结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

本实验的总体目标是利用共聚焦显微镜在结直肠癌细胞中研究 tau 蛋白的磷酸化、tau 蛋白与微管的结合能力及其定位情况。该方法可广泛适用于大多数生物学研究领域，特别是在癌症和痴呆症研究中，其中磷酸化和微管结合是重要的影响因素。本研究所采用的磷酸酶检测方法的主要优势在于，它能够简便地整体评估蛋白质样品的磷酸化水平。

主要优点在于微管结合实验是一种将微管结合蛋白与非结合组分分离的简单方法。然而，tau蛋白定位技术的主要优势在于其仅需相对少量的一抗和二抗。开始此实验前，请按照文本方案中所述准备所有试剂。

将约一百万个 HCT 116 细胞转移至含有最低必需培养基（补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的培养皿中。当细胞融合度达到 65% 时，使用吸管移除添加了胎牛血清的培养基，随后加入无血清的最低必需培养基，其中含有姜黄素或氯化锂。

在含5%二氧化碳的湿润环境中，37摄氏度孵育24小时。随后，用10毫升冰冻的PBS洗涤细胞。加入1毫升冰冻PBS，然后使用细胞刮刀刮取细胞，并将其转移至1.5毫升离心管中。

在4°C、1800 × g条件下离心4分钟。将细胞沉淀在4°C下用100 µL完全RIPA裂解缓冲液重悬20分钟，并定期轻弹管壁以确保细胞充分裂解。随后，将样品以10%的振幅进行短暂超声处理，每次超声0.2秒，间歇0.2秒，累计超声时间共2秒。

将细胞匀浆在 22,570 × g 及 4 °C 条件下离心 20 分钟。将上清液转移至新的已标记试管中，然后按照文本方案所述，通过 Bradford 法测定蛋白质浓度。在制备含 20 微克总蛋白的样品后，向每个样品中加入 2 微升碱性磷酸酶缓冲液和 10 微升碱性磷酸酶。

然后加入蒸馏水，使每个样品的终体积为 20 µL。将样品在 37 °C 下孵育 1 小时。在样品孵育的同时，制备相同浓度但不含磷酸酶的额外样品作为对照。

反应一小时后，加入终浓度为 50 毫摩尔的 EDTA 或终浓度为 10 毫摩尔的原钒酸钠以终止反应。加入新配制的含 400 毫摩尔 DTT 的 4X SDS 凝胶上样缓冲液。使用金属浴，将样品在 100 摄氏度下孵育 5 分钟。

将样品涡旋混匀，然后在室温下冷却10至15分钟。接着，在10%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入13微升样品以及分子量标记物。将电泳系统连接至电源，设定电压为70伏，持续20分钟，使蛋白质样品从浓缩胶迁移至分离胶。

此后，将电压升至125伏，电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白质ladder迁移至凝胶底部。使用湿转电泳系统，在100伏条件下将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，持续约100分钟。接着，将膜置于4%牛血清白蛋白溶液中，在室温下孵育90分钟进行封闭。

在4摄氏度下，将印迹膜在一抗溶液中孵育过夜。次日，用PBST洗涤印迹膜三次，每次洗涤七分钟。随后在室温下，将印迹膜置于二抗溶液中孵育90分钟。

然后用PBST洗涤四次，每次洗涤持续七分钟。使用化学发光检测试剂盒，按照制造商的说明书进行显影。用透明塑料膜覆盖显影后的印迹膜，随后使用 commercially available 的化学发光成像系统采集印迹的化学发光图像。

制备新鲜样品后，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在 25 摄氏度下以 100,000 ×g 超速离心 60 分钟。随后，将含有未结合 tau 的上清液各 120 微升转移至分别标记的干净离心管中。

向含有结合态 tau 的沉淀中加入 120 微升 Fibic 样品缓冲液。充分混匀后，通过涡旋振荡和移液操作，将混合物转移至洁净且已标记的离心管中。在制备好蛋白浓度相当的样品后，加入含有 400 毫摩尔 DTT 的新鲜 4×SDS 凝胶上样缓冲液。

使用加热金属块在 100 摄氏度孵育样品 5 分钟。涡旋振荡样品，然后在室温下冷却 10 至 15 分钟。在 10% 聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入 13 微升样品，并同时加入分子量标准蛋白 Marker。

将电泳系统的正极和负极连接至电源，然后将电压设定为70伏，持续20分钟。随后，将电压升至125伏，继续电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白质ladder迁移至凝胶底部。使用湿转电印迹系统，在100伏条件下电转约100分钟，将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。

将膜置于含4%牛血清白蛋白的溶液中，室温孵育90分钟。随后，在4°C下与一抗溶液孵育过夜。次日，用PBST缓冲液洗涤膜4次，每次洗涤持续7分钟。

将洗涤后的印迹膜在相应的二抗溶液中室温孵育90分钟。随后用PBST洗涤7分钟，共重复洗涤四次。使用化学发光试剂盒显影印迹膜。

用透明塑料膜覆盖，使用化学发光成像系统采集图像。首先，将盖玻片放入六孔组织培养板的孔中，然后在推荐的培养基中每孔接种 250,000 个细胞。24 小时后，用 PBS 洗涤细胞两次。

加入含姜黄素的无血清MEM培养基，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育24小时。随后，再次用预冷的PBS洗涤细胞。在37摄氏度孵育箱中避光条件下，用3.7%甲醛固定细胞。

用 PBS 洗涤细胞，然后在冰冻甲醇中于 20 摄氏度固定细胞 15 分钟。随后，将细胞在含有 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 中冰浴孵育 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞，然后在封闭缓冲液中室温孵育一小时。

接下来，向每个孔中的聚偏氟乙烯膜小片加入 60 µL 一抗溶液。将盖玻片放置好，使细胞与抗体溶液接触。在 4 °C 黑暗湿盒中孵育过夜。

第二天，用 PBS 洗涤细胞四次。向每块聚偏二氟乙烯膜上加入 80 µL 二抗溶液，并放置盖玻片，使细胞与二抗溶液接触。在室温下的避光湿盒中孵育两小时。

此后，用 PBS 洗涤细胞四次。将样品置于含 DAPI 的封片剂中封片，然后将盖玻片固定在载玻片上。随后在室温下避光孵育一个半小时。

使用共聚焦显微镜观察载玻片。在本研究中，采用磷酸化 tau 蛋白抗体来评估特定的 tau 蛋白磷酸化位点。经姜黄素处理的细胞显示，随着姜黄素浓度的增加，tau 蛋白表达降低。

另一方面，磷酸化 tau 蛋白的表达在较低浓度姜黄素处理下呈现增加趋势，仅在非常高浓度时才有所下降。随后检测经氯化锂处理的细胞。可见，在氯化锂处理条件下，tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白的表达均显著降低。

随后通过磷酸酶实验评估总体磷酸化水平。与未经处理的对照样品相比，经磷酸酶处理的样品中Tau蛋白的迁移速度更快，表明对照样品中的Tau蛋白发生了磷酸化。经姜黄素处理的细胞样品也显示出非常相似的结果，表明该处理对结直肠癌细胞系并未降低Tau蛋白的磷酸化水平。

经磷酸酶处理与未处理的样品在氯化锂处理的细胞样本中电泳迁移范围几乎相同，表明tau蛋白的磷酸化水平降低。接下来，使用tau 352作为阳性对照，成功建立了细胞样本的微管结合实验。如图所示，姜黄素和低浓度氯化锂处理均导致微管结合活性受到抑制。

随后进行共聚焦显微镜观察。经姜黄素处理后，可见 tau 蛋白转位至细胞核内。该结果支持了早期研究的发现，即核内 tau 蛋白在神经元 DNA 保护中起关键作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何开展磷酸酶活性检测，以确定蛋白质样品的整体磷酸化水平，以及如何进行微管结合实验。您还应能够掌握如何利用较少量的抗体，通过共聚焦显微镜执行免疫荧光检测。本视频所介绍的实验方法具有较高的成本效益，有望促进针对不同tau蛋白病及癌症的新型治疗药物的发现与开发。