利用一种新型转座子介导的方法确定 Escherichia coli 中 DNA 元件的最佳染色体位置

本实验的总体目标是利用转座子介导的随机插入、竞争实验和全基因组测序，确定任意给定DNA元件的最佳染色体位置。该方法有助于回答DNA复制领域中的关键问题，例如遗传元件染色体位置的重要性。该技术的优势在于将基于转座子的随机插入与具有生长优势的最优克隆筛选相结合。

此处通过大肠杆菌 DARS2 区域实现简化。尽管该方法可揭示大肠杆菌（Escherichia coli）染色体的组织结构，也可应用于其他细菌。根据文本方案制备电转感受态细胞（如 MG1655 delta DARS2）后，将 1 微克 pNKBOR DARS2 加入 40 微升细胞中，并将混合物转移至预冷的无菌 0.2 厘米间隙电转杯中。

将比色皿插入电穿孔室中，然后在18千伏、500欧姆和25微法的条件下对细胞进行电穿孔。时间常数应约为5毫秒，且不应出现电弧现象。

通过将菌体悬浮液重悬于1毫升预热的LB液体培养基中，快速回收菌液，并转移至15毫升试管中。在37摄氏度、有氧培养条件下孵育细胞30分钟，无需添加抗生素筛选。随后，将细菌涂布于添加了50微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上，并在37摄氏度下过夜培养。

第二天，计数电穿孔后的菌落。一个菌落视为一次染色体转座子插入事件。向每个平板中加入一毫升 LB 液体培养基，洗下所有菌落。

重复使用同一毫升LB肉汤以增加细菌浓度。然后，将所有菌落收集至同一个50毫升离心管中。涡旋混匀管内物质，以冰上冷冻起始材料，并在冰上将一毫升细胞悬液与一毫升50%甘油混合。

将试管转移至干冰中放置10分钟。待菌液完全冻结后，转移至-80°C超低温冰箱中保存。将转座子文库从-80°C冰箱中取出，在冰上解冻。

用移液器混匀，然后将转座子文库的100微升转移至15毫升离心管中的10毫升LB培养基中。在37摄氏度下振荡培养8小时至对数生长后期。可根据需要调整参数以适应不同的培养条件。

为了使细菌种群大约每10代传代一次，将10微升处于前一次稳定期的菌液转移至10毫升新鲜的预热培养基中，并继续培养8小时直至进入稳定期。每经历100代的竞争后，保存5份体积为1毫升的样品，并将其储存在负80摄氏度条件下。通过PCR扩增制备用于Southern印迹的探针，扩增目标为NKBOR中一段1千碱基的区域，所用特异性引物如上所列。

使用以下程序运行样品。根据Smith的方法，利用随机引物系统用P32标记的dATP标记所得PCR片段，并根据文本方案制备总细胞DNA。用Pvul酶切总细胞DNA，该酶切割含有目的区域（位于探针覆盖区域之外）的NKBOR。

根据 Loebner-Olsen 和 von Freiesleben 的方法，使用 0.7% 琼脂糖凝胶进行 Southern 印迹。为了通过简易基因步移法从单克隆中鉴定 DARS2 插入位点，在经历约 700 代的竞争培养后，首先将细菌涂布于 LB 琼脂平板上，于 37 摄氏度培养过夜，以分离基因组 DNA 作为 PCR 模板。随后用单菌落接种 LB 肉汤，并在 37 摄氏度下过夜培养。

然后，将20微升转移至200微升灭菌蒸馏水中。将菌落充分涡旋混匀至溶液中，随后在100摄氏度加热10分钟。将样品在最大转速下离心5分钟，收集上清细胞裂解液并保存于负20摄氏度，以备后续使用。

接下来，设计三对嵌套引物，使其结合于所选转座子内部，如此处所示。取200纳克基因组DNA、第一对嵌套引物和一条随机引物，配制20微升的PCR反应体系。然后按照以下程序运行样品。

进行第二次扩增时，取第一次反应产物1微升作为模板，使用第二对巢式引物和相同的随机引物。以第二次反应产物1微升作为模板，采用第三对巢式引物和相同的随机引物，同样方式进行第三次反应。将最终PCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭染色。

切取100至800个碱基对范围内的条带，使用任意商业化的DNA凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书提取DNA。为进行流式细胞术，需通过使每种细菌培养物保持至少10代的指数生长期来平衡培养物。测定OD600，并确保其值始终不超过0.3。

按照文本方案进行利福平跑出实验，取一毫升培养物转移至含有30微升利福平-头孢噻吩（RIF-CEF）的15毫升离心管中。将离心管在37摄氏度下振荡孵育至少四小时。对于指数期（EXP）样品，取一毫升处于指数生长期的培养物，转移至冰上的1.5毫升离心管中。

然后，以15,000 × g、4 °C离心5分钟收集细胞。将沉淀重悬于100 µL预冷的10 mmol/L Tris（pH 7.5）中，并加入1 mL预冷的77%乙醇。将样品置于4 °C保存，待用。

通过在15,000 × g下离心100至300微升固定细胞15分钟来收集细胞沉淀。弃去上清液，加入130微升DNA染色液重悬细胞沉淀。然后将样品置于冰上避光孵育10分钟。

最后，使用流式细胞术测定每个细胞的复制起点数量、相对细胞质量和相对DNA含量。在从初始转座子库以及每约100代（共700代竞争过程）中提取DNA后，使用Pvul酶切DNA，该酶已知可在探针未覆盖区域对转座子NKBOR DARS2进行一次切割，随后进行Southern印迹分析。如图所示，初始的DARS2文库缺乏明显的条带，表明DARS2在整个染色体中随机插入。

随着时间推移，出现了一种模式：最初大量的 DARS2 克隆逐渐演变为仅存一个或少数几个持续存在的 DARS2 克隆。通过全基因组测序确定了起始克隆池中 DARS2 的插入位点。在竞争培养至 400、500 和 700 代后，对代表性插入位点测序的子集进行分析发现，98% 的 DARS2 插入位点均位于野生型 DARS2 染色体位置附近。

另有2%位于染色体其他位置。先前研究表明，DARS2缺陷细胞以同步方式启动复制，且相对于野生型细胞，其复制起点浓度降低。在此，尽管在终止区域存在DARS2元件，却未能将复制同步性或细胞内复制起点数量恢复至野生型水平，而所选的DARS2克隆IR和RPPH则能够以同步方式启动复制。

观看本视频后，您应能充分理解如何确定特定DNA元件在染色体上的最佳位置。该方法通过基于转座子的随机插入，随后进行竞争实验，最终结合全基因组测序来实现。