Name: 原位萨尔和 TOF-SIMS希瓦氏菌 oneidensis MR1 生物膜的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解利用SALVI微流控系统和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对Shewanella oneidensis MR-1生物膜进行原位表征的方法。该技术可在自然水合状态下可视化活生物膜的化学空间分布，为环境微生物学研究提供重要工具。

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我们感谢太平洋西北国家实验室（PNNL）地球与生命科学（EBD）任务种子实验室定向研究与开发（LDRD）基金提供的支持。仪器使用权限通过W. R. Wiley环境分子科学实验室（EMSL）的一般用户提案获得。EMSL是由PNNL生物与环境研究办公室（BER）资助的国家级科学用户设施。作者感谢丁元钊博士对稿件的校对并提供有益的反馈意见。PNNL由巴特尔为美国能源部（DOE）依据合同DE-AC05-76RL01830运营。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在对数生长期接种后，重要的是要测试生物膜生长所需的天数和温度，以确保其在成像前已生长至健康且足够厚的状态，具体如步骤3.1所述。本方案特别针对在室温下培养S. oneidensis MR1生物膜；然而，不同的室温会影响其生长速率。因此，在进行ToF-SIMS分析前，必须通过光学成像判断生物膜是否已准备就绪。同样，不同菌株的细菌需要不同的培养条件和时间，以达到适合分析的理想厚度。尽管图1b中的生长曲线显示该细菌的对数生长期为12–32小时，且本实验全程采用24小时作为对数生长期的时间点，但必须注意，对于其他细菌菌株，未经独立测定生长曲线前，不能直接套用此时间。S. oneidensis的对数生长期为12至33小时，选择24小时是因为此时已接近对数期末段，氧气开始限制该微生物的生长速率。实验表明，此时细胞开始产生纳米导线，正处于形成成功生物膜的准备状态，能够在低氧环境中存活3,13。因此，选择在对数生长期使用细菌的具体时间，应基于研究经验以及相关文献中对该特定细菌实验研究的已有知识。此外，必须为将用于生物膜培养的每一种不同细...

细菌生物膜是一类随时间演化形成的、依附于表面的微生物群落，其作为细菌抵御各种不利物理和机械刺激的防御机制，使细胞能够在多种可能的环境中附着并存活。1,2 生物膜已被广泛研究，在生物医学、生物医学工程、农业以及工业研发等多个领域具有重要应用。1,2 理解这些复杂微生物群落的化学分布特征，包括其自身产生的胞外聚合物（EPS）及其局部水簇环境，对于准确而详细地描绘其生物学活性至关重要。2
生物膜存在于高度水合的状态中并在此状态下生长。这给基于真空的表面分析技术（如飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS）的应用带来了巨大挑战，因为难以在真空条件下研究易挥发的液体。因此，基于真空的表面分析技术几乎仅限于对干燥状态下的生物膜样品进行研究。然而，对干燥状态的生物膜进行研究会阻碍对其真实生物学微环境的准确探究。这通常会导致胞外聚合物基质（EPS）完整性和生物膜形态发生显著变化，这一点已在干燥生物膜的质谱结果与原位液相研究的对比中得到证实。3，4 本文介绍了一种利用我们开发的“液-真空界面分析系统”（SALVI）5，6 在生物膜天然水合状态下对其进行研究的解决方案。SALVI 是一种微流控反应器，其由聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成的微通道内含有液体，并由一层薄的氮化硅（SiN）膜密封，从而在维持液相基质在真空腔内结构完整性的同时，允许二次离子探针束直接进入液体样品。7，8
S. oneidensis 将表达绿色荧光蛋白（GFP）的MR-1突变株选为本生物膜实验流程的模式生物，因其在环境与应用微生物学中具有广泛的代谢多样性和广泛应用，这主要归功于其独特的金属还原能力和胞外电子传递特性。9,10,11 此外，GFP的存在使得通过荧光显微镜结合异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片可方便地连续监测生物膜厚度。我们先前的研究已提供证据表明，该细菌倾向于附着于SiN窗口 原位操作 用于生物膜生长至高达一百微米厚度的荧光成像。4,12 尽管本文仅讨论通过荧光显微镜确认生物膜的存在，但SALVI可兼容其他光学成像方法，例如超分辨率荧光成像（即结构光照明显微镜（SIM））9以及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像4光学成像可用于测量生物膜厚度，并获取生物膜形态的三维图像，直观呈现其厚度及在氮化硅窗口上的附着情况。9 尽管在SIMS分析中使用了GFP， S. oneidensis 未使用GFP的样本用于生长曲线测定，因为该过程仅需测量光密度，无需进行任何荧光成像。通常情况下，GFP标记与未标记菌株在生长曲线上的差异不显著。此外，尽管本实验方案使用 S. oneidensis 以MR-1 GFP作为模式生物来描述该操作流程，本方案适用于任何可能需要在SALVI中培养的细菌菌株。然而，根据所需细菌菌株的具体特性，某些生长条件（如时间、温度和氧气环境）可能需要相应调整，以适应具体菌株的生长需求。在培养基方面，本方案采用 &#34;纳米线&#34; 培养基，不含右旋糖的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和不含右旋糖的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。其成分如下 &#34;纳米线&#34; 培养基已特别配制，用于促进并监测膜和周质的延伸生长 S. oneidensis 呈细丝状，其培养基成分已在先前的研究中确定。13,14
我们此前的实验方案 原位 液相飞行时间二次离子质谱（liquid ToF-SIMS）已阐明SALVI在蛋白质固定及与氮化硅（SiN）表面结合方面所提供的优势，同时提供了ToF-SIMS分析及数据处理的详细实验方案。12 本文不再重复数据处理步骤，而是重点介绍在 SALVI 微流道中建立和培养生物膜的独特方法，以及在进行飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）分析之前，用于检测生物膜存在及其厚度的成像步骤。尽管以往在基于真空的表面分析技术中，生物膜研究仅限于干燥样品，但现在已可获得活体生物膜的详细胞外多糖（EPS）及化学分布图谱 原位 由于这一新功能。

<table><tbody><tr><td>飞行时间二次离子质谱</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>分辨率：&gt;10,000 m/&amp;Delta;m 表示质量分辨率；&gt;4,000 m&amp;Delta;高空间分辨率的米</td></tr><tr><td>液-真空界面分析系统（SALVI）</td><td>太平洋西北国家实验室</td><td>N/A</td><td>SALVI 是一种独特、独立且便携的分析工具，首次使基于真空的科学仪器（如飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS）能够在分子水平上直接分析液体表面的自然状态。</td></tr><tr><td>-80&amp;deg;C 型冷冻柜</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>N/A</td><td>U410 高端节能超低温冰箱</td></tr><tr><td>4&amp;deg;C 型冰箱</td><td>BioCold 科学</td><td>N/A</td><td>COLDBOX1</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>N/A</td><td>Innova 4900 多层环境摇床，用于血清瓶和烧瓶培养，设置温度为 30 摄氏度，转速为 150 rpm。</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74905-02</td><td>Cole-Parmer 注射泵，仅用于输注，触摸屏控制 74905-02，用于以恒定流速向管路系统和 SALVI 注入液体。</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Barnstead International</td><td>LT1465X3</td><td>Lab-Line 培养箱，设置为 30 摄氏度用于平板培养。</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>用于对PEEK接头、管路系统、血清瓶和培养基进行灭菌。Model 533LS 真空蒸汽灭菌器</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4001-000</td><td>用于生长曲线测定中比色皿 OD600 读数的 GENESYS 20 分光光度计</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1385</td><td>1300系列AZ型生物安全柜</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>N/A</td><td>尼康OPTIPHOT-2荧光显微镜，配备相机及超高压汞灯电源</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toledo</td><td>51302803</td><td>用于检测 pH 值 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 灭菌前完成培养基配制后</td></tr><tr><td>PEEK 接头</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>用于连接SALVI的入口和出口、注射器与管路系统，以及SALVI的入口与管路系统的滴液室。</td></tr><tr><td>5轴样品台</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>用于将SALVI安装至飞行时间二次离子质谱仪（ToF-SIMS）的载样台为自制。</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure 水纯化系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D11921</td><td>ROpure LP 反渗透过滤模块（D2716）</td></tr><tr><td>移液器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21-377-821</td><td>范围：100 到 1,000 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>海王星</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &amp;micro;L型移液器吸头</td></tr><tr><td>剃刀刀片手柄</td><td>Stanley</td><td>N/A</td><td>Stanley Bostitch 单刃刀片刮刀（配5片单刃刀片），用于切割聚四氟乙烯（PTFE）管</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td>3 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td>5 mL；用于制作滴液室</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-678-11</td><td>25 mL Fisherbrand&amp;trade; 带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性血清移液管，用于填充血清瓶。</td></tr><tr><td>电动移液器填充器</td><td>移液器助吸器</td><td>P-57260</td><td>真空压力电动血清移液管吸液器</td></tr><tr><td>血清瓶</td><td>Sigma</td><td>33109-U</td><td>可容纳约 69 mL 液体用于培养物生长，每瓶使用 20 mL 培养液为最佳。</td></tr><tr><td>厌氧培养管</td><td>VWR</td><td>89167-178</td><td>厌氧管，18 × 150 mm，配有20 mm蓝色丁基橡胶塞和铝制密封盖。</td></tr><tr><td>橡胶塞</td><td>Sigma</td><td>27235-U</td><td>硅胶塞，用于密封血清瓶以及构建管路系统/滴液室。</td></tr><tr><td>铝制压盖密封（无隔垫）</td><td>Sigma</td><td>27227-U</td><td>用于血清瓶封口的铝盖，配合血清瓶压盖机使用。</td></tr><tr><td>血清瓶铝盖压盖器</td><td>Wheaton</td><td>224307</td><td>30 mm 压接钳，配有标准密封头。</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管</td><td>Supelco</td><td>58697-U</td><td>外径1.58 mm、内径0.5 mm、长50英尺的PTFE特氟龙管，用于构建管路系统。</td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>GMBH</td><td>759085D</td><td>1.5 ml，用于分光光度计。</td></tr><tr><td>针</td><td>BD</td><td>303015</td><td>22G；用于血清瓶注射。</td></tr><tr><td>针</td><td>BD</td><td>305120</td><td>23G；用于穿刺橡胶塞以构建滴流管系统。</td></tr><tr><td>表达绿色荧光蛋白的希瓦氏菌 MR-1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, &amp;amp; Goodman AE (1996) 用于大肠杆菌以外的革兰氏阴性菌的GFP载体构建。FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;S25310A</td><td>95% 变性</td></tr><tr><td>TSA</td><td>BD</td><td>212305</td><td>用于培养本实验方案中模式生物（S. oneidensis）的胰蛋白胨大豆琼脂</td></tr><tr><td>PIPES缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P-1851</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S-5881</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma</td><td>A-5666</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S-9638</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S271-3</td><td>用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基，并用于制备实验所需的矿物溶液 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>乳酸钠</td><td>Sigma</td><td>L-1375</td><td>60%（w/w）糖浆 @ 98% 纯度，d=1.3 g/mL，7M，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td>用于配制亚铁NTA溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>三(羧甲基)氨基乙酸三钠盐</td><td>Sigma</td><td>N-0253</td><td>用于配制三价铁NTA溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>三氯化铁</td><td>Sigma</td><td>451649</td><td>用于配制三价铁NTA溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>硫酸锰（II）一水合物</td><td>Sigma</td><td>M-7634</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化钴(II)</td><td>Sigma</td><td>60818</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma</td><td>229997</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>十二水合硫酸铝钾</td><td>Sigma</td><td>237086</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B-6768</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>二水合钼酸钠</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>氯化镍(II)</td><td>Sigma</td><td>339350</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>二水合钨酸钠</td><td>Sigma</td><td>14304</td><td>用于配制矿物溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma</td><td>47868</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Sigma</td><td>F-7876</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>盐酸吡哆醇</td><td>Sigma</td><td>P-9755</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>核黄素（B2）</td><td>Sigma</td><td>47861</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>盐酸硫胺</td><td>Sigma</td><td>T-4625</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>D-泛酸半钙盐</td><td>Sigma</td><td>21210</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>维生素B12</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>4-氨基苯甲酸</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr><tr><td>硫辛酸</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td>用于配制维生素溶液，用于 &amp;ldquo;纳米线&amp;rdquo; 培养基 {Hill, E.A. 2007}</td></tr></tbody></table>

原位表征shewanella oneidensis mr1生物膜的salvi与飞行时间二次离子质谱技术

In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

细菌生物膜是附着于表面的群落，其自产的胞外聚合物（EPS）及其在环境微生物学中的作用被广泛研究。本研究概述了一种在液相真空界面分析系统（SALVI）上培养生物膜并实现其附着的方法。 原位 通过飞行时间二次离子质谱法（ToF-SIMS）对活体生物膜进行化学成像。该过程利用特制装置在SALVI通道内外培养细菌，并结合光学成像技术，在进行ToF-SIMS分析前检测生物膜的存在及其厚度。实验结果展示了生物膜的特征质谱峰 希瓦氏菌 生物膜在其天然水合状态下的局部水簇环境以及胞外聚合物片段，与同一生物膜的脱水状态存在显著差异。这些结果展示了SALVI所具备的突破性能力，使其能够 原位 基于真空的化学成像仪器对生物膜成像。

这些代表性结果展示了如何通过飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）识别和解析附着生物膜的化学特征。在根据ToF-SIMS数据采集绘制出质谱图后（实验步骤部分已简要说明），应进行峰的指认，以确定各个质荷比（m/z）值对应的化学成分。这可通过广泛查阅有关细菌质谱分析的文献实现，特别是针对所研究细菌中预期存在的特定化学碎片，如各种水合离子簇、脂肪酸以及蛋白质碎片。16,17,18,19,20 本处代表性结果仅展示由S. oneidensis MR-1生物膜和去离子水样品获得的负离子模式质谱图。正离子模式质谱图的解析遵循类似的分析流程。
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本文介绍了一种用于培养生物膜的方法 原位 飞行时间二次离子质谱结合微流控反应器——液体-真空界面分析系统，用于样品水合状态下的化学成像。 Shewanella oneidensis 以表达绿色荧光蛋白的MR-1作为模型。

原位表征Shewanella oneidensis MR1生物膜的SALVI与飞行时间二次离子质谱技术

细菌生物膜是附着于表面的群落，被广泛研究以了解其自身产生的胞外聚合物（EPS）……

本实验的总体目标是在液体-真空界面系统（SALVI）中培养细菌，以便利用基于真空的分析技术（如飞行时间二次离子质谱）对生物膜在天然水合状态下的结构进行后续成像。我们提出了一种方法，通过成像质谱技术（如SIMS）可视化活体生物膜的化学-空间分布，从而帮助解答环境微生物学中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，可将活的生物膜直接引入质谱仪及多种其他分析平台，实现多参数同步检测。尽管本视频中使用的是Shewanella oneidensis，但该方法也可应用于厌氧培养箱中的生物膜培养。后者需要更严格的生长环境。由于管路安装步骤较难掌握，因此该方法的可视化演示至关重要。将导管转移至生物安全柜时，必须注意导管的特定放置方式并加以小心。使用22号针头，小心地在血清瓶橡胶塞上打一个孔。用剃刀切割20英寸长的1/32英寸PTFE导管，使导管的一端呈尖头状。使用尖端将聚四氟乙烯（PTFE）管穿过橡胶塞上部的孔。推动导管，直至约两厘米长的部分穿过橡胶塞，然后用刀片将PTFE管的尖端切去，使其端面平整。取下5毫升注射器的活塞，并将橡胶塞塞入注射器的开口端。将PTFE管的两厘米端插入注射器筒内，此部分作为气泡捕获装置。用铝箔包裹该气泡捕获装置，并使用高压灭菌胶带固定。然后将铝箔包装放入高压灭菌器中，采用重力循环在121摄氏度下灭菌30分钟，以对管路进行灭菌。将密封的铝箔包装于室温下保存，直至使用。本方案专门用于描述在培养24小时后于室温下培养希瓦氏菌MR-1（Shewanella oneidensis MR-1）生物膜的方法。然而，不同菌株的细菌需要不同的培养条件和培养时间才能达到适合分析的厚度。SALVI管路系统由含有液体储液器的注射器组成，该注射器通过PEEK进样器连接至PTFE管路。该管路再连接至滴液室，滴液室上装有PEEK进样器接头，并与SALVI进样管路相连。滴液室还连接至SALVI出口管路所密封的出口容器。为确保管路系统的无菌性，通过旋开金属注射器固定架将注射器从注射泵上拆下，然后将带有连接管路的注射器移至无菌生物安全柜中。使用一个新的SALVI装置，并将PEEK接头和注射器连接到一段PTFE管的一端。每次实验前均需根据此前研究和专利中详述的装置制备方法，重新制备SALVI装置。接下来，用注射器吸取2 mL的70%乙醇和去离子水，并将该注射器连接至SALVI装置的PEEK接头上。将注射器连接至注射泵，并将 SALVI 的出口端连接至废液瓶后，以每分钟 20 微升的流速让乙醇溶液流经 SALVI 一个半小时。随后，用注射器吸取四毫升灭菌去离子水，并将其连接至同一 SALVI 的入口端。将注射器连接至注射泵后，以每分钟 20 微升的流速让水持续流经 SALVI 至少三小时。在生物安全柜内，打开已准备好的铝箔包装，将无菌的PEEK进样器及接头连接至PTFE管末端。用注射器吸取

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

原位萨尔和 TOF-SIMS希瓦氏菌 oneidensis MR1 生物膜的表征

在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。...

用于全面分析由变异链球菌介导的口腔生物膜的生化、结构及转录组学评估工具箱

我们提供一种简单、半定量的方法，用于在体外研究生物膜的形成。in vitro 利用蔡司Stemi...

利用皱褶菌落形成评估生物膜产生的半定量方法

来源：Tokunou, Y. et. al., 电化学检测重氢动力学同位素效应对Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递的影响。J. Vis. Exp.

使用电化学反应器构建细菌单层生物膜

演示了在三电极体系中，由恒电位仪控制，于分批补料反应器内通过计时安培法培养阳极电活性微生物生物膜的过程。采用循环伏安法，在有电子供体和无电子供体条件下对胞外电子传递进行表征。同时演示了基本的数据分析方法。...

由废水中提取的电活性微生物生物膜：生长、维护与基本表征

生物膜与其周围环境之间存在复杂的相互作用。为了全面研究生物膜与环境之间的相互作用，本文介绍了一系列方法，用于构建有利于生物膜生长的异质化学环境，量化局部流速，以及分析生物膜菌落内部及周围的物质传输过程。...

生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌...

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

介绍了一种在生理相关条件下测量活体微生物生物膜电导率的实验方案。...

表征活体生物膜中的电子传递

本方案使读者能够采用多角度方法分析胆盐诱导的肠道病原菌生物膜形成，通过评估细菌的黏附、胞外聚合物基质形成及分散过程，揭示细菌生物膜的动态特性。...

胆盐诱导的肠道病原体生物膜形成：鉴定与定量技术

本文介绍了一种全细胞电化学实验方案，用于研究质子传递对Shewanella oneidensis...

电化学检测Shewanella oneidensis MR-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

本文介绍了一种全面的PmbExM实验方案，这是一种专门设计用于 奇异变形杆菌 生物膜。PmbExM 利用逐步的酶处理方法对生物膜样品进行处理，实现各向同性的 4.3...

通过扩增显微技术对Proteus mirabilis生物膜进行超分辨率成像

了解利用SALVI微流控系统和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对Shewanella oneidensis MR-1生物膜进行原位表征的方法。该技术可在自然水合状态下可视化活生物膜的化学空间分布，为环境微生物学研究提供重要工具。

原位表征Shewanella oneidensis MR1生物膜的SALVI与飞行时间二次离子质谱技术

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