Name: 大肠癌细胞中磷酸化和微管结合与 Tau 蛋白定位的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜测定大肠癌细胞中Tau蛋白的磷酸化水平、微管结合能力及亚细胞定位的技术方法。该方案适用于癌症与神经退行性疾病研究，具有抗体用量少、操作简便的优势。

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本研究是作为韩国海洋水产部资助的项目“海洋微藻高价值化妆品原料的开发与产业化”的一部分而开展的，并得到了韩国科学技术院（KIST）江陵天然产物研究所所内基金（2Z04930）的支持。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>向 1 mL 的 1× 放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中加入 10 µL（1 mM）苯甲基磺酰氟溶液、10 µL（1×，来自 100× 储存液）蛋白酶抑制剂混合溶液和 10 µL（1×，来自 100× 储存液）磷酸酶抑制剂混合溶液，以制备完全 RIPA 裂解缓冲液。</li>
	<li>制备 10× 通用微管蛋白缓冲液（PEM 缓冲液）。
	<ol>
		<li>在 50 mL 离心管中加入 800 mM（6.0474 g）哌嗪-N-N'-双(2-乙磺酸)、10 mM（95.1 mg）乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸、10 mM（51 mg）MgCl2 和 1.25 M（3 mL 的 10 M 溶液）NaOH，加入 15 mL 蒸馏水，使用涡旋振荡器混匀并溶解。检测 pH 值（应为 6.9）。若 pH &#62; 6.9，则弃去该缓冲液并重新配制新的一批。 
		注意：NaOH 浓度应低于 1.25 M，以确保 pH 值不会超过 6.9。不建议使用 HCl 调节 pH &#62;6.9 的情况。</li>
		<li>逐滴加入 NaOH 至 pH 达到 6.9。用蒸馏水定容至 25 mL，得到 10× PEM 缓冲液。最后使用注射器和 0.2 µm 注射式滤器过滤。将该缓冲液分装至 1.5 mL 离心管中，于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备含还原剂和染料的 5× 上样缓冲液。
	<ol>
		<li>将 300 µL（60 mM）1 M Tris-HCl（pH 6.8）、2.5 mL（25%）50% 甘油、1 mL（2%）10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 1.2 mL 蒸馏水混合，配制成 5 mL 的 5× SDS 上样缓冲液。于 −20 °C 保存。 
		注意：由于甘油黏稠，准确量取 1.25 mL 甘油较为困难。1 mL 100% 甘油的质量为 1.26 g。因此，可先在 15 mL 离心管中称取 1.575 g 100% 甘油（相当于 1.25 mL 100% 甘油或 2.5 mL 50% 甘油），再与其他组分充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养、姜黄素或氯化锂处理及蛋白表达检测
<ol>
	<li>加入约 1 × 106 将HCT 116细胞接种至含最小必需培养基（MEM）的100 mm组织培养皿中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。培养一天后，细胞融合度将达到60–70%。 
	注意：所需培养皿的数量取决于下述处理方案的数量。</li>
	<li>当细胞达到约65%融合度（通过显微镜估算）时，移除添加了补剂的MEM培养基，加入含5 µM、10 µM和30 µM姜黄素或25 mM、50 mM和100 mM LiCl的无血清MEM培养基。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育24小时2.</li>
	<li>处理24小时后，用1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，用细胞刮刀刮取细胞。将刮下的细胞转移至1.5 mL离心管中，以1,800 x g离心4分钟 g 在 4 °C 下离心以获得细胞沉淀。</li>
	<li>在4 °C下，将沉淀重悬于100 µL完全RIPA裂解缓冲液中，孵育20分钟，期间定期轻弹管壁以裂解细胞。随后对样品进行短暂超声处理。</li>
	<li>将细胞匀浆在台式离心机中以 22,570 x g 离心 g 4 °C 下离心 20 分钟。用移液器将上清液转移至其他已标记的离心管中。</li>
	<li>通过Bradford法测定上清液中的蛋白质浓度45 使用商用蛋白质检测试剂盒。</li>
	<li>制备细胞裂解液样品，使各样品蛋白浓度相等（每13 µL样品含10 µg蛋白），并加入4X SDS上样缓冲液。新鲜配制含400 mM二硫苏糖醇（DTT）的4X SDS上样缓冲液。 
	注意：如有需要，样品可在此阶段于 −20 °C 保存。</li>
	<li>将样品置于95 °C的加热块中孵育5分钟。使用涡旋振荡器混匀样品，并静置冷却约10–15分钟。</li>
	<li>组装电泳系统.
	<ol>
		<li>每孔上样 10 µg 蛋白质（13 µL 样品）至 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳（SDS-PAGE）。在凝胶的一个泳道中加入分子量标准品。 
		注意：电泳开始后，蛋白ladder将分离出具有表观分子量的蛋白条带。利用这些条带估计未知蛋白条带的分子量。</li>
		<li>上样后，将电泳系统的正极和负极连接至电源，以维持恒定电压。初始阶段以70 V电泳20分钟，使蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶。随后将电压升至125 V，继续电泳约70–120分钟，直至样品及蛋白质ladder迁移至凝胶底部。</li>
		<li>电泳完成后，使用湿转电泳系统将凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在100 V条件下转移约100分钟。封闭&#160;将膜置于4%牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液中，于约25 °C室温下孵育90分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用分子量标记物一侧的印迹膜进行剪切以标记位置。使用透明塑料片和锋利的切割工具进行切割。配制一抗溶液（抗tau抗体按1:5,000稀释；抗磷酸化tau抗体按1:4,000稀释），并将印迹膜于4 °C在该溶液中孵育过夜。</li>
	<li>过夜孵育后，用磷酸盐缓冲液-吐温-20（PBST）溶液洗涤印迹膜，每次7分钟，重复四次。</li>
	<li>配制相应的二抗溶液（羊抗兔或羊抗小鼠 IgG，1:5,000），将印迹膜在该溶液中室温（约 25 °C）孵育 90 分钟。用 PBST 洗涤四次，每次 7 分钟。</li>
	<li>使用化学发光检测试剂盒，按照制造商的推荐步骤进行显影。用透明塑料膜覆盖印迹膜，通过化学发光成像系统采集图像。&#160;使用相关软件进行化学发光检测。</li>
</ol>
3. 磷酸酶检测
<ol>
	<li>将细胞裂解液（来自步骤 2.5）在碱性磷酸酶缓冲液中用碱性磷酸酶处理。
	<ol>
		<li>对于对照组和处理组样品，分别制备含有20 µg总蛋白的20 µL样品。加入含20 µg总蛋白的细胞裂解液体积，随后加入2 µL碱性磷酸酶缓冲液和10 µL碱性磷酸酶。用蒸馏水补足至20 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 37 °C 下孵育样品 1 小时。通过加入乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 50 mM，或加入正钒酸钠（Na3视频操作4)至终浓度为10 mM。也可在75 °C加热5分钟以终止反应。</li>
	<li>在样品与磷酸酶孵育完成前，制备相同浓度但未添加磷酸酶的样品，用于与经磷酸酶处理的样品进行比较。</li>
	<li>加入新配制的含 400 mM DTT 的 4X SDS 上样缓冲液。</li>
	<li>将样品置于95 °C的金属浴中孵育5分钟。使用涡旋振荡器混匀样品。室温下冷却约10–15分钟。</li>
	<li>组装用于运行10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的电泳系统。
	<ol>
		<li>每孔上样10 µg蛋白质（13 µL样品）至10%聚丙烯酰胺凝胶中，并上样分子量标记物。</li>
		<li>上样后，将电泳系统的正极和负极连接至电源，以维持恒定电压。初始阶段以70 V运行20分钟，使蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶。随后将电压升至125 V，继续电泳约70–120分钟，直至样品及蛋白质ladder迁移至凝胶底部。</li>
		<li>电泳完成后，使用湿转电泳系统将凝胶转移至PVDF膜上，在100 V电压下转移约100分钟。</li>
		<li>在分子量标记一侧的边缘用透明塑料片和锋利的刀片对印迹膜进行小切口标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阻断&#160;膜&#160;在室温下用4% BSA封闭缓冲液封闭90分钟。</li>
	<li>在4 °C下，将印迹膜置于一抗溶液（抗tau抗体，1:5,000稀释）中孵育过夜。用PBST洗涤印迹膜四次，每次7分钟。</li>
	<li>配制相应的二抗溶液（山羊抗小鼠 IgG，1:5,000），室温孵育 90 分钟。用 PBST 洗涤四次，每次 7 分钟。</li>
	<li>使用化学发光检测试剂盒，按照制造商的推荐方法进行显色。将膜用透明塑料膜包裹，使用化学发光成像系统及相应软件采集化学发光图像。</li>
</ol>
4. 微管结合实验
<ol>
	<li>进行微管结合实验时，重复步骤 2.1–2.6。</li>
	<li>从 4 °C 保存的 10X PEM 缓冲液中配制 1X PEM 缓冲液（2 mL），加入 20 µM（40 µL）紫杉醇和 1 mM（20 µL）GTP。从 −80 °C 冰箱中取出微管（MT）储备液，从 −20 °C 冰箱中取出 E. coli tau 工作液。</li>
	<li>根据表 1准备样品。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟。在 25 °C 下以 100,000 x g 超速离心 60 分钟。</li>
	<li>将含有未结合 tau 的上清液 120 µL 转移至洁净并标记好的离心管中。</li>
	<li>向含有结合态 tau 的沉淀中加入 120 µL（与上清液体积相同）5X 样品缓冲液，充分混匀。将溶液转移至洁净并标记好的离心管中，再次充分混匀。</li>
	<li>测定蛋白浓度（参见步骤 2.6）。 
	注意：在制备样品时，使用步骤 4.6 中所得溶液的体积，分别制备沉淀和上清液样品。</li>
	<li>制备等蛋白浓度的样品，并加入新配制的含 DTT（400 mM）的 4x SDS 上样缓冲液。 
	注意：此阶段样品可在 −20 °C 保存。</li>
	<li>重复步骤 3.5–3.10。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td colspan="2">名称</td>
			<td colspan="2">所需微管蛋白</td>
			<td colspan="2">主要所需蛋白</td>
			<td colspan="2">PEM-GTP-PTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">HCT 116-对照 (6.21 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">9.66 μl (60 μg)</td>
			<td colspan="2">108.34 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">HCT 116-姜黄素 10 μM (4.81 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">16.63 μl (80 μg)</td>
			<td colspan="2">101.37 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">HCT 116-姜黄素 20 μM (3.28 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">30.49 μl (100 μg)</td>
			<td colspan="2">87.51 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">18.42 μl (100 μg)</td>
			<td colspan="2">99.58 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">E. coli tau</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">1 μl tau-352</td>
			<td colspan="2">117 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">仅微管蛋白</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">X</td>
			<td colspan="2">118 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">每份 120 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：微管结合实验的样品制备。
5. 姜黄素处理细胞后 Tau 蛋白的定位与表达
<ol>
	<li>使用70%乙醇清洁盖玻片，并用实验室纸巾将其擦干。在标记好的6孔组织培养板的每个孔中放入一片盖玻片。将培养板置于生物安全柜中，并打开紫外灯照射至少3小时。</li>
	<li>传代细胞，并以每孔 2.5 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 6 孔板的相应孔中5 细胞/孔，置于推荐的培养基中。</li>
	<li>约24小时后，使用倒置显微镜，通过10倍和40倍物镜观察细胞，检查细胞形态变化。必要时拍照记录。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞两次。在 37 °C 培养箱中避光条件下，用 3.7% 甲醛固定细胞。 
	注意：室温下使用甲醛固定同样效果良好。操作甲醛时需佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞。将细胞置于预冷的甲醇中，于 −20 °C 固定 15 分钟。将细胞置于含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液中，冰上孵育 10 分钟以进行通透处理。用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>将细胞在封闭缓冲液（含3% BSA和0.1% Tween-20的PBS溶液）中室温孵育1小时。 
	注意：在 4 °C 下孵育 2 小时同样效果良好。</li>
	<li>在含 3% BSA 和 0.1% Tween-20 的 PBS 中配制一抗（抗 tau 抗体，1:200）溶液（例如，2 µL tau-13 抗体溶于 0.4 mL 缓冲液中。</li>
	<li>将PVDF膜切成小片，使其能够恰好放入6孔板的每个孔中；用蒸馏水浸泡5分钟。将切好的PVDF膜分别放入各孔中。</li>
	<li>向每个孔中的PVDF膜小片加入60 µL一抗溶液。将盖玻片放置妥当，使细胞能够接触一抗溶液。在4 °C避光湿盒中孵育过夜。用PBS洗涤四次。</li>
	<li>在含3% BSA和0.1% Tween-20的PBS中配制二抗溶液（荧光素偶联594抗小鼠IgG，1:400）。</li>
	<li>将PVDF膜切成小片，使其能够恰好放入6孔板的每个孔中，用蒸馏水浸泡5分钟。将切好的PVDF膜放入各孔中。</li>
	<li>向6孔板中的每块PVDF膜加入80 µL二抗溶液。将盖玻片放置妥当，使细胞能够接触到二抗溶液。室温下于避光湿盒中孵育2小时。用PBS洗涤四次。</li>
	<li>使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，并将盖玻片固定在载玻片上。
	<ol>
		<li>在载玻片上滴加一滴含DAPI的封片剂。从每个孔中取出盖玻片，放置于含有含DAPI封片剂的载玻片上。确保每张含有染色细胞的盖玻片表面与对应载玻片上的封片剂接触。</li>
		<li>在每张盖玻片周围涂抹指甲油，以密封并将其牢固固定在载玻片上。如有需要，可重复此步骤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在避光环境中室温孵育1.5小时。</li>
	<li>在暗室中，使用浸油覆盖盖玻片，通过共聚焦显微镜观察载玻片。</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本研究建立了检测经姜黄素和氯化锂处理的结直肠癌细胞中总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的不同实验条件。为评估蛋白样品中tau蛋白的整体磷酸化状态，本文描述了一种磷酸酶活性检测方法。该方法有望用于检测任何蛋白的磷酸化状态。
该实验基于磷酸化蛋白的迁移速度慢于其非磷酸化状态的原理。本方案中使用了碱性磷酸酶和碱性磷酸酶缓冲液。将检测组分加入细胞裂解物后，样品应在特定温度下孵育一段特定的最佳时长。孵育结束后，样品需在SDS上样缓冲液中煮沸以终止反应。此前，评估tau蛋白与微管结合的方法可能采用过不同的实验方案。本文所展示的微管结合实验操作简便，并包含阳性和阴性对照，利用上清液和沉淀组分实现质量控制。仅含微管（MT-only）的阴性对照用于验证微管本身不含有任何结合的内源性tau蛋白。此外，使用纯化的人类tau-352蛋白（一种可结合微管的tau蛋白）作为阳性对照。为分离微管结合组分（沉淀）与非结合组分（上清液），采用了超速离心法；由于此类超速离心机价格昂贵且并不普及，该步骤可能成为实验的限制因素。此外，由于样品用量较少，需使用带有适配器的细长型离心管以适配超速离心机转子。尽管此类离心管可重复使...

Tau最初被鉴定为一种热稳定的微管相关蛋白，可与微管蛋白共纯化1。Tau仅在高等真核生物中表达2,3,4。Tau的主要功能是调控微管的组装1,5,6，同时也参与微管的聚合7、轴突运输8、轴突直径的变化9、神经元极性的形成以及神经退行性变10。Tau还作为蛋白支架，调控某些信号通路。大鼠脑部研究表明，Tau具有神经元特异性，主要定位于轴突中11。由于Tau对微管聚合和神经元发育至关重要，人们曾假设其在中枢神经系统轴突发育中发挥重要作用，该假设随后通过体外（in vitro）和体内（in vivo）实验得到证实。除神经元外，Tau也在多种非神经元细胞中表达，包括肝、肾和肌肉细胞12,13。Tau在人乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌和胰腺癌的细胞系及组织中也有表达14,15,16,17,18,19。在包涵体肌炎中，Tau也以包涵体内的扭曲管状细丝形式存在20。
Tau蛋白可能携带多种翻译后修饰。在所有翻译后修饰中，磷酸化是最常见的一种。Tau蛋白磷酸化程度的增加会降低其与微管的亲和力，最终导致细胞骨架不稳定。在从人类阿尔茨海默病脑组织中分离出的Tau蛋白中，已发现85个磷酸化位点。在这些位点中，53%为丝氨酸残基，41%为苏氨酸残基，仅6%为酪氨酸残基21,22,23。Tau蛋白的磷酸化影响其定位、功能、结合能力、溶解性以及对其他翻译后修饰的易感性。当Tau蛋白的磷酸化程度超过正常水平（或被磷酸基团完全饱和）时，称为过度磷酸化，这种状态可模拟阿尔茨海默病的结构与功能特征24。在生理条件下，Tau蛋白维持轴突微管的正常功能，确保神经元的正常运作。然而，过度磷酸化的Tau蛋白无法维持有序的微管结合，导致微管解聚，进而引起神经元丢失。正常的Tau磷酸化水平对其正常功能至关重要，但当其特征性磷酸化水平发生改变或出现过度磷酸化时，Tau蛋白将无法正常发挥作用25。在阿尔茨海默病及某些其他年龄相关的神经退行性疾病中，Tau蛋白发生过度磷酸化，并形成成对的螺旋纤维和神经原纤维缠结26,27。因此，检测Tau蛋白磷酸化状态及其与微管结合能力的方法具有重要意义。
结直肠癌是一种与衰老相关的癌症，为男性和女性中第三大常见诊断癌症，也是导致死亡的第三大癌症28结直肠癌是西方国家主要致死性癌症之一29由于结直肠癌和阿尔茨海默病均与衰老相关，且主要发生在饮食习惯相似的发达国家，这两种疾病之间可能存在某种关联。此外，tau蛋白阳性与tau蛋白阴性的癌细胞对化疗药物的反应不同。 例如，紫杉醇16.
姜黄素是印度香料姜黄（Curcuma longa）的主要衍生物之一30。数个世纪以来，南亚人群每日饮食中均摄入姜黄。姜黄素可用于治疗多种疾病，包括结直肠癌、阿尔茨海默病、糖尿病、囊性纤维化、炎症性肠病、关节炎、高脂血症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病31,32,33,34,35,36,37,38。锂也可杀死结直肠癌细胞或抑制其增殖39。锂还可用于治疗阿尔茨海默病40，因为在转基因小鼠模型中观察到锂可减少tau蛋白聚集并防止其过度磷酸化41,42,43,44。
本手稿旨在：1）测定经处理细胞中总 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白的表达水平；2）描述一种用于检测 tau 蛋白整体磷酸化水平的磷酸酶活性测定方法；3）检测 tau 蛋白与微管的结合能力；以及 4）通过共聚焦显微镜观察经姜黄素或氯化锂处理的结直肠癌细胞系中 tau 蛋白的定位。结果表明，使用姜黄素（一种被认为对结肠癌具有良好化疗潜力的化合物）或氯化锂处理细胞，均可降低结直肠癌细胞系中总 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白的表达水平。这些处理还可导致 tau 蛋白发生核转位。然而，出乎意料的是，姜黄素未能改善 tau 蛋白与微管的结合能力。

<table><tbody><tr><td>HCT 116 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>MEM (EBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>16000044</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>WelGene</td><td>LS 015-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430161</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>Coster 3516</td><td></td></tr><tr><td>抗 Tau 13 抗体</td><td>abcam</td><td>ab19030</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Roche</td><td>10 708 984 001</td><td>储存温度 2&amp;ndash;8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>MIKRO 200 R</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td>储存温度 2&amp;ndash;8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>姜黄素</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>78246</td><td>储存温度 2&amp;ndash;8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>微管 (MT)</td><td>Cytoskeleton</td><td>MT001</td><td>4 &amp;deg;C 避湿保存</td></tr><tr><td>含 DAPI 的封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>4 &amp;deg;C 避光保存</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>WelGene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 500</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>分子成像仪</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc XRS+</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>蛋白检测试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-微管蛋白 (11H10) 兔单克隆抗体</td><td>Cell signalling</td><td>2125</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体</td><td>Cell signalling</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>抗 Tau (磷酸化 S396) 抗体</td><td>abcam</td><td>ab109390</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>FastAP 热敏碱性磷酸酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Cell Signalling</td><td>5870</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Cell Signalling</td><td>5871</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R 0278</td><td>储存温度 2&amp;ndash;8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Tau-352 人源蛋白</td><td>Sigma</td><td>T 9950</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X - 100</td><td>约 25 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11005</td><td>4 &amp;deg;C 避光保存</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

结直肠癌细胞中 tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

微管相关蛋白tau是一种主要定位于轴突的神经元蛋白。通常情况下，tau对神经元的正常功能至关重要，因为它参与微管的组装和稳定。除神经元外，tau还在人类乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌中表达，且其结构与功能几乎与神经元中的tau相同。tau的表达量及其磷酸化状态可改变其作为微管稳定剂的功能，并导致多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中成对螺旋纤维的形成。因此，确定tau的磷酸化状态及其与微管的结合特性具有重要意义。此外，在不同疾病中研究tau的细胞内定位也十分重要。本文详细描述了在有或无姜黄素和氯化锂处理的结直肠癌细胞中检测tau磷酸化水平及tau与微管结合能力的标准实验方案。这些处理可用于抑制癌细胞的增殖与发展。通过免疫组织化学和共聚焦显微镜技术，并使用少量抗体，可检测tau的细胞内定位。这些检测方法可重复用于筛选影响tau过度磷酸化或微管结合能力的化合物。这些方案有望用于表征针对不同tau蛋白病的新型治疗药物或相关抗癌剂。

在用不同浓度的姜黄素或LiCl处理细胞后，检测了总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的表达水平（图1）。用三种不同浓度的姜黄素处理细胞后，tau蛋白的表达水平降低；然而，低浓度姜黄素处理使磷酸化tau蛋白表达升高，而高浓度姜黄素处理则导致磷酸化tau蛋白表达下降。使用抗磷酸化tau蛋白（Ser396）抗体检测磷酸化tau蛋白。用三种不同浓度的LiCl处理细胞后，总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的水平均下降（图1）。既往研究表明，tau蛋白的表达水平在不同癌症类型以及同种癌症的不同部位存在差异。关于结直肠癌的前期数据显示，tau蛋白在两种结直肠癌细胞系（HCT 116和SW480）中表达，并且发生磷酸化19。用5 µM姜黄素处理的细胞中，磷酸化tau蛋白水平高于未处理细胞。在相同浓度姜黄素处理的细胞中，磷酸化tau蛋白水平高于总tau蛋白水平。用10 µM姜黄素处理细胞后，磷酸化tau蛋白水平较未处理细胞降低，但仍高...

本文描述了检测tau蛋白过度磷酸化、tau蛋白与微管结合能力以及药物处理后细胞内tau蛋白定位的标准实验方案。这些方案可重复用于筛选靶向tau蛋白过度磷酸化或微管结合的药物或其他化合物。

结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

微管相关蛋白tau是一种主要定位于轴突的神经元蛋白。通常情况下，tau对神经元的正常功能至关重要……

本实验的总体目标是利用共聚焦显微镜研究结直肠癌细胞中 tau 蛋白的磷酸化、微管结合能力及其定位。该方法可广泛应用于大多数生物研究领域，特别是在癌症和痴呆症研究中，其中磷酸化和微管结合是重要的影响因素。本研究所采用的磷酸酶检测方法的主要优势在于，它能够简便地整体评估蛋白质样品的磷酸化状态。主要优点在于微管结合实验是一种将微管结合蛋白与非结合组分分离的简单方法。然而，tau蛋白定位技术的主要优势在于其仅需相对少量的一抗和二抗。开始此实验前，请按照文本方案中所述准备所有试剂。将约一百万个 HCT 116 细胞转移至含有最低必需培养基（补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）的培养皿中。当细胞融合度达到 65% 时，使用吸管移除添加了胎牛血清的培养基，随后加入无血清的最低必需培养基，其中含有姜黄素或氯化锂。在含5%二氧化碳的湿润环境中37摄氏度孵育24小时。随后，用10毫升冰预冷的PBS洗涤细胞。加入1毫升冰预冷的PBS，然后使用细胞刮刀刮取细胞，并将其转移至1.5毫升离心管中。在4°C、1800 × g条件下离心4分钟。将细胞沉淀重悬于100 µL预冷的完全RIPA裂解缓冲液中，4°C孵育20分钟，期间定期轻弹管壁以促进细胞裂解。随后，将样品置于10%振幅条件下进行短暂超声处理，每次超声0.2秒，间歇0.2秒，累计超声时间共2秒。将细胞匀浆在 22,570 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。将上清液转移至新的已标记试管中，然后按照文本方案所述，通过 Bradford 法测定蛋白质浓度。在制备含有 20 微克总蛋白的样品后，向每个样品中加入 2 微升碱性磷酸酶缓冲液和 10 微升碱性磷酸酶。然后加入蒸馏水，使每个样品的终体积为 20 微升。将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。在样品孵育的同时，制备相同浓度但不含磷酸酶的对照样品用于比较。反应一小时后，加入终浓度为 50 毫摩尔的 EDTA 或终浓度为 10 毫摩尔的原钒酸钠以终止反应。加入新配制的含 400 毫摩尔 DTT 的 4X SDS 凝胶上样缓冲液。使用金属浴，将样品在 100 摄氏度下孵育 5 分钟。将样品涡旋混匀，然后在室温下冷却10至15分钟。接下来，在10%聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入13 µL样品，并同时加入分子量标记物。将电泳系统连接至电源，设定电压为70 V，电泳20分钟，使蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶。此后，将电压升至125伏，电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白质ladder迁移至凝胶底部。使用湿式电转印系统，在100伏条件下将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，约100分钟。接着，将膜置于4%牛血清白蛋白溶液中，在室温下孵育90分钟进行封闭。将印迹膜在4摄氏度下于一抗溶液中孵育过夜。次日，用PBST洗涤印迹膜三次，每次洗涤七分钟。随后在室温下用二抗溶液孵育90分钟。然后用PBST洗涤四次，每次洗涤持续七分钟。使用化学发光试剂盒，按照制造商的说明进行显色。将显色后的印迹膜用透明塑料膜覆盖，然后使用 commercially available 的化学发光成像系统采集印迹膜的化学发光图像。制备新鲜样品后，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在 25 摄氏度下以 100,000 × g 超速离心 60 分钟。随后，将含有未结合 tau 的各上清液 120 微升分别转移至分离的、洁净且已标记的试管中。向含有结合态 tau 的沉淀中加入 120 微升 Fibic 样品缓冲液。充分混匀后，通过涡旋振荡和移液操作，将混合物转移至洁净并标记好的离心管中。在制备好蛋白浓度相当的样品后，加入含有 400 毫摩尔 DTT 的新鲜 4X SDS 凝胶上样缓冲液。使用加热金属块在 100 摄氏度孵育样品 5 分钟。涡旋振荡样品，然后在室温下冷却 10 至 15 分钟。在 10% 聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔中加入 13 微升样品，并同时加入分子量标准蛋白 Marker。将电泳系统的正极和负极连接至电源，然后将电压设置为70伏，运行20分钟。随后，将电压升至125伏，继续电泳约70至120分钟，直至样品和蛋白ladder迁移至凝胶底部。使用湿转电印迹系统，在100伏条件下电转约100分钟，将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。将膜在4%牛血清白蛋白中室温孵育90分钟。然后在4°C下与一抗溶液孵育过夜。次日，用PBST洗涤膜4次，每次洗涤持续7分钟。将洗涤后的印迹膜在相应的二抗溶液中室温孵育90分钟。随后用PBST洗涤7分钟，共重复洗涤四次。使用化学发光试剂盒显影印迹膜。用透明塑料膜覆盖，并使用化学发光成像系统采集图像。首先，将盖玻片放入六孔组织培养板的孔中，然后在推荐的培养基中每孔接种250,000个细胞。24小时后，用PBS洗涤细胞两次。加入不含血清的MEM培养基，其中含有姜黄素，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育24小时。之后，再次用预冷的PBS洗涤细胞。在37摄氏度的培养箱中避光条件下，用3.7%甲醛固定细胞。用 PBS 洗涤细胞，然后在冰冻甲醇中于 20 摄氏度固定细胞 15 分钟。随后，将细胞在冰上用含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液孵育 10 分钟。再次用 PBS 洗涤细胞，然后在封闭缓冲液中于室温孵育 1 小时。接下来，向每个孔中的聚偏二氟乙烯膜小片加入 60 µL 一抗溶液。将盖玻片放置好，使细胞与抗体溶液接触。在 4 °C 避光湿盒中孵育过夜。第二天，用 PBS 清洗细胞四次。向每块聚偏二氟乙烯膜上加入 80 µL 二抗溶液，并加盖盖玻片，使细胞与二抗溶液接触。在室温下的避光湿盒中孵育两小时。此后，用 PBS 洗涤细胞四次。将样品置于含 DAPI 的封片剂中封片，然后将盖玻片固定在载玻片上。随后在室温下的避光环境中孵育一个半小时。使用共聚焦显微镜观察载玻片。在本研究中，采用磷酸化 tau 蛋白抗体评估特定的 tau 蛋白磷酸化位点。随着姜黄素浓度的增加，经姜黄素处理的细胞显示出 tau 蛋白表达降低。另一方面，磷酸化 tau 蛋白的表达在较低浓度的姜黄素处理下呈现增加趋势，仅在非常高浓度时才开始下降。随后检测经氯化锂处理的细胞。由此可见，在氯化锂处理条件下，tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白的表达均显著降低。随后通过磷酸酶实验评估总体磷酸化水平。与未经处理的对照样品相比，经磷酸酶处理的样品中Tau蛋白迁移速度更快，表明对照样品中的Tau蛋白处于磷酸化状态。经姜黄素处理的细胞样品结果与此相似，表明该处理对结直肠癌细胞系中的Tau蛋白磷酸化水平无明显降低作用。经磷酸酶处理与未处理的样品在氯化锂处理的细胞样本中电泳迁移范围几乎相同，表明tau蛋白的磷酸化水平降低。接下来，以tau 352作为阳性对照，成功建立了细胞样本的微管结合实验。如图所示，姜黄素和低浓度氯化锂处理均导致微管结合活性受到抑制。随后进行共聚焦显微镜观察。经姜黄素处理后，可见tau蛋白转位至细胞核内。该结果支持先前研究，即核内tau蛋白在神经元DNA保护中发挥关键作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展磷酸酶活性检测，以确定蛋白质样品的整体磷酸化水平，以及如何进行微管结合实验。您还应能够掌握如何利用较少量的抗体，通过共聚焦显微镜执行免疫荧光检测。本视频所展示的实验步骤具有较高的成本效益，有望为治疗不同类型tau蛋白病及癌症的新型治疗药物的发现与开发提供帮助。

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大肠癌细胞中磷酸化和微管结合与 Tau 蛋白定位的测定

本视频介绍了一种通过磷酸酶活性检测来评估结直肠癌细胞中tau蛋白磷酸化状态的实验方案。磷酸酶可作用于tau蛋白上的磷酸基团，使tau蛋白在SDS-PAGE凝胶中的迁移率较未经处理的tau蛋白样品提高。...

结直肠癌细胞中的磷酸酶活性检测：一种检测结直肠癌细胞中Tau蛋白磷酸化状态的方法

本视频介绍了微管结合实验，该实验用于分离结直肠癌细胞中具有微管结合能力的tau蛋白与无结合能力的过度磷酸化tau蛋白组分。该实验有助于确定各种化学物质对tau蛋白磷酸化状态的影响，进而评估其对tau蛋白微管结合能力的作用。...

结直肠癌细胞中微管结合实验：一种检测结直肠癌细胞中微管结合Tau蛋白的方法

匀浆组织以将蛋白质释放到缓冲液中。蛋白酶抑制剂可阻断蛋白酶活性，防止蛋白质降解。...

利用蛋白质印迹分析法检测小鼠脑组织样本中的磷酸化Tau蛋白

本视频演示了利用核磁共振波谱法（NMR）技术鉴定蛋白质中多个磷酸化位点的方法。蛋白质在特定氨基酸位点发生磷酸化会导致邻近酰胺氢的去屏蔽效应，从而产生谱图差异。...

利用核磁共振波谱法鉴定蛋白质中的多位点磷酸化

本视频展示了一种基于细胞的检测方法，该方法利用pH敏感的荧光标记Tau蛋白聚集体，通过荧光激活细胞分选技术定量分析小鼠小胶质细胞对Tau蛋白的摄取。...

一种基于细胞的检测方法用于评估小胶质细胞对Tau蛋白的摄取

未修饰和过度磷酸化的tau蛋白被用于两个实验 体外...

体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

本文介绍了一种利用核磁共振波谱法（NMR）鉴定内在无序蛋白多位点磷酸化的方法，并以Tau蛋白为例进行说明。重组Tau蛋白经同位素标记并修饰 体外...

用于鉴定内在无序蛋白多重磷酸化的核磁共振波谱法

本文介绍一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取，旨在建立一种研究工具，以更深入地表征抗tau抗体作用机制。...

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白

Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，可结合微管，同时也存在于细胞核内，在其中发挥非常规功能，包括调控与阿尔茨海默病相关基因的表达。本文介绍一种在排除细胞质 Tau 干扰的情况下研究核内 Tau...

通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

微管是由微管蛋白聚合而成的结构，在真核细胞中作为细胞骨架的重要组分发挥关键作用，并以其动态不稳定性而著称。本研究建立了一种微管分级分离方法，可将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白，以评估微管在多种小鼠组织中的稳定性。...

定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

学习利用共聚焦显微镜测定大肠癌细胞中Tau蛋白的磷酸化水平、微管结合能力及亚细胞定位的技术方法。该方案适用于癌症与神经退行性疾病研究，具有抗体用量少、操作简便的优势。

结直肠癌细胞中 Tau 蛋白磷酸化、微管结合及其定位的检测方法

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