通过RNA定位蝗虫天线中的气味受体基因原位杂交

该程序的总体目标是使用地高辛标记或生物素标记的探针定位昆虫触角中低水平表达的气味受体基因以及其他基因。要开始此过程，请选择活跃且触角完整的新蜕皮成年蝗虫，然后使用无菌剃须刀将触角切成两到三毫米的小块。接下来，将 OCT 化合物涂在冷冻切片机支架上，并将样品水平放置在化合物上。

将支架转移到零下 24 摄氏度的冷冻切片机中以平衡，直到化合物冻结。然后，取出支架，用少许化合物覆盖样品。将支架再次转移到零下 24 摄氏度的冷冻切片机中至少 10 分钟，然后将冷冻样品切成 12 微米厚的切片。

随后，在载玻片上一片解冻，然后风干 10 分钟。制备低温恒温器切片后，将载玻片放入塑料容器中，并在 4 摄氏度下将载玻片在 4% PFA 溶液中孵育 30 分钟，以固定组织。30 分钟后，在 1 个 X PBS 中洗涤玻片 1 分钟。

要去除碱性蛋白，将玻片转移至 0.2 摩尔氯化氢中 10 分钟，然后将玻片转移至含 1% Triton X-100 的 1 X PBS 中 2 分钟，以去除核酸表面蛋白。接下来，在 1 个 X PBS 中洗涤玻片两次，每次 30 秒。随后，在 4 摄氏度下用甲酰胺溶液冲洗玻片 10 分钟。

排空载玻片并加入 100 微升稀释的反义和正义探针，然后将盖玻片放在组织切片上。之后，在盒子底部加入甲酰胺溶液或 1 X PBS 以保持环境湿润，但不要将载玻片浸入液体中。然后，将盖好的玻片水平放入潮湿的盒子中，并在 55 摄氏度下孵育 22 小时。

杂交后，小心地取下盖玻片。通过在摇杆上在 0.1 X SSC 中在 60 摄氏度下轻轻搅拌 30 分钟，清洗侧面两次，然后在 1 X TBS 中冲洗玻片 30 秒。在每张玻片上加入 1 毫升 1% 封闭试剂的 TBS 溶液，并补充 0.03% Tritin X-100，孵育 30 分钟。

之后，丢弃封闭溶液。对于显色检测，使用 TBS 中的封闭试剂将 750 单位/毫升的抗地高辛-AP 偶联抗体稀释为 1.5 单位/毫升 AP 溶液。随后，向每张覆盖的载玻片中加入 100 微升 AP 溶液。

对于 TSA 检测，使用 TBS 中的封闭试剂将每毫升 750 单位的抗地高辛-AP 偶联抗体和抗生物素链霉亲和素 HRP 偶联抗体稀释到 AP HRP 溶液中，然后向每个覆盖的玻片中加入 100 微升 AP HRP 溶液。加入甲酰胺溶液或一个 X PBS 以保持盒子湿润但不湿透。之后，将载玻片在潮湿的盒子中于 60 摄氏度下孵育 37 分钟。

在摇杆上用 1 个 X TBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，加入 0.05% 吐温 20。之后，将塑料容器放在轻轻搅动的摇杆上，将玻片在 DAP 缓冲液中冲洗 5 分钟。对于显色检测，向每张载玻片中加入 100 μL NBT/BCIP 底物溶液。

小心地将盖玻片放在载玻片上，然后将载玻片在装有底物溶液的潮湿箱中孵育 10 分钟，然后在 37 摄氏度下过夜。通过在显微镜下不时观察载玻片来检查发展情况。显影准备好后，通过将载玻片转移到水中来终止反应。

对于 TSA 检测，使用注射器将 HNPP/固红底物从注射器过滤器中移出，然后将 100 微升 HNPP/固红底物添加到覆盖有盖玻片的每张载玻片中。之后，在室温下将玻片与 HNPP/固红底物孵育 30 分钟。30 分钟后，小心取下盖玻片，并在添加 0.05% 吐温 20 的 X TBS 中洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。

在室温下，将玻片与每个覆盖玻片 100 μL TSA 底物一起孵育 10 分钟。小心取下盖玻片，在补充有 0.05% 吐温 20 的 X TBS 中洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，然后将载玻片嵌入 PBS 甘油中。对于显色检测，使用光学显微镜观察组织切片。

这里显示的是 LmigOR1 和 LmigORco 反义探针在蝗虫天线连续截面上的标记模式。以下是 LmigORco 和 LmigOR2 反义探针在蝗虫天线连续切片上的标记模式。此处显示了偶尔标记的树突状结构的插图。

对于 TSA 检测，使用共聚焦显微镜观察组织切片。在这里，在纵向触角切片上进行了两种颜色的原位杂交，以说明 LmigOR1 和 LmigORco 的表达。表达 LmigOR1 的细胞在表达 LmigORco 的细胞簇中的定位证实了其神经身份，这是框状区域的近视图。

偶尔标记的树突状结构由箭头表示，圆圈区域表示表达 LmigORco 并共享相同感光的嗅觉受体神经元簇。