人成肌细胞的分离，造血分化的评估和存储操作的钙进入测量

该程序的总体目标是从成人骨骼肌中获得纯人类成肌细胞群。这些细胞用于功能研究，例如评估肌原分化和测量储存作的钙进入。该技术的主要优点是它允许快速、简单和可重复地分离人原代成肌细胞。

这些成肌细胞是研究肌肉再生过程中钙信号传导的新型离体细胞。这种方法可以帮助回答肌肉领域中的关键问题，例如，识别肌肉分化过程中涉及的离子通道和转录因子。因为这种方法可以提供对人类肌源性分化过程中基因功能的见解。

它也可以应用于其他研究，例如，使用肌源性干细胞治疗肌营养不良的潜力。将肌肉样品转移到无菌的 6 厘米板中，用 PBS 洗涤样品两次。取出任何残留的脂肪组织并称量样品。

接下来，加入胰蛋白酶，将肌肉切成小于 2 毫米的块。切碎后，使用 10 毫升移液器将组织转移到装有搅拌棒的 200 毫升解离瓶中，然后继续在胰蛋白酶溶液中收集切碎的组织，直到解离瓶装满 90 毫升。现在，将组织在 37 摄氏度的水浴中孵育 60 分钟，轻轻搅拌。

一小时后，加入 10 毫升 FCS 以终止反应并使用研磨使混合物匀浆。现在，将 70 微米的过滤器加载到两个 50 毫升的试管上，然后将悬浮液移液到过滤器中，使一半的细胞悬液通过每个过滤器。接下来，在生长培养基中悬浮细胞，并将 200， 000 个细胞接种到装有 4 毫升培养基的 6 厘米平板上。

孵育板，每三天更换一次培养基。5 到 7 天后，细胞应达到 70% 至 80% 汇合，然后对其进行染色。首先，用 PBS 冲洗汇合细胞板。

然后，加入 1 毫升胰蛋白酶溶液，让酶作用 3 分钟。通过添加 2 mL 培养基终止反应，并将细胞收集在 15 mL 试管中。然后，将细胞离心并将它们重新悬浮在 1 毫升培养基中。

接下来，在将细胞储存在冰上时进行细胞计数。对于事实分析，加载 7 个试管，每个试管有 100， 000 个细胞。将剩余的细胞加载到第八个试管中进行分选。

用 1 毫升冷传真缓冲液洗涤细胞，然后离心试管并吸出并丢弃上清液。加入 200 μL 传真缓冲液和适当的抗体，让细胞在冰上孵育 30 分钟。30 分钟后，再次洗涤细胞，将其重新悬浮在 500 μL 传真缓冲液中，然后使用流式细胞仪对细胞进行分选。

排除 CD45 阳性造血细胞后，根据 CD56 表达分离 CD45 阴性细胞。然后，对 CD34 、 CD144 和 CD146 的 CD56 阳性群体进行门控。重新分析分选群体的一部分，以检查纯度。

现在，拉出人类成肌细胞并用 5 毫升培养基洗涤它们。然后将它们重新悬浮在一毫升培养基中。将悬浮液转移到装有 4 毫升培养基的 6 厘米板中，并在 37 摄氏度下用 7% 二氧化碳孵育板。

对于此程序，请培养成肌细胞并制备新鲜的横剖培养基。将培养基在室温下孵育 15 至 20 分钟。在培养基孵育期间，准备成肌细胞。

首先，用 PBS 冲洗一次。然后，对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化。加入 2 mL 培养基终止反应。

然后，将细胞收集到 50 mL 试管中。将它们旋转并重新悬浮在 1 毫升培养基中。对于每次横剖，在 200 微升培养基中制备 500， 000 个细胞。

向每 500 μL 透流培养基中加入 200 μL 等分试样的细胞，然后仅使用移液枪两次冲程进行混合。然后，在室温下让反应进行 5 分钟。5 分钟后，将反应物转移到 3.5 cm 培养皿中，每个培养皿包含一个玻璃盖玻片。

接下来，加入 1.3 毫升培养基，使最终体积为 2 毫升，然后孵育培养皿。分化 48 小时后，可以对细胞进行免疫染色或使用钙成像进行分析。对于任一选项，首先使用 1 毫升室温 PBS 小心洗涤细胞两次。

尽量避免分离肌管。对于钙成像，在含钙培养基中用两个微摩尔 fura-2 AM 和一个微摩尔苏糖酸覆盖洗涤的细胞。然后，让它们孵育约 30 分钟，然后再混合。

接下来，用未改性的含钙培养基洗涤细胞两次，然后孵育 10 至 15 分钟以进行酯化。现在，从培养板上取下盖玻片并将其安装到实验室中。用含钙培养基加载腔室，将其置于显微镜下，然后开始数据记录。

Fura-2 在 340 和 380 纳米处交替激发。发射光收集在 510 纳米处。将 340 纳米图像由 380 张图像潜水，提供图像比率，因为波动和钙浓度相对较低，每 2 秒获取一个图像比率。

两到三分钟后，用无钙培养基替换培养基。然后，一两分钟，监测细胞中储存钙的活性。接下来，向细胞中添加一微摩尔 thapsigargin 以耗尽其内部的钙储存。

等待 8 到 10 分钟，然后，用含钙培养基快速更换培养基，并在钙通过 suc e 通道进入细胞时记录 5 分钟。终止实验后，分析图像。为区域 1 选择一个没有细胞的区域，该区域定义背景，然后在细胞质中为区域 2 选择一个区域。

这两个区域可以在系列中的任何图像上绘制。接下来，转到 run experiments 选项卡并选择 340 和 380 通道的参考图像，选择区域 1，然后单击 subtract background。现在，运行整个实验以删除所有图像的背景。

完成后，单击 Log data 选项以打开一个电子表格，其中记录了时间和比率数据。使用传真对肌肉细胞进行生长、扩增和分选。成肌细胞占分析人群的 60% 以上。

然后在分化培养基中培养原代人成肌细胞，并对 MEF2 和肌球蛋白重链蛋白的转录因子进行免疫染色。大多数细胞表达肌球蛋白重链并形成融合指数值约为 60% 的肌管，其他 40% 的细胞仍然是未分化的单核细胞，也称为储备细胞。所述 store作的钙进入实验在分化的细胞上成功进行。

用小干扰 RNA 横切的细胞进行相同的实验，针对 TRPC 家族的钙渗透通道，表明敲低对储存作的钙进入有可测量的影响。看完这个视频，你应该对如何从成人骨骼肌中分离人成肌细胞有了很好的了解。我们使用这些细胞来研究肌肉分化的连续步骤，特别是转录因子和钙通道的失活。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到三个小时的时间内完成。这是一种快速、简单、可重复的方法，可获得人成肌细胞的产量。在尝试此过程时，重要的是要防止成肌细胞培养物达到完全置信度，因为会有不需要的自发分化。