人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

本实验的主要目标是从成人骨骼肌中获得纯化的人肌母细胞群体。这些细胞可用于功能研究，例如评估成肌分化能力以及检测库操作性钙离子内流。该技术的主要优势在于能够快速、简便且可重复地分离出人原代肌母细胞。

这些成肌细胞是用于研究肌肉再生过程中钙信号传导的新型体外模型。该方法有助于回答肌肉研究领域的一些关键问题，例如鉴定参与肌肉分化的离子通道和转录因子。该方法还可为人类成肌分化过程中的基因功能提供深入见解。

它还可应用于其他研究，例如利用成肌干细胞治疗肌营养不良症的潜力。将肌肉样本转移至无菌的6厘米培养皿中，用PBS洗涤样本两次。去除残留的脂肪组织并称量样本重量。

接下来，加入胰蛋白酶并将肌肉组织切碎成小于两毫米的碎片。切碎后，使用10毫升移液管将组织转移至含有搅拌子的200毫升解离瓶中，然后继续在胰蛋白酶溶液中收集切碎的组织，直至解离瓶中的液体体积达到90毫升。随后，将组织置于37摄氏度水浴中，温和搅拌孵育60分钟。

一小时后，加入10毫升FCS以终止反应，并通过吹打混匀混合物。将70微米细胞筛置于两个50毫升离心管上，用移液器将细胞悬液各一半分别加入两个滤器中过滤。接着，用生长培养基重悬细胞，每六厘米培养皿中加入4毫升培养基，接种200,000个细胞。

将培养板置于培养箱中孵育，每三天更换一次培养基。培养五至七天后，细胞应达到70%至80%融合度，此时进行染色。首先，用PBS缓冲液冲洗融合的细胞培养板。

然后加入1 mL胰蛋白酶溶液，让酶作用3分钟。加入2 mL培养基以终止反应，并将细胞收集到15 mL离心管中。随后离心细胞，并将其重悬于1 mL培养基中。

接下来，在将细胞置于冰上保存的同时进行细胞计数。进行数据分析时，将七支试管每管各加入 100,000 个细胞。将剩余细胞加入第八支试管中用于分选。

用一毫升冷的fax缓冲液洗涤细胞，然后离心试管，吸除并弃去上清液。加入200微升含适当抗体的fax缓冲液，将细胞置于冰上孵育30分钟。30分钟后，再次洗涤细胞，并将其重悬于500微升fax缓冲液中，随后使用流式细胞仪分选细胞。

在排除 CD45 阳性的造血细胞后，根据 CD56 的表达对 CD45 阴性细胞进行分选。随后，对 CD56 阳性群体进行 CD34、CD144 和 CD146 的设门分析。重新分析部分分选后的细胞群，以检测纯度。

现在，离心人成肌细胞，并用五毫升培养基洗涤。然后将其重悬于一毫升培养基中。将细胞悬液转移至含有四毫升培养基的六厘米培养皿中，在37°C、7% CO₂条件下孵育培养皿。

进行此操作时，需准备培养好的成肌细胞，并配制新鲜的转染培养基。将培养基在室温下孵育15至20分钟。在培养基孵育期间，对成肌细胞进行处理。

首先，用 PBS 冲洗一次。然后，用胰蛋白酶消化贴壁细胞。加入两毫升培养基以终止反应。

然后，将细胞收集到一个50毫升的离心管中。离心沉淀后，用1毫升培养基重悬。每次转染时，将500,000个细胞用200微升培养基重悬。

向每500微升转染培养基中加入200微升细胞等分试样，然后仅用移液枪吹打两次混匀。随后，在室温下孵育反应体系5分钟。5分钟后，将反应液转移至3.5厘米的培养皿中，每个培养皿内含一片玻璃盖玻片。

接着，加入1.3毫升培养基，使终体积达到2毫升，然后将培养皿放入培养箱孵育。分化48小时后，可对细胞进行免疫染色或钙成像分析。无论选择哪种方法，均需先用1毫升室温的PBS小心洗涤细胞两次。

尽量避免肌管脱落。进行钙成像时，在含钙培养基中加入2 µM fura-2 AM和1 µM赤藓酸，覆盖已洗涤的细胞。随后，于混合前孵育约30分钟。

接下来，用含钙的未修饰培养基将细胞洗涤两次，然后孵育10至15分钟以进行酯化反应。现在，从培养板中取出盖玻片，并将其安装到实验腔室中。向腔室中加入含钙培养基，置于显微镜下，随后开始数据记录。

使用340纳米和380纳米的激发光交替激发Fura-2，在510纳米处收集发射光。将340纳米的图像除以380纳米的图像，得到图像比值；由于波动和钙离子浓度相对较低，每两秒获取一个图像比值。

两到三分钟后，用无钙培养基替换原有培养基。随后，监测细胞中钙库操纵性钙通道的活性一到两分钟。接着，向细胞中加入一微摩尔的毒胡萝卜素，以耗竭其内部钙库中的钙离子。

等待8到10分钟，然后迅速用含钙培养基替换原有培养基，并记录接下来的五分钟，期间钙离子通过蔗糖通道进入细胞。实验结束后，分析图像。选择一个无细胞的区域作为区域一，用于定义背景；然后选择细胞质中的一个区域作为区域二。

可以在该序列的任意图像上绘制这两个区域。接下来，转到“运行实验”选项卡，为340和380通道选择参考图像，选择区域一，然后点击“减去背景”。随后，运行整个实验，以从所有图像中去除背景。

完成后，单击“记录数据”选项以打开一个电子表格，其中记录了时间和比值数据。肌细胞通过流式细胞分选技术进行培养、扩增和分选。在分析的细胞群体中，成肌细胞所占比例超过60%。

随后将原代人成肌细胞在分化培养基中培养，并对转录因子MEF2和肌球蛋白重链蛋白进行免疫染色。大多数细胞表达肌球蛋白重链，并形成融合指数约为60%的肌管，其余40%的细胞保持未分化的单核细胞状态，也称为储备细胞。所述的储存操作性钙内流实验已成功在分化后的细胞上完成。

对转染了针对TRPC家族钙通透性通道的小干扰RNA的细胞重复进行相同实验，结果表明，基因敲低对钙库操纵性钙内流产生了可测量的影响。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何从成人骨骼肌中分离人成肌细胞。我们利用这些细胞研究肌细胞分化的连续步骤，特别是转录因子和钙通道的失活过程。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。这是一种快速、简单且可重复的方法，能够获得人源成肌细胞的产量。在进行该操作时，重要的是要防止成肌细胞培养物达到完全汇合，以免发生非预期的自发性分化。