Name: 通过RNA定位蝗虫天线中的气味受体基因原位杂交 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习使用RNA原位杂交技术定位蝗虫触角中低表达水平的气味受体基因。该方法采用DIG或生物素标记探针，适用于神经科学和昆虫生理学研究，为基因表达定位提供高灵敏度检测工具。

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本研究由国家自然科学基金（编号：31472037）资助。&#160;本文提及的商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，不构成推荐。

注意：为减少RNA降解，需使用经湿热灭菌（121 °C，60分钟）的蒸馏水配制溶液，并对相关材料进行湿热灭菌处理。
1. RNA 原位杂交反义与正义探针的制备
<ol>
	<li>目的基因的扩增与纯化
	<ol>
		<li>首先，扩增出一段387 bp的双链片段 L. migratoria OR1 (LmigOR1，GenBank：JQ766965）从含有全长cDNA的质粒中 LmigOR1 与一个 Taq 在片段两端添加腺嘌呤的DNA聚合酶
		<ol>
			<li>使用 100 &#181;L 最终反应体积，包含 50 &#181;2x反应混合液，4 L &#181;L 每种正向与反向引物表1), 1 &#181;质粒模板L，以及41 &#181;无RNase水 L2O. 使用以下 PCR 程序：94 &#176;C 5分钟，随后进行30个循环的94 &#176;C，30 秒，55 &#176;C，30 秒，72 &#176;℃ 1分钟，随后72 &#176;10分钟，C</li>
			<li>重复这些步骤以获得1,303 bp的双链片段 LmigOR2 (GenBank: JQ766966) 和 1,251 bp 的双链片段 LmigORco （GenBank：JN989549）。本实验所用引物列于 表1.</li>
			<li>在1x Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并通过溴化乙锭染色进行可视化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒提取这些PCR产物。
		<ol>
			<li>电泳结束后，从凝胶中切下DNA条带，将凝胶切片放入1.5 mL离心管中。然后加入100 &#181;每 0.1 g 胶块加入 L 结合缓冲液（Buffer PN）。涡旋混匀，50 ℃ 孵育 &#176;C，直至凝胶切片完全溶解。</li>
			<li>将CA2吸附柱插入收集管中，并加入500 &#181;L 平衡缓冲液（Buffer BL）。这有助于提高硅胶膜的吸附能力和稳定性。在12,400 × g离心1分钟。</li>
			<li>将溶解的凝胶混合物转移至吸附柱组件中，并进行孵育&#160;室温下孵育 2 分钟。然后在 12,400 x g 离心 1 分钟。弃去穿流液，将吸附柱重新插入收集管中。</li>
			<li>加入600 &#181;加入含乙醇的洗涤液（Buffer PW）1 L，重复两次。12,400 x g 离心 1 分钟。弃去穿流液，将吸附柱重新插入收集管中。</li>
			<li>清空收集管，将套柱组件在12,400 × g下再次离心2分钟，以使残留乙醇充分挥发。</li>
			<li>小心将吸附柱转移至一个洁净的 1.5 mL 离心管中。将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟，然后加入适量体积的溶液重新溶解 DNA例如， 30 &#181;L）无核酸酶水。</li>
			<li>室温孵育 2 分钟。在 12,400 x g 条件下离心 2 分钟。弃去吸附柱，将 DNA 在 4 ℃保存 &#176;C 或 -20 &#176;C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建重组质粒
	<ol>
		<li>单独连接387 bp的片段 LmigOR1，1,303 bp 片段 LmigOR2&#160;和1,251 bp的片段 LmigORco 连接至含有T7（上游）和SP6（下游）RNA聚合酶启动子的T载体中，该启动子位于插入的DNA片段两侧，使用T4 DNA连接酶进行连接。准备以下10 &#181;L反应：5 &#181;2x 连接缓冲液 L，1 &#181;T 载体，3 L &#181;L (&#8764;100 ng）插入基因的 DNA 和 1 &#181;T4 DNA 连接酶 L，4℃ 过夜孵育 &#176;C.</li>
		<li>加入5 &#181;每种含有387 bp片段的重组质粒的L LmigOR1，1,303 bp 片段 LmigOR2&#160;和1,251 bp的片段 LmigORco 分别放入 50 &#181;感受态 L Escherichia coli DH5&#945; 无菌 1.5 mL 离心管中的细胞
		<ol>
			<li>轻轻混匀，将离心管置于冰上30分钟，然后在42℃孵育90秒 &#176;C. 将其放回冰上孵育 3 分钟。</li>
			<li>加入450 &#181;每管中加入不含氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）液体培养基L，于37℃、150 rpm摇床中孵育1小时 &#176;C 以恢复 E. coli&#160;DH5&#945;.</li>
			<li>取100 &#181;每种转化子取 L 等分试样，用于接种含 50 的 LB 固体培养基平板 &#181;g/mL 氨苄青霉素，24 &#181;g/mL 异丙醇 &#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和40 &#181;g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-&#946;-D-半乳吡喃糖苷（X-gal）</li>
			<li>在37℃恒温培养箱中孵育这些培养板 &#176;4 ℃孵育 18 h。采用蓝白斑筛选法筛选目标重组质粒。利用 Sanger 测序对目标重组质粒进行测序，并确定三个 OR 基因的插入方向。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择限制性内切酶以线性化重组质粒
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶时，应选择既能在载体的多克隆位点进行切割，又不会切割插入DNA的酶。在本实验中，所有3个基因均以与载体相同的方向插入T载体中。</li>
		<li>使用 Nco I型限制性内切酶用于线性化含有387 bp片段的重组质粒 LmigOR1，1,303 bp 片段 LmigOR2 和1,251 bp的片段 LmigORco 用于制备反义探针。使用 Spe I 限制性内切酶以制备正义探针。 
		注意：如果插入片段的方向与载体方向一致，则选择T7末端的一个独特限制性酶切位点来线性化重组质粒，并使用SP6 RNA聚合酶制备反义探针；选择SP6末端的一个独特限制性酶切位点来线性化重组质粒，并使用T7 RNA聚合酶制备正义探针。反之，如果插入片段的方向与载体方向相反，则选择SP6末端的一个独特限制性酶切位点来线性化重组质粒，并使用T7 RNA聚合酶制备反义探针；选择T7末端的一个独特限制性酶切位点来线性化重组质粒，并使用SP6 RNA聚合酶制备正义探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化线性化的重组质粒
	<ol>
		<li>消化 20 &#181;g 每种含有 387 bp 片段的三种重组质粒 LmigOR1，1,303 bp 的片段 LmigOR2 和一段1,251 bp的片段 LmigORco 使用 Nco I限制性内切酶在100 &#181;L反应中含有10 &#181;L 的 10x 缓冲液，40 &#181;0.5 L &#181;g/&#181;L 质粒，3 &#181;L&#160;Nco的 I 和 47 &#181;无RNase的H的L2O，随后在37℃孵育3小时 &#176;C.</li>
		<li>同样地，消化20 &#181;g 这三种重组质粒中的每一种，使用 Spe I 型限制性内切酶</li>
		<li>使用胶回收试剂盒纯化这些消化后的质粒，具体步骤参见1.1.2。通过分光光度法测定所提取的线性化重组质粒的浓度，并调整至0.5 &#181;g/&#181;L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备反义和有义探针
	<ol>
		<li>使用 T7/SP6 RNA 转录系统制备反义和正义探针。以线性化的重组质粒为模板，利用 SP6 RNA 聚合酶转录这三种 OR 基因的双链 RNA，用于合成 DIG 和生物素标记的反义探针。 体外T7 RNA 聚合酶用于合成有义探针。在 20 μL 体系中进行反应。 &#181;L终体积，含有2 &#181;10x NTP 混合液，2 μL &#181;L 的 10X 转录缓冲液，1 &#181;RNase 抑制剂 L，2 &#181;L 的 T7 或 SP6 RNA 聚合酶，4 &#181;0.5 L &#181;g/&#181;L 线性化质粒和 9 &#181;L 无RNase H2O，随后在 37℃ 下孵育 3 小时 &#176;C.</li>
		<li>将地高辛和生物素标记的反义与有义探针分别孵育30分钟，加入1 &#181;37℃下使用L DNase &#176;C. 加入2.5 &#181;L of 5 M LiCl 和 75 &#181;L 的无水乙醇，然后在 -70℃ 下孵育反应 30 分钟 &#176;C.</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 15,000 x g 离心 30 分钟 &#176;C. 小心弃去上清液。加入150 &#181;加入1 L 70%乙醇以洗涤沉淀物。通过将95%乙醇（736.8 mL）加入无菌蒸馏水（263.2 mL）中配制70%乙醇（1 L）。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 15,000 x g 离心 30 分钟 &#176;C，室温下干燥沉淀5-10分钟。加入25 &#181;无RNase水2O 用于溶解 RNA 反义和正义探针。</li>
		<li>如果插入基因的长度超过1 kb，则需将RNA反义链和正义链探针片段化至平均长度 &#65374;300 bp，通过在碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液中孵育实现。反应在50 &#181;L 终体积，含有 25 &#181;RNA探针的L和25 &#181;L 的碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液（80 mM NaHCO₃）3，120 mM Na2CO3，pH 10.2）于 60 &#176;C. 所需的水解时间由先前发表的公式给出17.</li>
		<li>加入 5 &#181;加入10%乙酸终止反应。在本实验中，对片段进行打断处理 LmigOR2 以及 LmigORco 反义探针24分钟，正义探针23分钟。 
		t = (Lo- Lf)/kXLoXLf 
		Lo= 初始片段长度（kb） 
		Lf=最终片段长度（kb） 
		k=水解速率常数，约为 0.11 kb-1分钟-1 
		t=水解时间（单位：min）</li>
		<li>最后，加入250 &#181;L 杂交缓冲液，于 -80 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 冷冻切片的制备
<ol>
	<li>将冷冻切片机预冷至 -24 °C。</li>
	<li>选取活跃且触角完好的新蜕皮成年蝗虫。使用无菌剃刀将触角切成 2–3 mm 的小段。</li>
	<li>在冷冻切片机样品头的 O.C.T. 包埋剂上放置样品，将一至两个样品水平置于包埋剂上。然后将样品头放入 -24 °C 的冷冻切片机中，平衡至包埋剂完全冻结。取出样品头，用少量包埋剂覆盖样品。再次将样品头放回 -24 °C 的冷冻切片机中至少 10 分钟（图 1）。 
	注意：避免包埋剂中产生气泡。</li>
	<li>将带有样品的样品头固定在冷冻切片机中，在 -24 °C 下将冻结的样品切成 12 µm 厚的切片。</li>
	<li>将切片逐片贴附于载玻片（25 &#160;x 75 mm；无核酸酶）上，自然晾干 10 分钟。</li>
</ol>
3. 固定切片
<ol>
	<li>制备冷冻切片后，将载玻片放入塑料容器（～100 &#160;x 40 &#160;x 80 mm）中，并在4 °C下用4%多聚甲醛溶液（PFA）孵育30分钟，以固定组织。</li>
	<li>用1X磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片1分钟。</li>
	<li>为去除碱性蛋白，将载玻片转移至0.2 M HCl中处理10分钟。</li>
	<li>为去除核酸表面蛋白，将载玻片转移至含1% Triton X-100的1X PBS中处理2分钟。</li>
	<li>用1X PBS洗涤载玻片两次，每次30秒。</li>
	<li>最后，在4 °C下用甲酰胺溶液冲洗载玻片10分钟。</li>
</ol>
4. 杂交
<ol>
	<li>制备反义探针和正义探针
	<ol>
		<li>使用杂交缓冲液在1.5 mL无核酸酶的离心管中稀释RNA反义或正义探针。本实验中，所有反义和正义探针（LmigOR1、LmigOR2 以及 LmigOrco)，加入1 &#181;探针L至99 &#181;每张载玻片使用 L 杂交缓冲液。通常，使用反义探针 1:100 的稀释度在此方案中可产生显著的阳性信号和较低的背景。</li>
		<li>对于显色检测，分别稀释地高辛标记的探针。</li>
		<li>用于TSA检测，稀释DIG标记的 LmigOR1 使用生物素标记的 LmigOrco 探针或地高辛标记的探针 LmigOR2 使用生物素标记的 LmigOR1 探针&#160;在杂交缓冲液中共同孵育。</li>
		<li>将稀释液在 65 ℃ 加热 10 分钟 &#176;C，并置于冰上至少 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交
	<ol>
		<li>取出载玻片并弃去液体，加入 100 &#181;将稀释后的反义链和有义链探针（步骤4.1）各L加至组织切片上，然后在组织切片上加盖盖玻片（24 mm × 50 mm；无核酸酶）。</li>
		<li>将盖好的载玻片水平放入湿盒中（&#8764;300 &#160;×180 &#160;x 50 mm3; 图2）并在 55 ℃ 下孵育 &#176;在盒子底部加入甲酰胺溶液或1×PBS以保持环境湿润，但切勿将载玻片浸入液体中，于C条件下孵育22小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤与封闭。
	<ol>
		<li>杂交后，小心移除盖玻片。将载玻片在60℃下用0.1x SSC缓冲液洗涤两次，每次30分钟。 &#176;C. 
		注意：洗涤是指将载玻片放入载玻片架中，再将架置于塑料容器内，在摇床中轻轻振荡&#65374;50 转/分钟； 图2).</li>
		<li>用 1x TBS 缓冲液冲洗载玻片 30 秒。</li>
		<li>每张载玻片上加入1 mL含0.03% Triton X-100的TBS缓冲液配制的1%封闭剂，30 min后弃去封闭液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学
	<ol>
		<li>对于显色检测，使用TBS中的封闭剂将750单位（U）/mL抗地高辛AP偶联抗体稀释至1.5 U/mL的AP溶液。加入100 &#181;每张盖好的载玻片（24 mm × 50 mm）使用 L 的 AP 溶液。</li>
		<li>用于 TSA 检测时，用 TBS 中的封闭试剂将抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体（750 U/mL）和抗生物素链霉亲和素 HRP 偶联抗体稀释成 AP/HRP 溶液。加入 100 &#181;每张加盖玻片（24 mm × 50 mm）的载玻片使用 L 的 AP/HRP 溶液。</li>
		<li>在湿盒中孵育载玻片（图2）在37℃下持续60分钟 &#176;C. 使用甲酰胺溶液或1X PBS保持盒子湿润但不湿透。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 染色
<ol>
	<li>小心移除盖玻片。将载玻片在含有 0.05% Tween-20 的 1x TBS 中洗涤三次，每次 5 分钟。随后在 DAP 缓冲液中（显色检测：pH 9.5；TSA 检测：pH 8.0）漂洗 5 分钟。</li>
	<li>染色（显色检测）
	<ol>
		<li>向每张载玻片上加入 100 µL NBT（375 µg/mL）/BCIP（188 µg/mL）底物溶液（用 DAP 稀释，pH 9.5）。小心地将盖玻片（24&#160;x 50 mm）覆盖在载玻片上。</li>
		<li>将载玻片置于湿润盒中，加入底物溶液，于 37 °C 孵育 10 分钟至过夜。 
		注意：通过显微镜定期观察以监测显色进程。</li>
		<li>当显色达到合适程度后，将载玻片转移至水中以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色（TSA 检测）
	<ol>
		<li>使用注射器将 HNPP（100 µg/mL）/Fast Red（250 µg/mL）底物溶液从注射器滤器（0.22 µm；图 2）中推出。</li>
		<li>每张盖有盖玻片（24&#160;x 50 mm）的载玻片上加 100 µL HNPP/Fast Red 底物溶液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
		<li>小心移除盖玻片，并将载玻片在含有 0.05% Tween-20 的 1x TBS 中洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>每张覆盖有盖玻片（24&#160;x 50 mm2）的载玻片上使用 100 µL TSA 底物。在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>小心移除盖玻片，并将载玻片在含有 0.05% Tween-20 的 1x TBS 中洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS/甘油（1:3）封片。 
	注意：完成上述步骤后，应尽快观察载玻片，因为荧光信号会迅速淬灭。</li>
</ol>
6. 观察
<ol>
	<li>显色检测
	<ol>
		<li>使用光学显微镜观察组织切片。选择10X、20X和40X物镜观察显色检测结果。</li>
		<li>使用DP-BSW软件分析结果并采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TSA检测
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜观察组织切片。DIG标记的基因应在543 nm光下观察，呈红色；生物素标记的基因应在488 nm光下观察，呈绿色。两者共现时呈黄色。</li>
		<li>分别选择20X和40X物镜观察TSA检测结果。</li>
		<li>使用FV1000软件分析结果并采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何披露内容或其他利益冲突。

由于除ORco以外的OR基因表达水平极低，且昆虫触角组织切片难以保存，因此对昆虫触角中的OR基因进行RNA原位杂交（RNA ISH）以定位其表达具有较大难度。此外，TSA检测也十分困难。为解决这些问题，应采取以下措施：选择刚蜕皮成虫期的蝗虫触角，其触角角质层较薄且柔软，可在载玻片上较好地保持形态结构；将冷冻样品切成12 µm厚的切片；使用高灵敏度和高特异性的生物素（biotin）和地高辛（DIG）标记探针；在多个步骤中使用Tween-20和Triton X-100等去污剂以降低背景信号；在TSA检测中，相对于低表达基因，高表达基因应使用biotin-16-UTP进行标记；载玻片应尽快观察，因为荧光信号会迅速淬灭。
DIG和生物素标记探针相较于放射性探针具有更长的保存期限、更高的信噪比以及更优的细胞分辨率18,19本文所述方案相较于整体装片法具有一些优势 原位 杂交。该方案可轻松确定基因在细胞水平上的定位，但难以用于研究基因分布模式...

昆虫的触角是最主要的化学感受器官，其表面分布着许多毛发状结构——称为嗅觉感器（sensilla），这些感器由嗅觉感受神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）支配。在昆虫ORNs的细胞膜上，表达着一类含有七个跨膜结构域的蛋白质——气味受体（Odorant Receptors, ORs），它们与一种共受体（ORco）结合形成异源多聚体，发挥气味分子门控离子通道的功能1,2,3。不同的ORs可响应不同类型的化学化合物组合4,5,6。
蝗虫（Locusts）飞蝗主要依靠嗅觉线索来触发重要行为7蝗虫气味受体（ORs）是理解分子嗅觉机制的关键因素。通过RNA将特定的蝗虫OR基因定位到形态学上特定类型感器的神经元中 原位&#160;杂交（RNA原位杂交）是探索嗅觉受体（ORs）功能的第一步。
RNA原位杂交（RNA ISH）利用标记的互补RNA探针，在组织切片、细胞或整体封片中测量并定位特定的RNA序列，从而提供有关生理过程和疾病发病机制的信息。in situ杂交中广泛使用地高辛标记（DIG标记）和生物素标记的RNA探针。通过SP6和T7 RNA聚合酶进行in vitro转录，可制备用地高辛-11-UTP或生物素-16-UTP标记的RNA探针。DIG和生物素标记的RNA探针具有以下优点：非放射性、安全、稳定、高灵敏度、高特异性，并且可通过PCR和in vitro转录轻松制备。DIG和生物素标记的RNA探针均可进行显色和荧光检测。DIG标记的RNA探针可用抗地高辛碱性磷酸酶（AP）偶联抗体进行检测，该抗体可通过光学显微镜结合高灵敏度化学发光底物氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸甲苯胺盐（NBT/BCIP）显色，或通过共聚焦显微镜结合2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐（HNPP）与4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物盐（Fast Red）显色。生物素标记的RNA探针可用抗生物素链霉亲和素辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体进行检测，并通过共聚焦显微镜结合荧光素酪酰胺显色。因此，可利用DIG和生物素标记的RNA探针在同一组织切片中进行双色荧光in situ杂交，以同时检测两个靶基因。
使用DIG和/或生物素标记探针进行RNA原位杂交（ISH）已成功用于定位与嗅觉相关基因，例如OR、离子型受体、气味结合蛋白和感觉神经元膜蛋白，这些研究涉及的昆虫触角包括但不限于黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、飞蝗L. migratoria以及沙漠蝗Schistocera gregaria8,9,10,11,12,13,14,15,16。然而，在对昆虫气味受体（OR）进行RNA原位杂交时存在两个主要挑战：（1）OR基因（ORco除外）表达水平较低，且仅在少数细胞中表达，使得信号检测极为困难；（2）昆虫组织的组织学保存较难，需在保持组织形态完整的同时尽可能降低背景噪声。本文提供了一套详细且高效的RNA原位杂交实验方案，用于定位昆虫触角中的OR基因，涵盖显色检测和酪胺信号放大（TSA）检测两种方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, 中国</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, 中国</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, 西班牙</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td>TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>平衡缓冲液</td><td>TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>洗涤液</td><td>TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T载体</td><td>Promega, 美国</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Promega, 美国</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, 中国</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma, 美国</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Inalco, 美国</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷</td><td>SBS Genetech, 中国</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, 美国新英格兰</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, 美国新英格兰</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA标记试剂盒</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>生物素RNA标记试剂盒</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA标记试剂盒, Roche, 瑞士</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>国药集团, 中国</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>国药集团, 中国</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>北京化学试剂公司, 中国</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, 荷兰</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>天津金昊扬生物科技有限公司, 中国</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>国药集团, 中国</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, 美国</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, 美国</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>硝基蓝四氮唑氯化物 / 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-甲苯胺盐</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>国药集团, 中国</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-乙酸-EDTA</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-碱</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-乙酸-EDTA</td><td>北京化学试剂公司, 中国</td><td>10000292</td><td>0.12% 乙酸</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-乙酸-EDTA</td><td>Sigma, 美国</td><td>03677</td><td>乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA)</td></tr><tr><td>LB (Luria-Bertani) 液体培养基</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB (Luria-Bertani) 液体培养基</td><td>MERCK, 德国</td><td>VM335231</td><td>10 g/L 酪蛋白胨 (胰蛋白胨)</td></tr><tr><td>LB (Luria-Bertani) 液体培养基</td><td>MERCK, 德国</td><td>VM361526</td><td>5 g/L 酵母提取物</td></tr><tr><td>LB固体培养基平板</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB固体培养基平板</td><td>MERCK, 德国</td><td>VM335231</td><td>10 g/L 酪蛋白胨 (胰蛋白胨)</td></tr><tr><td>LB固体培养基平板</td><td>MERCK, 德国</td><td>VM361526</td><td>5 g/L 酵母提取物</td></tr><tr><td>LB固体培养基平板</td><td>WISENT ING, 加拿大</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L 细菌级琼脂</td></tr><tr><td>10&amp;times;磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1)</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris缓冲盐溶液 (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-碱</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris缓冲盐溶液 (TBS, pH 7.5)</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>检测缓冲液 (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 显色检测 pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA检测 pH 8.0</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-碱</td></tr><tr><td>检测缓冲液 (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 显色检测 pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA检测 pH 8.0</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>检测缓冲液 (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 显色检测 pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA检测 pH 8.0</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;柠檬酸钠-盐水 (pH 7.0)</td><td>国药集团, 中国</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;柠檬酸钠-盐水 (pH 7.0)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M 柠檬酸钠</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛溶液 (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900894-100G</td><td>4% 多聚甲醛</td></tr><tr><td>碳酸钠缓冲液</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>碳酸钠缓冲液 (pH 10.2)</td><td>Sigma, 美国</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>碳酸钠缓冲液 (pH 10.2)</td><td>Sigma, 美国</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>甲酰胺溶液 (pH 10.2)</td><td>MPBIO, 美国</td><td>FORMD002</td><td>50% 去离子甲酰胺</td></tr><tr><td>甲酰胺溶液 (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;柠檬酸钠-盐水</td></tr><tr><td>TBS中的封闭缓冲液</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>TBS中的封闭缓冲液</td><td>AMRESCO, 美国</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>TBS中的封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris缓冲盐溶液</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶溶液</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL 抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶溶液</td><td></td><td></td><td>TBS中的封闭缓冲液</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL 抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液</td><td>TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% 抗生物素链霉亲和素辣根过氧化物酶偶联抗体</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液</td><td></td><td></td><td>TBS中的封闭缓冲液</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>MPBIO, 美国</td><td>FORMD002</td><td>50% 去离子甲酰胺</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;柠檬酸钠-盐水</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>Sigma, 美国</td><td>D8906-50G</td><td>10% 硫酸葡聚糖</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>invitrogen, 美国</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL 酵母t-RNA</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>Sigma, 美国</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL 沙丁鱼精子DNA</td></tr><tr><td>2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11758888001</td><td>1% 2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐 (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物</td><td>Roche, 瑞士</td><td>11758888001</td><td>1% 4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物 (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物</td><td></td><td></td><td>检测缓冲液</td></tr><tr><td>酪胺信号放大底物</td><td>TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% 荧光素-酪胺</td></tr><tr><td>酪胺信号放大底物</td><td>TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国</td><td>NEL701A001KT</td><td>扩增稀释液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica, Nussloch, 德国</td><td>Jung CM300 冷冻切片机</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo SCIENTIFIC, 美国</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus, 东京, 日本</td><td>Olympus IX71显微镜</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus, 东京, 日本</td><td>Olympus BX45共聚焦显微镜</td><td></td></tr></tbody></table>

通过rna 原位杂交技术定位蝗虫触角中的嗅觉受体基因

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

昆虫已进化出复杂的嗅觉感受系统，用于感知外源性化学信号。这些化学信号由触角上毛发状结构——化学感受器中的嗅觉受体神经元（ORNs）转导。在ORNs的细胞膜上，气味受体（ORs）被认为参与了气味编码过程。因此，鉴定定位于ORNs中的基因对于识别OR基因至关重要，并为进一步功能研究提供基础。 原位 研究。特定基因的RNA表达水平 或昆虫触角中的表达量极低，且昆虫组织的组织学保存具有挑战性。因此，利用RNA难以将嗅觉受体定位于特定类型的感器 原位 杂交。在本文中，一种详细且高效的方法用于RNA 原位 一种特别针对昆虫低表达OR基因的杂交实验方案被引入。此外，一种特异的OR 通过双色荧光实验鉴定出该基因 原位 使用共表达受体基因的杂交实验 Orco，作为标记物。

通过显色检测，在每张成虫触角切片中，仅有少量触角细胞被DIG标记的LmigOR1和LmigOR2反义探针标记（图3）。对连续切片进行RNA原位杂交以定位LmigOR1和LmigOR2，结果显示表达这两个基因的触角细胞位于表达LmigORco的嗅觉神经元簇中，表明推测的LmigOR1和LmigOR2确实表达于嗅觉神经元（ORN）中（图4a-4d）。偶尔可观察到被标记的树突样结构（图4e-4f）。LmigOR1和LmigOR2均定位于刺形感器中的神经元（图5a-5b），但在单个感器中二者并不共表达，表明它们存在于不同类型的刺形感器亚型中（<...

本文介绍了一种详细且高效的RNA原位杂交实验方案，特别适用于检测昆虫触角中低水平表达的气味受体（OR）基因及其他基因，所用探针为地高辛（DIG）标记或生物素标记的探针。

通过RNA 原位杂交技术定位蝗虫触角中的嗅觉受体基因

昆虫已进化出复杂的嗅觉感受系统，用于感知外源性化学信号。这些化学信号由嗅觉……

本实验的总体目标是利用地高辛标记或生物素标记的探针，在昆虫触角中定位低水平表达的气味受体基因及其他基因。开始实验时，选择处于新蜕皮阶段、活动正常且触角完整的成年蝗虫，然后使用无菌刀片将触角切成2至3毫米长的小段。接下来，在冷冻切片机载物台上涂抹OCT包埋剂，并将样品水平放置于包埋剂上。将样品托置于 -24 摄氏度的冷冻切片机中，平衡至包埋剂完全凝固。随后取出样品托，向样品表面覆盖少量包埋剂。再次将样品托放回 -24 摄氏度的冷冻切片机中，至少放置 10 分钟，然后将冻结的样品切成 12 µm 厚的切片。随后，将切片逐一在载玻片上解冻，并风干10分钟。制备好冷冻切片后，将载玻片放入塑料容器中，在4°C条件下用4% PFA溶液固定组织，孵育30分钟。30分钟后，用1× PBS洗涤载玻片1分钟。为了去除碱性蛋白，将载玻片转移至 0.2 摩尔的盐酸中处理 10 分钟，然后将载玻片转移至含 1% Triton X-100 的一倍 PBS 溶液中处理 2 分钟，以去除核酸表面的蛋白质。接着，用一倍 PBS 溶液洗涤载玻片两次，每次 30 秒。随后，在 4 摄氏度下用甲酰胺溶液冲洗载玻片 10 分钟。将玻片沥干，加入100微升稀释的反义和有义探针，然后将盖玻片覆盖在组织切片上。随后，在盒子底部加入甲酰胺溶液或1×PBS，以保持环境湿润，但切勿将玻片浸入液体中。接着，将加盖的玻片水平放入湿盒中，在55摄氏度下孵育22小时。杂交后，小心移除盖玻片。将载玻片在60摄氏度的0.1 X SSC溶液中，于摇床上轻轻振荡洗涤两次，每次30分钟，然后在1 X TBS缓冲液中漂洗30秒。每张载玻片上加入1毫升含0.03% Triton X-100的TBS配制的1%封闭试剂，孵育30分钟。随后，弃去封闭液。对于显色检测，使用 TBS 中的封闭试剂将每毫升 750 单位的抗地高辛素-碱性磷酸酶（AP）偶联抗体稀释至每毫升 1.5 单位的 AP 溶液。然后，向每张加样片中加入 100 微升 AP 溶液。进行TSA检测时，使用TBS中的封闭试剂将抗地高辛-碱性磷酸酶（anti-digoxigenin-AP）偶联抗体和抗生物素链霉亲和素HRP（anti-biotin streptavidin HRP）偶联抗体稀释至每毫升750单位，配制成AP HRP溶液，然后向每张盖好的载玻片上加入100微升该AP HRP溶液。加入甲酰胺溶液或1× PBS以保持湿盒湿润但不积水。随后，将载玻片置于湿盒中，在37摄氏度下孵育60分钟。将载玻片置于含0.05% TWEEN 20的一倍浓度TBS中，在摇床上孵育，每次5分钟，共洗涤3次。随后，将塑料容器置于摇床上，轻柔振荡，用DAP缓冲液冲洗载玻片5分钟。进行显色检测时，向每张载玻片加入100微升NBT/BCIP底物溶液。将盖玻片小心地放置在载玻片上，然后将载玻片置于湿盒中，加入底物溶液，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟至过夜。在显微镜下定期观察载玻片，以检查反应显色情况。当显色达到理想程度时，将载玻片转移至水中以终止反应。进行TSA检测时，使用注射器将HNPP/Fast Red底物从注射器滤器中转移，然后向每张已覆盖盖玻片的载玻片上加入100 µL HNPP/Fast Red底物。随后，将载玻片在室温下用HNPP/Fast Red底物孵育30分钟。30分钟后，小心移除盖玻片，并将载玻片在含有0.05% TWEEN 20的一倍TBS缓冲液中洗涤三次，每次五分钟。每张盖玻片覆盖的载玻片加入 100 微升 TSA 底物，室温孵育 10 分钟。小心移除盖玻片，将载玻片置于含 0.05% TWEEN 20 的 1× TBS 中洗涤三次，每次五分钟，随后将载玻片封片于 PBS 甘油中。对于显色检测，使用光学显微镜观察组织切片。此处显示的是 LmigOR1 和 LmigORco 反义探针在蝗虫触角连续切片上的标记模式。此处显示的是 LmigORco 和 LmigOR2 反义探针在蝗虫触角连续切片上的标记模式。偶尔标记的树突样结构的示意图如图所示。对于 TSA 检测，使用共聚焦显微镜观察组织切片。此处对触角纵切面进行了双色原位杂交，以展示 LmigOR1 和 LmigORco 的表达情况。表达 LmigOR1 的细胞定位于表达 LmigORco 的细胞簇中，证实了其神经元身份，此处为方框区域的放大视图。偶尔可见标记的树突样结构，由箭头指示；圆圈区域表示表达 LmigORco 并共用同一感器的嗅觉受体神经元簇。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

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