用于植物/微生物分子相互作用和信号的同时系统分析的水培共培养系统

该系统的总体目标是在与自然环境紧密结合的简单实验设置中研究植物与微观伙伴之间的相互信号相互作用和反应，或研究植物对化学物质或非生物因子的反应。该视频展示了植物与根癌农杆菌的共培养。这种方法可以帮助回答植物微生物相互作用、微生物或植物应激反应以及分子信号传导中的关键问题，包括即使在植物微生物相互作用的初始阶段也能产生的复杂信号传导。

这种技术的主要优点是它有助于理解植物微生物相互作用的性质信号和反应，只需一个简单的设置，包括模拟自然环境。虽然这种方法可用于深入了解植物与单一微生物物种的相互作用，但它也可用于研究植物与多种微生物物种或非生物因子的相互作用。我们在寻找与自然情况非常相似的植物微生物相互作用过程中的细胞信号传导稳态时，想到了这种方法。

要开始实验，必须对种子进行消毒。对于拟南芥，将大约 200 颗种子与 500 微升去离子水混合在微量离心管中，并高速涡旋管。在台式微量离心机中以 9000 x g 离心管 30 秒。

使用移液管去除水上清液。接下来，向种子中加入 300 微升 2% 次氯酸钠并涡旋。让混合物在室温下沉淀。

一分钟后，离心种子。用移液管除去次氯酸钠溶液。然后向种子中加入 500 微升无菌去离子水，涡旋混合物。

离心管后，除去水。向种子中加入 500 微升 70% 乙醇，涡旋混合物。让种子沉淀 1 分钟后，离心管。

用移液管除去 70% 乙醇。用 500 微升无菌去离子水清洗种子五次。然后，将灭菌的种子重新悬浮在 500 微升无菌超纯水中。

将 25 毫升半强度的 Murashige 和 Skoog 或含有 04% 植物琼脂的 MS 培养基倒入每个无菌的深培养皿中。对于每个培养皿，切出一个 90 毫米 x 90 毫米见方的不锈钢网。将每个方形网格的角弯曲到足以使网格适合培养皿内。

将角与网格的大部分成 90 度角弯曲，以允许网格由角支撑，从而在下方留出足够的空间供根部发育。将切好的网眼方块放入烧杯中，并用铝箔覆盖。通过使用 30 分钟的干燥循环进行高压灭菌对网片方块进行消毒。

一旦培养基在培养皿中凝固，并且网片是无菌的，将每个网片方块放在固体培养基的顶部，弯曲的角朝下。推动网格，使角落穿透介质，并且大部分网格接触介质的顶面。接下来，使用无菌的 200 微升移液管吸出单个表面灭菌的 A thaliana 种子，并将每个种子轻轻转移到网眼顶部。

放置种子，使其根据植物种类和实验需要间隔开来。用盖子密封培养皿，并在板的边缘放置多孔手术胶带。用铝箔纸包裹种子。

通过放置整个培养皿来分层种子。两天后，在 22 至 24 摄氏度的培养皿中培养种子，16 小时的光期，持续 10 至 14 天。在无菌流动罩中，将 18 毫升高压灭菌的液体 MS 培养基倒入带有无菌盖的无菌圆柱形玻璃罐中。

接下来，使用无菌镊子轻轻地将每个装有 10 至 14 天龄幼苗的网状方块从半固体培养基的培养皿转移到水培圆柱形水箱中。这里显示的幼苗是紫花苜蓿。使用多孔手术胶带将盖子密封到水箱上。

然后，在 22 至 24 摄氏度下培养幼苗，光周期为 16 小时，并以 50 rpm 的速度摇动。接种前，仔细检查装有幼苗的水箱是否有任何潜在的污染。未受污染的罐中的介质应透明透明。

如果水箱因污染而浑浊，请丢弃它们并对其余水箱进行编号。从每个编号的水箱中取样 20 微升水培培养基，并将其点在装有 Luria 肉汤或 LB 琼脂的培养皿上。将培养皿在 28 摄氏度下孵育 28 小时。

立即将 50 微升根癌农杆菌悬浮液接种到每个编号的水培罐中。在 22 至 24 摄氏度下共培养幼苗和 A tumefacians 细菌，光周期为 16 小时，并以 50 rpm 的速度摇动。孵育 12 小时和 28 小时后检查带斑点的 LB 板，以验证水培生长培养基的无菌性。

如果有任何污染，请勿使用接种有细菌的相应编号槽进行进一步的下游分析。接下来，通过提起网板将根与细菌悬浮液分离。如果使用根进行后续分析，请切开根，用双蒸水快速冲洗，然后在消毒滤纸上晾干。

如果使用叶子或其他组织，请剪掉组织。对于植物转录物分析，应立即将根或芽沉积到液氮中。对于细菌转录物分析，从共培养罐中转移 1.5 毫升培养物，并通过离心使细胞沉淀。

适当的共培养后，使用无菌剪刀分离单个次生根，即主根的侧枝。接下来，用双蒸水冲洗根部，以去除松散结合的材料。将每个根浸入显微镜载玻片上的 30 微升水中，并用玻璃盖玻片盖住。

用指甲油密封盖玻片的边缘，以保护根部免受脱水。然后通过荧光显微镜观察 A tumefacians 与 A thaliana 根的附着。适当的共培后，将植物与水培介质分离。

18 毫升水培培养基通过 0.2 微米孔过滤器放入 50 毫升锥形管中，对其进行消毒。将样品在 80 摄氏度下冷冻过夜。第二天，松开 50 毫升锥形管的盖子，将它们放入冷冻干燥机中 36 小时。

最后，继续储存或处理样品以进行 HPLC 分析和化合物检测。在没有人工提供养分的情况下，A tumefacians c58 在共培系统中生长。相比之下，在没有拟南芥的对照培养物中基本上没有观察到细菌生长。

水培共培养系统可用于研究细菌与根结构的附着，如此微观可视化所示，其中 PCherry 红色荧光标记的细菌定位于植物根部结构，具有典型的岩石状或细丝状形状。植物柱和相互作用微生物的基因表达谱可以通过 QRTPCR 确定。共培养 8 小时后，8 个 tumefacians 细胞揭示了毒力基因表达的上调。

同时，拟南芥的根揭示了响应共培养的差异基因表达。共培养 72 h 后，与对照相比，接种植株分泌组中 35 个化合物增强，减少 76 个化合物。这项技术为研究人员研究植物与微生物的相互作用铺平了道路，并在一个密切模拟自然环境的简单设置中探索植物与微生物或微生物群落伙伴之间的相互反应，或植物对非生物因素的反应。

与您一起观看后，我们希望您能够在水培中建立一个植物微生物共培养系统，以在更自然和可管理的环境中研究分子植物、微生物相互作用和信号反应。