一个

这种基于营养状态的铜厌恶测定的总体目标是评估线虫对一种厌恶性化学物质和食物来源的反应，为期四小时。这允许同时评估营养状态。该方法可以通过识别在饥饿条件下未能调节运动模式和对厌恶性化学物质的反应的突变体来帮助行为神经科学领域。

这种技术的主要优点是可以在较长的时间段内进行，这允许在四小时内随着蠕虫逐渐饥饿而进行营养状态分析。为了为测定准备实验生物，在开始测定之前24小时，每个流中选取10个L4阶段的线虫，以确保在测试时生物是年轻的成年人。对于每个测试的突变体或对照线虫，选取10个L4。

使用标准方法在标准琼脂平板上使用OP50大肠杆菌培养L4生物24小时。在测定之前24小时，使用尺子和厚的永久性记号笔在先前准备的线虫生长介质或NGM平板的底面沿外缘画一条线。标记一个中间屏障，距离平板每个边缘等距。

在铜屏障的一侧播种50微升的OP50大肠杆菌，以在平板上创建均匀的草地。使用平板底面的标记线确保细菌不会接触到铜溶液。确保铜溶液将沿着平板的边缘并形成中间屏障，并转移细菌以使铜溶液不会接触到食物来源。

标记第二组没有OP50大肠杆菌的平板，作为阴性对照。让细菌干燥，然后在37摄氏度下过夜孵育平板。确保在将线虫转移到37摄氏度的孵化器时不要扰乱细菌块。

过度干扰可能会改变食物块的位置或形状。在过夜孵育后，从孵化器中取出平板，并使用标记的平板底面作为指南，在琼脂边缘吸取100微升新鲜制备的0.5摩尔铜（II）硫酸盐溶液，以创建外侧铜屏障。吸取25微升铜（II）硫酸盐溶液以创建中间屏障。

确保铜（II）硫酸盐溶液不接触细菌块，并允许铜溶液干燥在平板上。每五分钟检查一次干燥情况，用实验室纸轻轻轻拍溶液，在平板边缘区域可以辨别。在测定之前，将实验生物转移到无细菌的琼脂平板上，并允许线虫自由移动一分钟以去除多余的细菌。

接下来，向装有24小时前转移的年轻成人的平板上吸取一毫升M9，以将蠕虫洗入微离心管。以3, 000 x G的速度离心线虫一分钟。蠕虫应在管底形成一个沉淀物。

吸取M9溶液而不破坏蠕虫沉淀物。向蠕虫沉淀物中加入一毫升M9溶液。倒置管子以混合蠕虫和溶液。

如果最初与蠕虫一起转移了多余的细菌，则重复总共五次。在最后一次洗涤后，吸取上清液，直到剩下100微升的M9溶液和蠕虫沉淀物。一旦完成洗涤，立即从溶液中转移蠕虫。

从管底向无细菌的测定平板上吸取20微升的蠕虫沉淀物，确保将10只蠕虫转移到测定平板上，并且不存在污染性食物。不应将细菌转移到铜食物比赛板上。在一分钟内用实验室纸巾将蠕虫上的多余M9溶液去除。

确保M9溶液不接触铜（II）硫酸盐溶液，并且蠕虫和琼脂表面保持完整。丢弃意外被实验室纸巾移除的蠕虫。一旦去除M9溶液，并且所有蠕虫都开始非液体运动模式，即当它们停止翻滚时。

启动测定停表，如果不小心包含了额外的蠕虫，通过用卤烃油拾取它们来移除它们，以确保不会向平板添加细菌。每30分钟检查一次测定平板。对于有细菌块的测定平板，如果生物在四小时内到达食物块，则给予正面评分。

对于阴性对照平板，如果生物已经越过屏障，则给予正面评分。我们利用N2和npr-9功能丧失突变体和npr-9过表达菌株，称为npr-9功能增益，来评估对饥饿和铜厌恶的反应。在测定结束时，100%的野生型生物重新定位到食物来源，而npr-9过表达生物没有调节运动模式以响应食物，并继续越过厌恶屏障，即使在接触到食物来源之后。

在无食物的平板上，n2或npr9功能丧失生物很少越过铜屏障，而npr-9过表达线虫反复越过屏障来回。在尝试这个程序时，重要的是要记住在转移蠕虫和M9时避免扰乱铜屏障，并且要为每个菌株保持一致的条件，以避免混淆因素。