全自动毛细 Electrophoretic-based 免疫分析方法的程序和关键优化策略

利用商用平台检测总蛋白制剂中靶蛋白的 capillary-based 免疫分析方法。另外, 对细胞培养模型系统进行了暴露时间、蛋白质浓度和抗体稀释度的测定参数的优化。

该程序的总体目标是使用商业平台演示毛细管电泳免疫测定。该平台将区分和定量来自细胞培养组织和生物流体的生物样品中的蛋白质靶标。该过程根据大小从 2 到 440 道尔顿不等来检查蛋白质。

与传统程序（如 Western 印迹）相比，这种自动化程序的优势在于，毛细管电泳免疫测定无需凝胶、转印装置和手动洗涤。此外，所需的蛋白质绝对量大约少 10 倍，使该程序成为稀有细胞类型或有限样品的理想选择。此外，使用自动化系统可在短短 3 小时内获得结果，并且已被证明比传统的 Western 印迹程序更具定量性和可重复性。

根据制造商的产品说明书，从试剂盒中制备样品和试剂，包括样品缓冲液、二硫苏糖醇、荧光预混液和生物素化分子量标准。使用您最喜欢的方法制备蛋白质样品。在这里，我们从 BEAS-2B 细胞培养物中分离出全细胞提取物。

用样品缓冲液稀释蛋白质样品。将一份 5-X 荧光预混液与 4 份稀释样品混合，以达到所需的最终蛋白质浓度。显示了一个示例计算，从每微升 1.2 微克/微升的蛋白质储备浓度开始，制备 70 微升 0.2 微克/微升的最终蛋白质浓度。

预混液为总体积的 1/5，在本例中为 14 微升。要计算所需蛋白质原液的体积，请将所需的最终浓度乘以总体积，然后除以蛋白质原液浓度。从总体积中减去预混液和储备液体积，以计算样品缓冲液的体积。

95 摄氏度下加热 5 分钟，使制备的样品和分子量标准变性。请注意，某些蛋白质可能需要更温和的变性条件。例如，70 度 10 分钟以防止蛋白质聚集并改善迁移。

如果在较高分子量处存在严重拖尾，请考虑此选项。在提供的稀释剂中制备所需的抗体稀释液。请注意，与传统的 Western 印迹相比，抗体通常以更高的浓度用于基于毛细管的免疫测定。

每次使用时准备新鲜的鲁米诺和过氧化物的一对一混合物。使用模板中显示的体积将样品和试剂移液到检测板中。颜色编码表示试剂和样品正确加载到检测板中。

将生物素化分子量标准移液至 A1 孔，将制备的样品移至孔 A2 至 A25。提供的抗体稀释剂用于 B1 至 B25 孔和 C1 孔。C2 至 C25 孔的一抗。链霉亲和素 HRP 到 D1 孔。孔 D2 至 D25 的二抗。

将鲁米诺-过氧化物混合物混合至孔 E1 至 E25。将洗涤缓冲液添加到较大的中板孔的前三行中。打开毛细管免疫分析仪并打开随附的软件。

根据制造商的说明将毛细管柱和检测板装入机器中并开始运行。运行完成后，检查荧光标准品是否被正确识别，并在必要时进行校正。此外，验证生物素化分子量标准是否显示所用试剂盒的正确分子量测定峰。

有关更多详细信息，请参阅制造商的快速参考指南或产品手册。优化检测条件（如暴露时间、蛋白质浓度和抗体稀释度）对于获得准确、可重现的结果非常重要。这些条件特定于每个模型系统抗体组合，因此应针对每个新测定确定。

生成定量结果的能力取决于对鲁米诺底物未快速耗尽的曝光时间的分析，因为底物耗尽会导致信号丢失或信号耗尽。这可以通过检查不同化学发光曝光时间的数据来确定，如图 2 所示。使用所用仪器的曝光时间从 5 秒到 480 秒不等。

泳道视图显示，用 1 比 500 稀释度的 p53 DO-1 抗体探测的 BEAS-2B 提取物的蛋白质浓度降低。在仪器软件中报告为峰高的化学发光信号系数是叠加的。可见条带强度由仪器自动调整，并且从一个面板到另一个面板之间没有可比性。

如果鲁米诺耗尽，信号系数会随着曝光时间的延长而降低，如图所示。信号开始消失，峰值在两次最长的曝光处分裂。因此，选择了 15 秒的短曝光时间进行数据分析。

还应针对每个特定的检测和模型系统优化总蛋白起始量。对于定量评估，必须在每次测定的线性动态范围内进行测量。其中，通过峰面积测量的信号变化与样品中蛋白质质量的变化成正比。

裂解物滴定显示 BEAS-2B 裂解物在用 1 比 500 p53 DO-1 或 1 比 50 α-微管蛋白抗体探测时的泳道视图。线性回归分析证实，检测在整个测试范围内是线性的。选择线性范围中间的总蛋白浓度以适应任一方向的潜在靶蛋白变化。

作为最终的优化考虑因素，应评估适当的一抗稀释度。使用缝合浓度的抗体有助于确保测量到的任何信号变化仅由蛋白质量的变化引起。用连续稀释的 α-微管蛋白抗体探测两个 BEAS-2B 蛋白样品，由蓝色和橙色点表示。

以峰面积测量的化学发光信号与抗体稀释度作图。在 1 到 50 稀释度附近观察到饱和度，此时曲线开始明显的平台期。因此，选择 1 比 50 作为该抗体的最佳稀释度。

观看此视频后，您应该能够轻松使用基于 ProteinSimple Wes 毛细管的免疫测定仪制备样品、加载样品和执行分析。掌握此程序后，可以在 3 小时内完成整个运行，处理 25 个样品。在分析运行时，对每个毛细管和样品进行质量控制非常重要。

这包括在生物素化分子量标准品中验证荧光标准品。如果峰鉴定错误，应主要使用分析软件来识别正确的峰并消除错误识别的峰。与实验室中的所有分子生物学技术一样，请佩戴适当的个人防护装备来保护您自己和样品。

这包括实验室外套、手套、护目镜和露趾鞋。请务必记住，应针对测量的每个新目标或使用不同的样品源进行优化。验证和随访步骤包括使用纯化的蛋白质或表位评估抗体特异性和信号。

使用一系列样品稀释度测试检测的动态范围，并通过评估抗体浓度范围内的信号饱和度来优化抗体稀释度。优化后，与传统方法（如 Western blot）相比，这种毛细管免疫程序应该提供更快速、更定量的方法来测量生物样品的靶蛋白。