半自动纵 Microcomputed Tomography-based 裸鼠骨质疏松症相关椎体骨折模型的定量结构分析
September 28th, 2017
该协议的目的是产生一个裸鼠骨质疏松症相关的椎体压缩骨折模型, 可以纵向评价在体内使用半自动 microcomputed tomography-based 定量结构分析。
这种手术模型和图像分析方法的总体目标是观察您的治疗对临床前骨质疏松症相关椎体压缩性骨折模型的影响。这种方法可以帮助回答这个神经胶质再生医学领域的关键问题，例如什么可以有效治疗与骨质疏松症相关的椎体压缩性骨折，以及这种治疗如何帮助骨再生？这项技术的主要优点是它涉及裸鼠，因此可以在体内测试新的治疗方法，而无需担心免疫排斥。
此外，这里介绍的这种方法是半自动的骨再生基础，因此它比以前发布的更准确且对用户的依赖性更小。演示该程序的是我们实验室的研究科学家 Wafa Tawackoli 博士。首先在 100% 氧气中使用 5% 异氟醚在骨质疏松大鼠中诱导麻醉，然后转移到 2 至 3% 异氟醚的鼻锥中进行维持。
使用电动剃须刀剃除腹部区域。在 0.5% 葡萄糖酸氯己定中加入碘类防腐剂，然后用 70% 乙醇拭子。在麻醉下在眼睛上使用兽医软膏以防止干燥。
施加脚趾捏刺激以确保足够的麻醉平面。如果未注意到响应，请启动该过程。将麻醉的大鼠背卧在设置为 37 摄氏度的加热垫上，并使用磁固定器伸缩系统伸展四肢。
在开始外科手术之前，皮下注射大鼠卡洛芬。在皮肤上做一个 5 到 8 厘米的切口后，从剑突下方 1 厘米开始，穿过中线，用手术剪刀通过白线切开腱膜，以进入腹腔。使用牵开器暴露腹腔。
将肠道偏转到大鼠的右侧，露出腹主动脉和左肾。为避免脱水，请使用无菌浸泡的纱布包裹内脏。必要时使用额外的牵开器以暴露主动脉。
触诊腰椎，然后继续暴露它。使用热烙术暴露腰椎体 L 4 至 L 5 的前部，并将它们与周围的结缔组织和肌肉隔离。使用棉签去除 L 四椎骨上的血液和残留组织。
接下来，使用直径为 2 厘米的无菌钻头在椎体暴露的前部中心钻出 5 毫米深的骨缺损。施加最小压力，仅钻穿腹侧皮层和下面的小梁骨。避免钻穿背皮层。
然后以相同的方式钻 L 的五个椎骨，使每只大鼠产生两个缺陷。钻孔完成后，将肠道放回腹腔并取出牵开器。接下来使用 vicryl 合成可吸收手术缝合线以连续模式缝合腱膜。
使用 4-0 单丝尼龙不可吸收缝合线以简单的间断模式闭合皮肤。然后在皮肤缝合线顶部和之间涂抹 100 微升局部皮肤粘合剂，以确保皮肤完全闭合。给大鼠注射 37 摄氏度的乳酸林格液以防止体温过低和脱水，并注射丁丙诺啡缓解术后疼痛后，让动物从加热垫上的麻醉中恢复过来。
在外科手术后的第二天，像以前一样用异氟醚诱导麻醉。使用体内显微 CT 扫描仪扫描大鼠。扫描并从麻醉中恢复后，将大鼠放回家笼。
要分离椎骨数据进行分析，请单击 micro-CT 评估程序并从菜单中选择样本。然后使用鼠标在切片上绘制单个椎骨的轮廓。使用 Z 条转到下一个切片，并以相同的方式绘制单个椎骨的轮廓。
通过单击文件将轮廓椎骨保存为单独的文件，每隔几片保存 GOBJ。然后在设置参考椎骨后，将其导入 micro-CT 环境。通过单击显微 CT 评估程序、文件、加载 GOBJ 并选择先前创建的 GOBJ，将为参考椎骨定义的 VOI 应用于注册的目标椎骨。
最后，使用 micro-CT 评估程序发送 VOI 进行评估。该额部 3D 图像显示了缺损产生后一天的代表性椎体缺损图像。空隙中的骨形成以红色表示。
这是同一区域的矢状 2D 图像，最后是轴向 2D 图像。如图所示，骨形成会随着时间的推移而发生，并通过纵向成像检测到。计算骨体积密度和表观密度，并使用重复测量双向方差分析和 Bonferroni 校正进行比较以进行多重比较。
如图所示，骨体积密度和表观密度从椎体缺损形成后两周开始显着增加。按照此程序，可以执行其他方法，如组织学和免疫组化，以回答其他问题，例如存在哪些细胞以及在缺陷中表达哪些蛋白质。看完这个视频，你应该对如何在裸鼠身上产生多个椎体缺损以及分析这些缺损随时间推移的骨再生有一个很好的了解。
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概述
本协议概述了一种创建骨质疏松相关椎体压缩骨折裸鼠模型的方法，允许使用半自动化微计算机断层扫描进行体内评估。这种方法有助于研究骨质疏松条件下骨再生的潜在治疗方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 骨再生
- 骨质疏松研究
背景
- 骨质疏松会增加骨折风险，特别是在椎骨中。
- 使用裸鼠可以避免治疗研究中的免疫排斥反应。
- 微计算机断层扫描提供了骨骼的详细结构分析。
- 了解骨再生机制对于开发有效的治疗方法至关重要。
研究目的
- 建立一个可靠的模型用于研究骨质疏松相关骨折。
- 评估新治疗方法对骨再生的有效性。
- 通过半自动化方法提高结构分析的准确性。
使用的方法
- 使用含氧的异氟烷进行麻醉诱导。
- 在裸鼠中创建椎体压缩骨折。
- 使用微计算机断层扫描对骨骼愈合进行纵向评估。
- 评估治疗对骨再生的影响。
主要结果
- 在模型中成功诱导椎体压缩骨折。
- 证明了半自动化分析用于结构评估的可行性。
- 潜在的治疗方法在增强骨再生方面显示出前景。
- 研究结果有助于理解骨质疏松治疗的有效性。
结论
- 裸鼠模型有效用于研究骨质疏松相关骨折。
- 半自动化微计算机断层扫描提高了分析准确性。
- 这项研究支持开发新的骨质疏松治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Longitudinal semiautomated microcomputed tomography (μCT) enables precise, reproducible quantification of bone regeneration in preclinical osteoporosis-related vertebral fracture models. This approach supports predictive confidence in evaluating novel bone regenerative therapies and de-risks translational advancement by standardizing structural outcome measures. The method is positioned to inform early discovery, target validation, and preclinical decision-making for osteoporosis and bone tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of bone regeneration hypotheses in a controlled, immunodeficient in vivo system.
- Supports functional target validation by quantifying new bone formation over time in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating treatment effects from immune confounders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, semiautomated workflow for generating and analyzing vertebral defects across cohorts.
- Delivers reproducible, quantitative μCT outputs suitable for comparative screening of regenerative compounds or biomaterials.
- Enables high-content, longitudinal assessment of bone volume and density changes, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for osteoporosis and vertebral fracture repair.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using clinically relevant imaging and analysis metrics.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with demonstrated in vivo efficacy in a reproducible model.
Pipeline & Workflow Integration
This semiautomated μCT-based analysis integrates from early discovery through preclinical evaluation, enabling seamless transition of candidates from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Quantitative imaging supports hypothesis-driven assessment of bone regeneration mechanisms.
- Screening: Standardized defect creation and imaging facilitate reproducible, scalable compound evaluation.
- Analytics: Automated registration and volume-of-interest analysis yield robust, comparable structural metrics.
- Translational Research: Longitudinal imaging aligns with clinical endpoints and supports biomarker development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other longitudinal imaging-based bone and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of in vivo imaging analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, μCT imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to in vivo μCT scanners and compatible analysis software for automated registration and VOI definition.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to other bone or tissue defect models where longitudinal imaging is beneficial.
- Dependent on animal model suitability and imaging infrastructure availability.
