用新的转介导法测定大肠杆菌中 DNA 元素的最佳染色体位置 (s)

本实验的总体目标是使用转座子介导的随机插入、竞争实验和全基因组测序来确定任何给定 DNA 元件的最佳染色体位置。这种方法可以帮助回答 DNA 复制领域的关键问题，例如遗传元件染色体位置的重要性。该技术的优点是，将基于转座子的随机插入与通过生长优势选择最适的克隆相结合。

在这里，它由大肠杆菌 DARS2 区域简化。虽然这种方法可以深入了解大肠杆菌的染色体组织，但它也可以应用于其他细菌。根据文本方案制备电感受态细胞（如 MG1655 δ DARS2）后，将 1 微克 pNKBOR DARS2 添加到 40 微升细胞中，并将混合物转移到预冷的无菌 0.2 厘米间隙比色皿中。

将比色皿插入电穿孔室。然后，以 18 千伏、500 欧姆和 25 微法拉的电压对电池进行电穿孔。时间常数应约为 5 毫秒，并且不应发生电弧。

通过将细菌悬浮液重新悬浮在 1 毫升预热的 LB 肉汤中并转移到 15 毫升试管中来快速回收细菌悬浮液。在 37 摄氏度的充气生长条件下孵育细胞 30 分钟，无需选择抗生素。然后，将细菌接种到补充有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，并在 37 摄氏度下孵育平板过夜。

第二天，对电穿孔的菌落进行计数。一个菌落被认为等于一个染色体转座子插入。向每个板中加入 1 毫升 LB 肉汤，洗掉所有菌落。

重复使用相同的 1 毫升 LB 肉汤以增加细菌浓度。然后，将所有菌落汇集在同一 50 毫升试管中。涡旋试管以冷冻起始材料，并在冰上将 1 毫升细胞悬液与 1 毫升 50% 甘油混合。

将试管转移到干冰中 10 分钟。培养物冷冻后，将它们转移到 80 摄氏度的负低温冰箱中。在冰上从零下 80 摄氏度解冻转座子文库。

通过移液混合，然后将 100 μL 转座子文库转移到 15 mL试管中的 10 mLLB 中。在 37 摄氏度下连续振荡 8 小时，使通气细胞生长至固定相。根据需要根据不同的生长条件调整参数。

为了大约每 10 代繁殖一次细菌种群，将 10 微升先前的固定相转移到 10 毫升新鲜的预热培养基中，然后将培养物再培养 8 小时至固定相。每 100 代比赛后，保存 5 个 1 毫升样品，并储存在零下 80 摄氏度下。通过使用 PCR 扩增，使用此处列出的特异性引物，针对 NKBOR 的 1 KB 切片准备用于 Southern 印迹的探针。

使用以下程序运行示例。根据 Smith 使用随机引物系统用 P32 标记的 dATP 标记所得的 PCR 片段，并根据文本方案制备总细胞 DNA。用 Pvul 消化总细胞 DNA，Pvul 切割探针覆盖区域之外包含感兴趣区域的 NKBOR。

根据 Loebner-Olsen 和 von Freiesleben，使用 0.7% 琼脂糖凝胶进行 Southern 印迹。为了使用简单的基因行走从单个克隆中识别 DARS2 插入位点，经过 700 代估计的竞争后，首先将细菌铺在 LB 琼脂平板上并在 37 摄氏度下孵育过夜，从而分离 PCR 模板的基因组 DNA。用单个菌落接种 LB 肉汤，并在 37 摄氏度下培养过夜。

然后，将 20 μL 转移到 200 μL 高压灭菌蒸馏水中。将菌落涡旋成溶液，然后在 100 摄氏度下加热混合物 10 分钟。以最大速度离心样品 5 分钟，然后将细胞裂解物保存在零下 20 摄氏度以备将来使用。

接下来，设计三个嵌套引物以在所选转座子内退火，如图所示。使用 200 ng 基因组 DNA、巢式引物 1 和随机引物制备 20 μL PCR 反应。然后，使用以下程序运行示例。

对于第二次扩增，使用 1 微升第一次反应物作为模板，并使用巢式引物 2 和相同的随机引物。使用嵌套引物 3、相同的随机引物和来自第二个反应的 1 微升作为模板，以类似的方式进行第三次反应。在 1.5% 琼脂糖凝胶和他汀类药物和含溴化乙锭的 PCR 反应中进行电泳。

切出 100 至 800 个碱基对范围内的条带，并根据制造商的说明使用任何市售 DNA 凝胶提取试剂盒分离 DNA。要进行流式细胞术，请通过将每种细菌培养物保持在指数生长期至少 10 代来平衡它。测量 OD600 并确保其永远不会超过 0.3。

为了按照文本方案进行利福平用尽，将 1 毫升培养物转移到含有 30 微升 RIF-CEF 的 15 毫升试管中。将试管在 37 摄氏度下摇动孵育至少 4 小时。对于 EXP 样品，将 1 毫升指数生长的培养物转移到冰上的 1.5 毫升试管中。

然后，通过在 15， 000 x G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟来收获细胞。将沉淀重悬于 100 微升冰冷的 10 毫摩尔 tris pH 7.5 中，并加入 1 毫升冰冷的 77% 乙醇。将样品储存在 4 摄氏度直至使用。

以 15， 000 倍 G 离心 15 分钟收获 100 至 300 μL 固定细胞来对细胞进行染色。去除上清液，使用 130 μL DNA 染色溶液重悬沉淀。然后，将样品在冰上和黑暗中孵育 10 分钟。

最后，使用流式细胞术确定每个细胞的来源、相对细胞质量和相对 DNA 含量。从初始转座子库中提取 DNA 后，估计 700 代竞争中每 100 代一次，用 Pvul 切割 DNA，已知 Pvul 会在探针未覆盖的区域切割转座子 NKBOR DARS2 一次，并进行 Southern 印迹。如此处所示，初始 DARS2 库缺乏明显的条带，这表明 DARS2 是随机插入整个染色体的。

随着时间的推移，出现了一种模式，即最初的大量 DARS2 克隆发展成只有一个或几个持久的 DARS2 克隆。全基因组测序用于从起始池中识别 DARS2 插入位点。在具有代表性的插入序列子集中经过 400 、 500 和 700 代的竞争后，98% 的 DARS2 插入被发现在野生型 DARS2 染色体位置附近。

2% 在染色体的其他位置被发现。先前显示 DARS2 缺陷细胞同步启动复制，并且相对于野生型细胞，起始浓度降低。在这里，末端中存在 DARS2 元件不会将同步或细胞来源内容恢复到野生型水平，而选定的 DARS2 克隆 IR 和 RPPH 确实同步启动复制。

看完这个视频后，您应该对如何确定给定 DNA 元件的最佳染色体位置有了很好的了解。这是通过基于转座子的随机插入完成的，然后是竞争实验，最后是全基因组测序。