小容积回收-灌注-浸没式室系统中维持的急性海马切片的突触可塑性记录

该程序的总体目标是提供一种方法来确保简化小体积回收 ACSF 的碳化方法，并使用安装在荧光显微镜上的记录室实现场电位的长期记录。这种方法可以帮助我们回答神经可塑性领域的关键问题，这些问题与在学习和记忆的细胞模式中调节突触传递和记忆形成的潜在木质素途径有关。该技术的主要优点是它有助于稳定小型生物储氢罐的氧含量，以提高使用特定拮抗剂或激动剂的实验的成本效率。

急性海马切片的制备由我们实验室的博士生 Xia 和 Weiguang 演示。要开始此程序，请使用冷手术刀片沿每个半球的背侧边缘以 70 度角解剖一块背皮层。用冷的牙科水泥刮刀，将每个半球转移到一张滤纸上，以短暂干燥表面。

使用速效胶水将两个具有新切割表面的半球安装在冰冷切片平台上，使半球的尾端面向剃须刀片。接下来，将切片平台放入振动切片机的冷却室中。在 2 到 4 摄氏度的切片缓冲液中填充腔室并使其碳化。

之后，使用适当的振动切片机设置切割 350 微米切片。使用两把注射套管作为剪刀，将海马形成与下睑和内嗅皮层分离。使用巴斯德移液管从先前准备好的培养室的切片保持网中去除气泡。

然后，用大口巴斯德吸管将金字塔层具有一定透明度的切片从孵化室网格上的切片平台转移。在此步骤中，在回收系统的流出处添加一个三通管接头。将三通管接头的中臂连接到碳素供应管，并使用气流计调节流速。

之后，在回收系统的入口处添加第二个三通管连接器。将中臂连接到面向在线加热器的管子上，将上臂连接到细硅胶管，将下臂连接到储液槽的流入管。然后，将管挤压器放在细硅胶管上，沿管的位置，该位置使 ACSF 在切片室中由周围泵产生的脉动最小。

现在，将一小块镜头清洁纸和固定在 U 形铂丝上的尼龙网在浸没切片室中预浸泡几分钟。之后，取下 U 形铂丝。关闭回收利用并在镜头清洁纸上放一片。

然后，立即将切片固定网格放在切片的顶部。打开泵，让切片平衡 30 分钟，不要将物镜浸入 ACSF 中。同时，用 ACSF 填充记录电极并将其安装到移液器支架中。

将金属刺激电极放入碳酸氢钠溶液中，检查金属刺激电极的绝缘性。将电极连接到直流电压发生器的负极，并在解剖显微镜下观察尖端气泡的形成。接下来，将测试过的 Apoxy 绝缘钨刺激电极放在机械手支架中，将参考线放在切片室中。

将第二个参比电极添加到腔室中，并将其连接到记录电极头部载物台的参比插座。在放大器控制软件中，单击零钳位模式框，然后双击输出增益列表框。选择增益 100，双击高通滤波器框容器，选择 3 kHz，然后双击低通滤波器列表框 AC 以选择 0.1 赫兹。

在录制软件中，单击 acquire （获取）、Open protocol （打开协议）。选择一种协议，该协议的设置允许 10 至 20 kHz 的情景刺激和放大电位的数字化，持续 50 至 100 毫秒，并在情景记录开始后 10 毫秒自动触发刺激隔离器。将刺激和记录电极与金字塔层平行放置。

随后，单击 acquire 和 edit protocol，然后在弹出窗口中选择 trigger 选项卡。单击触发器源框，然后选择空格键作为触发器源。然后，点击 好 按钮，然后单击 记录 按钮开始采集。

在 stimulus isolator 软件中，单击电压控制框并输入零。单击下载按钮。之后，单击录制软件窗口并按空格键。

通过按顺序输入 1000 到 8000 之间的值来重复此循环。将刺激强度与 FEPSP 斜率值相关联，并确定获得 FEPSP 最大斜率的 40% 所需的刺激强度。单击电压控制框并输入确定的值。

然后，单击下载按钮。在录制软件中，单击停止按钮，然后单击 acquire 菜单。单击 Edit protocol（编辑协议），然后在弹出窗口中选择 trigger（触发器）选项卡。

然后，单击触发源框并选择内部计时器作为触发源。单击确定按钮，然后单击记录按钮，每 60 秒开始自动记录场电位。在 30 到 60 分钟后单击停止按钮。

在记录软件中，单击 acquire （获取）、Open protocol （开放协议），然后选择与基线记录相同的协议。点击 好 按钮，然后单击 记录.保持自动运行场电位记录 2 到 4 小时。

完成后，单击 Stop 停止 按钮终止录制。该图显示了使用流出碳ogenation和储层碳ogenation以及小型ACSF储层回收的突触传递活性依赖性增强的代表性记录。在时间点零之后以每秒 100 赫兹的三倍序列诱导增强。

该图显示，与仅使用储层渗碳的实验相比，回收小型 ACSF 储层的流出渗碳提高了 LTD 诱导。一旦掌握，切片制备可以在 5 到 10 分钟内完成，如果执行得当，还可以实现数小时的稳定场电位记录。在尝试此程序时，调整您的碳生成水平、灌注速度、电极的位置和特定等效的刺激应力非常重要。

按照这个程序，可以进行其他方法，如膜片钳、法医显微镜，以回答其他问题，例如响应活动依赖性突触可塑性的诱导，ravin 探针的汁液细胞定位的男性化。开发后，这项技术为神经可塑性领域的研究人员铺平了道路，以探索活动依赖性突触可塑性作为孔 tab 和转基因小鼠基因的体外海马切片中学习和记忆的细胞模式。看完这个视频，你应该对如何从颞叶海马进行急性切片准备，以及如何使用少量回收的 ACSF 获得长期记录突触传递的稳定条件有一个很好的了解。

不要忘记，与动物和化合物一起工作可能是危险的，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和进行适当的消毒。