过程。该方法使用LC3标记和MyoD抗体，可在小鼠骨骼肌再生过程中监测卫星细胞的自噬活性，为组织再生研究提供可靠的实验方案。

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本工作由NIAMS AR064873和Epigen项目PB. P01.001.019/Progetto Bandiera Epigenomica IFT资助，授予L.L.。

小鼠的繁育和饲养均按照标准动物实验设施操作规程进行，所有实验方案均经动物福利保证机构及内部动物研究伦理委员会批准，符合意大利卫生部以及《美国国立卫生研究院实验室动物护理与使用指南》的要求。
1. 肌肉损伤与 在体 内 自噬流阻断
<ol>
	<li>肌肉损伤。
	<ol>
		<li>为诱导急性骨骼肌损伤，将20 µL浓度为10 µM的心肌毒素（CTX）原液直接注射至约20 g重的2月龄C57BL/6J小鼠的左侧胫骨前肌（TA）中。使用数量相等的雄性和雌性小鼠。以未受干扰的对侧肢体作为对照。 
		注意：10 µM CTX的0.9%氯化钠溶液应经0.22 µm PVDF滤膜过滤，并储存于-20 °C。避免反复冻融。</li>
		<li>使用带有30 G针头的胰岛素注射器，将CTX注射至TA肌肉中部。为在TA肌中精确诱导损伤，确保注射器针头从肌肉底部至顶部穿入，靠近远端肌腱处，深度为5 mm（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在未受干扰及损伤小鼠中阻断自噬流。
	<ol>
		<li>为评估自噬流，在损伤后24小时（p.i.），通过腹腔（IP）注射方式，每24小时给予50 mg/kg氯喹（CLQ），持续4天（图1B）。
		<ol>
			<li>将CLQ（10 mg/mL）溶解于1× PBS中，并通过0.2 µm滤膜过滤。称量每只小鼠体重，并计算所需注射的CLQ剂量。 
			注意：CLQ溶液应于当日配制并使用。CLQ原液可在-20 °C保存最多一个月。由于自噬是一个与代谢相关的过程，CLQ处理应在每天相同时间进行（即&#160;上午10点前）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肌肉组织切片
<ol>
	<li>小鼠处死。
	<ol>
		<li>在损伤后第5天处死小鼠。</li>
		<li>采用颈椎脱臼法或CO2窒息法实施安乐死（随后需进行颈椎脱臼以确认死亡）。由于自噬过程与小鼠的睡眠/进食习惯相关，应始终在相同时间处死小鼠，最好在早晨（i.e.&#160;上午10点前）进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胫骨前肌（TA）的分离与包埋。
	<ol>
		<li>解剖前，用70%乙醇喷洒小鼠体表。</li>
		<li>使用剪刀在小鼠髋部水平的背部皮肤上做一个垂直的小切口（长约3 mm）。剪去尾巴和足部以简化去皮操作。将皮肤向尾部方向拉下并去除，以暴露下方肌肉；TA肌肉易于定位，如图2A所示。</li>
		<li>借助两把镊子，夹住远端肌腱。</li>
		<li>切断远端肌腱；TA肌与趾长伸肌（EDL）的肌腱常一并切断，之后再行分离（见步骤2.2.6）。</li>
		<li>用镊子夹住TA肌肉的肌腱，小心地将肌肉向近端（靠近膝盖方向）提起（图2B）。 
		注：此时EDL与TA肌肉已可清晰辨认，TA肌肉较EDL更大且位置更表浅。</li>
		<li>通过将两个远端肌腱向相反方向牵拉，将TA肌肉与EDL肌肉分离（图2C）。</li>
		<li>切断近端肌腱。</li>
		<li>用镊子小心去除覆盖在肌肉表面的薄层筋膜，避免损伤组织。</li>
		<li>用纸巾吸除样本上多余的水分。确保肌肉既不过湿也不过干，因为过多水分会对肌肉造成显著损伤，并影响后续染色效果。</li>
		<li>在模具底部加入适量最佳切割温度（OCT）包埋剂，将肌肉按图2D所示方向放入其中。向烧杯中加入100%异戊烷，使其深度达到约3–4 cm。将烧杯置于聚苯乙烯盒中并与液氮接触。</li>
		<li>注意不要让液氮进入烧杯，否则会产生气泡泡沫，可能影响包埋效果并损坏肌肉切片。</li>
		<li>观察异戊烷状态，等待其冷却至适当温度（-140 °C至-150 °C之间）；当达到合适温度时，烧杯底部会形成一层固态白色结晶的冷冻异戊烷。</li>
		<li>若异戊烷完全冻结成固体，需将其融化后再重新冷却至冰点温度，方可进行下一步操作。</li>
		<li>使用预冷的镊子，将模具轻柔地浸入异戊烷中约20–30秒。将冷冻后的样本放入装有干冰的容器中，直至转移至-80 °C冰箱保存。 
		注：本步骤可暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌肉组织冷冻切片。
	<ol>
		<li>样本在-80 °C条件下保存至少一晚后，进行冷冻切片。</li>
		<li>从-20 °C冰箱中取出冷冻切片机刀片和防卷板，安装至冷冻切片机舱内的相应支架上。</li>
		<li>在样本头（stub）上滴加一滴OCT包埋剂，将冷冻样本以垂直南北方向放置其上，方向如图2D所示。</li>
		<li>将样本头固定在夹持器（chuck）上。</li>
		<li>在未放下防卷板的情况下，先以40 µm厚度进行若干次切片，以去除不含肌肉组织的OCT部分。当肌肉组织开始出现时，将切片厚度调整为7–8 µm。</li>
		<li>放下防卷板，使其与刀刃边缘对齐或略高于刀刃。</li>
		<li>切取7–8 µm厚的横截面切片，每张组织学载玻片贴附3–4片切片。 
		注：建议冷冻切片机温度设定在-15 °C至-23 °C之间。后续分析需要获取样本的横截面，以便准确定位卫星细胞龛位中的肌肉干细胞。</li>
		<li>为增强切片在载玻片上的附着性，将载玻片在室温下静置10–15分钟，以防在抗体孵育过程中脱落。 
		注：空气干燥步骤可能影响免疫染色结果，导致结果不明确。载玻片可在未固定状态下于-80 °C保存数月。本步骤可暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色检测TA肌肉冷冻切片中的肌肉损伤情况。
	<ol>
		<li>为评估肌肉质量（i.e.&#160;损伤效果、肌肉分离与包埋及冷冻切片的质量），进行H&amp;#38;E染色。针对每个实验时间点，取一张载玻片用4%多聚甲醛（PFA）固定10分钟。固定后，用多次更换的1×PBS充分洗涤载玻片。 
		注：注意。PFA具有致癌性，操作时须谨慎。</li>
		<li>每个实验时间点取一张载玻片，放入染色缸中。</li>
		<li>向染色缸中加入9 g/L苏木精溶液，直至完全覆盖切片，孵育8分钟。</li>
		<li>回收苏木精染液。</li>
		<li>将染色缸置于流动水下冲洗10分钟，以去除多余苏木精。 
		注：确保水流不直接冲击切片表面。</li>
		<li>用无菌水洗涤。</li>
		<li>用酸化90%乙醇配制的0.5%（w/v）伊红溶液孵育切片1分钟。</li>
		<li>回收伊红染液。</li>
		<li>用无菌水洗涤两次，每次3分钟。 
		注：以下步骤应在化学通风橱中进行。</li>
		<li>用70%乙醇洗涤切片。</li>
		<li>用90%乙醇洗涤切片。</li>
		<li>用100%乙醇洗涤切片。</li>
		<li>用0.879 g/mL邻二甲苯孵育切片。 
		注：注意。邻二甲苯易燃且具有中等毒性。操作时应在化学通风橱内进行，并佩戴防护装备，包括手套、实验服和口罩。</li>
		<li>回收邻二甲苯。</li>
		<li>将载玻片置于纸张上晾干。</li>
		<li>使用快干型、二甲苯基封片剂封固载玻片。</li>
		<li>在光学显微镜下以10倍物镜检查切片质量（见图3） 
		注：本步骤可暂停。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 受损肌肉组织切片中LC3和MyoD的免疫染色
<ol>
	<li>肌肉组织切片的固定。
	<ol>
		<li>通过润湿一张滤纸并将其置于可密封的塑料盒底部，制备一个孵育室，以维持室内高湿度。用含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液固定组织切片，孵育10分钟。 
		注意：使用湿润的滤纸可防止样品干燥。请现配新鲜PFA溶液，或使用储存于-20 °C的PFA溶液。警示：PFA具有毒性；配制储备液时必须小心操作粉末。该操作必须在化学通风橱中进行，并佩戴防护装备，包括手套、实验服和口罩。此外，PFA溶液也需谨慎操作。</li>
		<li>移除PFA溶液，用1×PBS洗涤切片5–7分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌肉组织切片的通透处理。
	<ol>
		<li>使用疏水笔（pap pen）在组织切片周围画出疏水屏障。 
		注意：此步骤用于界定组织切片周围的区域，以减少步骤3.4、3.6、3.7和3.9中抗体的使用体积。</li>
		<li>向切片上加入200 µL冷的（-20 °C）甲醇，并将孵育室水平放入-20 °C冰箱中孵育5分钟。</li>
		<li>从冰箱中取出孵育室，吸除甲醇，用1×PBS在室温下洗涤切片5–7分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭。
	<ol>
		<li>在1×PBS中配制含4%牛血清白蛋白&#160;（BSA）的新鲜封闭液。 
		注意：BSA溶液可在4 °C保存最多1周。</li>
		<li>用封闭液在室温下孵育切片至少60分钟。</li>
		<li>移除封闭液。</li>
		<li>用1×PBS稀释抗Fab抗体至20 µg/mL，配制100 µL抗Fab混合液。用未标记的抗小鼠IgG亲和纯化F(ab)片段在室温下孵育切片1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育。
	<ol>
		<li>每张切片用100 µL混合液，将LC3和MyoD抗体溶于含4% BSA的1×PBS中，配制一抗混合液。使用5 µg/mL抗LC3（兔多克隆抗体）和10 mg/L抗MyoD（小鼠单克隆抗体）。将一抗混合液在4 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤。
	<ol>
		<li>移除一抗混合液。</li>
		<li>用含1% BSA的1×PBS洗涤切片10分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育。
	<ol>
		<li>每张切片用100 µL混合液，将山羊抗兔488（5 µg/mL）和山羊抗小鼠594（5 µg/mL）溶于含4% BSA的1×PBS中，配制二抗混合液。 
		注意：避免过度暴露于光线下，以防荧光染料淬灭。后续步骤应在避光条件下进行。</li>
		<li>用二抗混合液在室温下孵育切片45分钟。</li>
		<li>移除二抗混合液，用1×PBS洗涤切片5–7分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育。
	<ol>
		<li>每张切片用100 µL混合液，将层粘连蛋白-2（α-2链）单克隆抗体（0.33 µg/mL）溶于含4% BSA的1×PBS中。将切片在室温下用一抗混合液孵育1–2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤。
	<ol>
		<li>移除一抗混合液。</li>
		<li>用含1% BSA的1×PBS洗涤切片10分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育。
	<ol>
		<li>每张切片用100 µL混合液，将山羊抗大鼠647（5 µg/mL）溶于含4% BSA的1×PBS中，配制二抗混合液。将切片在室温下用二抗混合液孵育45分钟。</li>
		<li>移除二抗混合液，用1×PBS洗涤切片5–7分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育。
	<ol>
		<li>每张切片加入200 µL含300 nM DAPI的1×PBS溶液，在室温下孵育5分钟。DAPI溶液应避光保存于4 °C。</li>
		<li>用1×PBS洗涤切片5–7分钟；重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色后肌肉切片的封片。
	<ol>
		<li>去除切片上多余的洗涤液。</li>
		<li>在切片中央滴加10 µL甘油与1×PBS按3:1比例混合的封片剂，加盖盖玻片，避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜图像采集
<ol>
	<li>使用配备图像采集系统和分析软件的四激光共聚焦显微镜获取图像。 
	注意：MyoD 与 594 染料偶联，该染料为亮红色荧光染料，其激发波长最适合 594 nm 激光（激发：590 nm，发射：617 nm）。LC3 与 488 染料偶联，该染料为亮绿色荧光染料，其激发波长最适合 488 nm 激光线（激发：495 nm，发射：519 nm）。Laminin 与 647 染料偶联，该染料为亮远红荧光染料，其激发波长最适合 647 nm 激光线（激发：650 nm，发射：668 nm）。</li>
	<li>将切片放入显微镜载物台，使用 63X 放大倍数检测核信号。通过定位活跃再生区域的视野中心，手动聚焦于再生区域，依据肌肉形态学特征进行判断（见图 4）。 
	注意：在未受干扰的肌肉中，肌纤维大小几乎恒定（图 4A）；而损伤介导的肌肉再生则表现为出现较小的肌纤维，即再生后新形成的纤维。此外，处于活跃再生状态的肌肉具有广泛的浸润特征，主要由巨噬细胞、成纤维-脂肪生成前体细胞以及定位于受损肌肉组织以协调肌肉再生的其他细胞组成（图 4B）。</li>
	<li>通过聚焦位于肌纤维基底膜下方的肌肉干细胞（MuSCs），评估再生区域的免疫荧光染色情况。</li>
	<li>重点关注 MyoD 染色阳性且位于 laminin 染色标记的肌纤维内部的 MuSCs（见图 4B，白色箭头）。</li>
	<li>每实验组至少使用 3 只小鼠，并使用显微镜对每组至少 7 个视野采集 63X 放大倍数的图像。</li>
	<li>确定再生区域后，先依据 DAPI 染色进行聚焦，然后调节其他各单通道参数。
	<ol>
		<li>使用以下显微镜设置：A594 通道，针孔 1.2 Airy 单位，增益 791；A488 通道，针孔 1.6 Airy 单位，增益 659；A647 通道，针孔 1.4 Airy 单位，增益 719。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节各单通道焦距后，以 1,024 × 1,024 像素帧尺寸和 12.61 µs 像素驻留时间采集图像。</li>
	<li>统计位于基底膜下方且 MyoD 染色阳性的细胞中 LC3 阴性细胞所占百分比，以及 MyoD 阳性细胞中显示 LC3 信号的细胞所占百分比。 
	注意：表现出 LC3 染色的 MyoD 阳性细胞所占百分比是本实验方案的检测指标。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本方案描述了如何在代偿性肌肉再生过程中监测骨骼肌干细胞中的自噬。我们尝试了多种用于LC3和MyoD共染色的抗体，此处列出了在小鼠组织切片中有效并能获得成功结果的抗体（见材料表）。为获得成功的染色效果，强烈推荐使用甲醇进行透化处理（见步骤3.2.2）。
该方案的局限性与小鼠本身的固有变异性有关，因此每个实验组至少需要使用3只小鼠。这一方法学在骨骼肌再生过程中自噬研究方面迈进了一步，因为迄今为止大多数研究结果均基于分离细胞获得。in situ 分析使得能够在天然环境中研究自噬，而无需进行可能影响自噬等代谢过程的细胞分离步骤。
鉴于自噬过程具有高度动态性，CLQ 处理是监测自噬过程的关键步骤 体内 CLQ 阻断自噬过程的后期阶段，当自噬持续进行时会导致 LC3 积累。因此，CLQ 处理可使 LC3 被检测到 原位 检测。在未受干扰的骨骼肌中，基础自噬过程不会因CLQ处理而进一步增强，这表现为无法检测到LC3的积累。然而，在再生肌肉中，CLQ处理可...

骨骼肌再生是成体干细胞（肌肉卫星细胞，MuSCs）与其他参与再生过程的细胞类型相互作用的结果。肌肉的稳态和功能由肌肉微环境信号与系统性信号共同调控1,2。在整个生命周期中，已有研究报道MuSC功能、肌肉微环境以及系统性信号均会发生变化，导致老年人群功能能力下降3。MuSC位于基底膜下方的微环境之中，在肌肉损伤后被激活，以修复受损的肌肉组织4,5。为了确保有效的再生反应，MuSC必须协调一系列关键过程，包括退出静息状态、自我更新、增殖扩增，以及随后的成肌分化6。在老年人群及慢性肌肉疾病患者中，这些功能均受到损害，从而导致肌肉功能异常2,3,6,7,8,9,10,11,12,13。
巨自噬（下文简称自噬）正被视为一种对维持组织稳态至关重要的生物学过程14。自噬过程涉及多种运输机制，细胞质成分、细胞器和蛋白质被包裹进囊泡中，最终通过溶酶体途径降解，从而促进有毒分子的清除以及大分子的循环利用。这为细胞和组织在应激或其他不利条件下提供富含能量的化合物以支持其适应性15,16。除了发挥促进细胞存活的作用外，自噬还可能诱导细胞死亡，其作用取决于细胞组织环境（例如，正常组织与癌组织）以及应激刺激的类型17,18。
最近的证据表明，自噬对于维持肌肉质量和肌纤维完整性是必需的19,20，并且已有报道指出，自噬在多种肌营养不良症中出现功能障碍21,22,23，包括杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）24,25,26,27,28,29,30。同样，自噬过程的进行性减弱已在老年人群中被观察到31,32,33,34,35，伴随肌肉质量的丢失（称为少肌症）32,33,34,35,36,37，以及在肌纤维存活能力方面也有所体现38。
自噬与骨骼肌再生潜能之间的密切关系在此前由Wagers实验室的一项研究中得到预期，该研究表明热量限制可增强肌肉干细胞（MuSC）的可用性与活性39这一观点进一步得到了最近观察结果的支持，即Foxo3-Notch轴在自我更新过程中可激活自噬过程。40 并使肌肉干细胞从静息状态转变为增殖状态41这些数据与从年轻到老年及高龄小鼠肌肉干细胞（MuSCs）中基础自噬作用进行性下降的结果一致，并且与衰老过程中MuSCs数量和功能的衰退相关。42.
在最近的一项研究中，我们证明了自噬与杜氏肌营养不良症（DMD）进展早期所特有的代偿性肌肉再生之间存在密切关系。相应地，我们观察到在疾病进展的后期阶段，当肌肉再生能力受损并出现纤维化组织沉积时，自噬流显著减弱。有趣的是，我们发现，在肌肉再生条件下，自噬在肌肉干细胞（MuSCs）中被激活，且调控自噬过程会影响MuSCs的活化能力及其功能30。
总体而言，这些数据凸显了在正常和病理条件下以及整个生命周期中，探索肌肉干细胞（MuSCs）在肌肉再生过程中自噬活动的紧迫性。本文提供了一种通过在肌肉再生条件下检测 MuSCs 中自噬过程的实验方案 原位 免疫染色检测微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3），一种自噬标志物43，以及对照组和损伤小鼠肌肉组织切片中成肌谱系标志物 MyoD 的检测。所报道的方法可用于监测特定细胞区室——即肌肉干细胞（MuSC）中的自噬过程，而 MuSC 在调控肌肉再生中发挥关键作用。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td>野生型小鼠</td></tr><tr><td>心脏毒素1</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td></td></tr><tr><td>Millex-VV</td><td>默克密理博</td><td>SLVV033RS</td><td>注射器滤器单元，0.1 &amp;micro;m，PVDF，33 mm，伽马射线灭菌</td></tr><tr><td>磷酸氯喹</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>注意：&lt;br/&gt; 吞食有害</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine + 0.5 mL</td><td>BD</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold 中号模具</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>苏木精溶液，Harris改良型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y溶液，醇溶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>邻二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1040</td><td>注意：&lt;br/&gt; 易燃液体和蒸气；吞食并进入呼吸道可能致命；皮肤接触有害；可能引起呼吸道刺激；造成严重眼刺激</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>注意：&lt;br/&gt; 易燃固体；吞食有害；造成皮肤刺激；可能引起过敏性皮肤反应；造成严重眼损伤；可能引起呼吸道刺激；怀疑可致癌</td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt — 快干型封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab片段山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>LC3B抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2775</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗MyoD&lt;br/&gt;（浓缩型），克隆5.8A</td><td>DAKO - 安捷伦病理解决方案</td><td>M3512</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白-2（&amp;alpha;-2链）单克隆抗体</td><td>Enzo生命科学</td><td>4H8-2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔IgG（H+L）</td><td>Life technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Life technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 山羊抗大鼠IgM抗体</td><td>Life technologies</td><td>A21248</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

原位 肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

越来越多的证据表明，自噬是一种维持组织稳态的关键调控过程。已知自噬参与骨骼肌的发育与再生，且在多种肌肉疾病及与年龄相关的肌肉功能障碍中均观察到自噬过程的改变。最近研究发现，在肌肉修复过程中，卫星细胞功能耗竭与自噬过程受阻相关，这进一步支持了活跃的自噬与有效的肌肉再生密切相关这一观点。这些数据揭示了自噬在正常及病理条件下（如肌营养不良症）肌肉再生过程中对卫星细胞活化的关键作用。本文提供了一种在成年肌肉干细胞（MuSC）区室中监测肌肉再生状态下自噬过程的实验方案。该方案详细描述了实施该检测的建立方法 原位 在对照组和损伤小鼠的肌肉组织切片中进行自噬标志物LC3与成肌谱系标志物MyoD的免疫荧光成像。所报道的方法可用于监测特定细胞区室——即在调控肌肉再生过程中发挥核心作用的肌肉干细胞（MuSC）区室——中的自噬过程。

本方案描述了一种在肌肉再生过程中高效检测肌肉干细胞（MuSCs）自噬的in situ方法。
CTX 体内 处理：
使用 CTX 诱导胫骨前肌（TA 肌）肌肉损伤，并以未受干预的肌肉作为对照。由于自噬过程具有高度动态性，需通过腹腔注射 CLQ 来阻断自噬流（图 1）。CLQ 处理对于评估自噬流是否处于活跃状态或维持在基础水平至关重要。
胫骨前肌分离：
按照图2</stro...

活跃的自噬作用与有效的肌肉再生密切相关，而肌肉再生对于肌肉干细胞（MuSC）的活化至关重要。本文提供了一种 原位 检测对照组和损伤小鼠肌肉组织切片中 MyoD 阳性肌卫星细胞（MuSCs）内自噬标志物 LC3

越来越多的证据表明，自噬是维持组织稳态的关键调控过程。已知自噬参与骨骼系统……

本免疫荧光染色方案的总体目标是监测骨骼肌再生过程中肌肉卫星细胞内的自噬过程。该方法有助于解答组织再生领域中的关键问题，例如理解自噬在肌肉再生中的作用，以及在卫星细胞中监测自噬活动。该技术的主要优势在于，能够在未受干扰和受损肌肉的组织切片中直接检测卫星细胞内的自噬过程。本实验操作将由我实验室的优秀学生Francesco Castagnetti进行演示。为诱导急性骨骼肌损伤，使用配备30号针头的胰岛素注射器，吸取20微升无菌过滤的10微摩尔心脏毒素储备液。将心脏毒素直接注射到数量相等的雄性和雌性两个月龄、约20克重的C57黑六小鼠的左侧胫骨前肌中。为了评估自噬流，从损伤后24小时开始，通过腹腔注射给予每千克体重50毫克的氯喹，每24小时一次，持续四天。氯喹处理至关重要，因为它可在自噬流活跃的条件下导致LC3的积累并使其可被检测。损伤后第五天，用70%乙醇润湿动物。使用剪刀在小鼠髋部水平的背部皮肤上做一个三毫米的垂直切口。将皮肤向尾部方向牵拉，以暴露下方的肌肉，辨认胫骨前肌。用镊子夹住胫骨前肌的肌腱，小心地将肌肉向膝关节方向提起。然后将两条远端肌腱向相反方向牵拉，使胫骨前肌与趾长伸肌分离，并切断近端肌腱。使用镊子去除覆盖在肌肉上的薄层筋膜，注意不要损伤组织。用纸巾除去样本上多余的水分。将切除的肌肉置于含有最佳切割温度包埋剂的组织模具中央。使用预冷的镊子将模具小心放入液氮冷却的异戊烷中，冷冻 20 至 30 秒。然后将冷冻样品置于 -80 °C 下保存。在 -80 °C 至少放置过夜后，将恒冷箱切片机温度设置在 -15 至 -23 °C 之间，并用一滴最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物）将肌肉样品固定于恒冷箱切片机的样品头，使组织大部分朝向样品头的上方。然后获取7到8微米厚的切片，每张载玻片收集3到4个组织切片。所有切片完成后，将组织样本在空气中干燥10至15分钟，随后进行苏木精和伊红染色。在光学显微镜下以10倍放大倍数检查切片的质量。在孵育 chamber 中用 4% 多聚甲醛固定样本。10 分钟后，用 PBS 洗涤 4 次，每次 5 至 7 分钟，去除固定液。然后使用疏水性笔在组织切片周围画出屏障。加入 200 µL 预冷至 -20°C 的甲醇覆盖切片，在 -20°C 条件下孵育 5 分钟。甲醇通透处理至关重要，因其有助于良好保留 LC3 染色信号。随后，按前述方法用 PBS 洗涤切片四次。用未标记的亲和纯化抗小鼠IgG FAB片段在室温下封闭组织样本，封闭时间至少60分钟。孵育结束后，在4°C条件下，将样本与100微升一抗混合液共同孵育过夜。次日早晨，用含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤四次。然后在避光条件下于室温孵育样品，使用适当的二抗混合液，孵育时间为45分钟。二抗孵育结束后，用PBS洗涤切片四次，每次洗涤5至7分钟。随后在避

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肌肉干细胞中自噬的原位免疫荧光染色

通过荧光标记的自噬标志物进行延时显微成像，可实现对动态自噬反应的高时间分辨率监测。结合三种不同颜色的特异性自噬和细胞器标志物，我们能够在稳定的空间和时间背景下追踪某蛋白质在自噬体形成过程中的作用。...

活细胞成像观察早期自噬事件：omegasome 及其相关过程

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg...

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.

损伤诱导的衰老评估 在体 内 骨骼肌中的重编程

准确鉴定卫星细胞对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文介绍了一种通过基于免疫荧光染色的方法在成年骨骼肌切片上鉴定卫星细胞的实验方案。...

利用Pax7和层粘连蛋白抗体通过免疫荧光鉴定骨骼肌卫星细胞

本文介绍了一种对肌肉冷冻切片中坏死肌纤维进行直接免疫标记的实验方案。坏死细胞对血清蛋白具有通透性，包括免疫球蛋白G（IgG）。通过显示肌纤维对IgG的摄取，可识别并定量发生坏死的肌纤维，且不受肌肉状态的影响。...

免疫标记肌肉活检中的肌纤维变性

本方案描述了一种体外培养和功能分析肌肉干细胞的方法，该方法可保留肌肉干细胞与其内源性微环境之间的大部分相互作用。...

单根肌纤维培养实验用于体外评估成年肌肉干细胞功能

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

骨骼肌包含多种细胞类型，包括定居的干细胞，每种细胞均对肌肉稳态和再生具有特定贡献。本文介绍肌肉干细胞及其细胞微环境的二维培养方法 离体 保持许多生理学特征的环境...

小鼠骨骼肌未分级批量培养以重现微环境与干细胞静息状态

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习原位免疫荧光染色技术检测肌肉干细胞中的自噬过程。该方法使用LC3标记和MyoD抗体，可在小鼠骨骼肌再生过程中监测卫星细胞的自噬活性，为组织再生研究提供可靠的实验方案。

原位肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

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原位 肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

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原位肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色