Name: 用于植物/微生物分子相互作用和信号的同时系统分析的水培共培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学习水培共培养系统用于研究植物与微生物的分子相互作用和信号传导。该方法利用Agrobacterium tumefaciens模拟自然环境，可同时分析植物组织、细菌及分泌分子的响应机制。

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我们感谢 Brian Weselowski 和 Alexander W. Eastman 提供的帮助和有益的讨论。我们还要感谢 Eugene W. Nester 博士、Lingrui Zhang 博士、Haitao Shen 博士、Yuhai Cui 博士以及 Greg Thorn 博士在研究过程中提供的帮助、有益的讨论以及对稿件的审阅。本研究由加拿大农业与农业食品部通过“农业发展前进计划—AgriFlex”（项目编号 2555）和“农业发展前进二期计划”项目编号 1670 资助，作者在履行其职责过程中开展了本研究。本研究还部分得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金 RGPIN-2015-06052（授予 Z-C Yuan）的资助。

1. 实验设计
<ol>
	<li>确定实验的具体目标。</li>
	<li>通读以下完整方案，确定哪些步骤与具体目标相关，并判断是否需要进行任何修改。参见下文示例。
	<ol>
		<li>考虑实验是否将使用如下所述的A. thaliana植物和A. tumefaciens细菌，或其他植物-微生物组合。 
		注意：尽管可使用多种植物物种，但植物根系的厚度可能需要不同尺寸的网筛（步骤3.3），且生长参数（步骤3.10–3.11和4.4）、水培箱尺寸及培养基体积（步骤4.2）也可能需要调整（图2）。微生物可轻松以纯培养物、混合物种（群落）或环境样品（微生物组）形式接种，但任何更改均可能影响方案，尤其是步骤4.5。</li>
		<li>考虑将用于分析样品的实验类型。 
		注意：荧光显微镜观察（步骤5）需要带有荧光报告基因构建体的标记生物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计适当的对照。包括未接种细菌的空白幼苗水培箱，以及未接种细菌的对照幼苗水培箱。</li>
	<li>根据所需种子数量和水培箱数量规划实验。需考虑对照组、生物学重复（至少3个）以及所有分析所需的组织量。</li>
	<li>根据实验目标确定共培养的适当持续时间（步骤4.8）。</li>
	<li>根据需要修改以下任何步骤。</li>
</ol>
<img alt="网格上种子萌发过程，不同发育阶段种子的比较，实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 可在水培系统中栽培的其他植物示例，由金属网平台支撑。 多种植物种子培养与不同金属网的兼容性。(A) 3×3 网孔、直径0.047英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Vicia faba。（B）4×4 网孔、直径0.035英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Zea mays。（C）4×4 网孔、直径0.032英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Glycine max（大豆）。（D）6×6 网孔、直径0.047英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Raphanus sativus（冬萝卜）。（E）6×6 网孔、直径0.047英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Triticum spp.（小麦属）。（F）6×6 网孔、直径0.035英寸的304型不锈钢焊接网，用于栽培Cucumis sativus（黄瓜）。本图修改自参考文献35。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55955/55955fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. 植物种子表面灭菌
<ol>
	<li>在微量离心管中，将约200粒拟南芥（A. thaliana）种子与500 µL去离子水混合，高速涡旋振荡。对于种子较大的植物种类，应使用较大的离心管，以方便表面灭菌。</li>
	<li>在台式微量离心机中，以约9,000 × g离心30秒，然后用移液器吸除上清液（水相）。</li>
	<li>向种子中加入300 µL 2%次氯酸钠溶液，涡旋振荡，室温下静置1分钟。对于种子较大的植物种类，应使用更大体积的溶液以完全覆盖种子。</li>
	<li>在台式微量离心机中，以约9,000 × g离心30秒，然后用移液器吸除次氯酸钠溶液。</li>
	<li>向种子中加入500 µL无菌去离子水，涡旋振荡，以约9,000 × g离心30秒，再用无菌移液器吸除水分。</li>
	<li>重复步骤2.5，额外进行4次。</li>
	<li>向种子中加入500 µL 70%乙醇，涡旋振荡，室温下静置1分钟。</li>
	<li>在台式微量离心机中，以约9,000 × g离心30秒，然后用移液器吸除70%乙醇。</li>
	<li>重复步骤2.5，额外进行5次。</li>
	<li>将灭菌后的种子重悬于500 µL无菌超纯水中。</li>
</ol>
3. 种子萌发与植物半固体培养
<ol>
	<li>制备半固体MS培养基：每升含MS基本盐2.165 g、蔗糖10 g、MES 0.25 g、B5维生素混合液59 mL，pH 5.75，添加4 g/L植物凝胶。</li>
	<li>高压灭菌MS培养基。将25 mL培养基倒入每个无菌深型培养皿（100 × 25 mm）中2).</li>
	<li>每个培养皿中，裁剪出一块 90 × 90 mm 的不锈钢网。 
	注意：推荐使用的筛网为 A. thaliana 标准等级为304，网目数（每英寸线性孔数）为40 × 40，金属丝直径为0.01英寸（0.0254厘米）。对于较大的水生动物饲养箱或较高的平台，需要使用网孔更大的筛网。</li>
	<li>将每个方格网片的角落略微弯曲，使其刚好能够放入培养皿内。弯曲角落的角度为 90° 与网片主体成一定角度，以便网片的角落能够支撑起网片，从而在下方留出足够的空间供根系发育（图3a).</li>
	<li>将裁剪好的网状方块放入烧杯中，用铝箔覆盖，使用30分钟干循环程序进行高压灭菌。</li>
	<li>待培养皿中的培养基凝固且网格无菌后，将每块已灭菌的网格正方形置于半固体培养基表面，弯曲的角朝下。</li>
	<li>将网格轻轻下压，使网格的四个角插入培养基中，同时确保网格的主体部分与培养基的上表面接触。图3b).</li>
	<li>使用一个 200 µL 移液管吸取经表面消毒的单个样本 A. thaliana 种子（由于真空作用，种子会停留在移液枪尖端），轻轻将每粒种子转移至筛网表面。根据实验需求，将种子均匀放置于适当间距处（例如， 4 6粒种子/板。</li>
	<li>用盖子密封培养皿，并在边缘处贴上多孔外科胶带。</li>
	<li>通过将整个培养皿置于 4 °C 在黑暗中放置 2 d（例如， 用锡箔纸包裹以模拟黑暗环境。</li>
	<li>在培养皿中于22-24 °C 光照周期为16小时，持续培养10-14天（图3c).</li>
</ol>
<img alt="水培培养过程示意图；生长阶段；金属网；微生物共培养。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：水培植物-微生物共培养系统。 左侧图示为组装和运行水培共培养系统的六个关键步骤的流程图。右侧图示展示了在研究拟南芥-农杆菌（Arabidopsis-Agrobacterium）相互作用时，该水培共培养系统所使用的实际实验材料、仪器设备及操作流程。图中未展示接种步骤以及最终的植物或细菌取样步骤。本图经参考文献35 修改。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55955/55955fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 水培共培养系统
<ol>
	<li>制备液体MS培养基：每升含MS基本盐2.165 g、蔗糖10 g、MES 0.25 g、B5维生素混合液59 mL，pH调至5.75。</li>
	<li>高压灭菌培养基。将18 mL培养基倒入每个无菌的圆柱形玻璃或透明塑料容器（结晶皿，100 × 80 mm）中2）并用无菌盖子盖好。 
	注意：将罐子和盖子用铝箔纸包裹后进行高压灭菌，以预先灭菌。</li>
	<li>在无菌操作台中，使用无菌镊子将每块带有10-14天幼苗的网格方块从半固体培养基轻轻转移至水培圆柱形容器中（图3d). 使用多孔外科胶带将盖子密封在罐子上。</li>
	<li>将幼苗在网架上的培养箱中于22-24 °C，光照周期为16小时，50 rpm振荡通气（图3e). 
	注意：这一步骤可使植物在接种（共培养）微生物之前适应水培环境。等待期间还有助于在接种前发现可能存在的意外微生物污染。
	<ol>
		<li>在孵育期结束前一天开始下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 A. tumefaciens 在AB培养基（0.5% w/v酵母提取物，0.5% w/v胰蛋白胨，0.5% w/v蔗糖，50 mM MgSO₄）中4，pH 7.0）于 28 °C 在37°C下振荡培养过夜，直至菌液在600 nm处的光密度值达到1.0（OD600）600使用分光光度计测定，以未接种的AB培养基作为空白对照。 
	注意：OD600 1.0 相当于约 109 cells/mL</li>
	<li>洗涤 A. tumefaciens 用等体积的0.85% NaCl洗涤三次。用等体积的无菌双蒸水重悬。</li>
	<li>接种前，仔细检查装有幼苗的培养罐，确保无污染；未受污染的培养罐中的培养基应清澈透明。
	<ol>
		<li>丢弃任何液体浑浊的培养罐（污染），并对其余培养罐编号。取少量样品（20 µL从每个编号的水培罐中取适量水培培养基，点样于装有LB（Luria broth）的培养皿中。将培养皿在指定条件下孵育。 28 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即加入 50 µL 的 A. tumefaciens 悬液（约 5 x 107 细胞，根据OD值估算600) 加入每个编号的水培槽中。共同培养 A. thaliana 幼苗和 A. tumefaciens 22-24 °C 16小时光照周期，50 rpm振荡培养 (图3f).
	<ol>
		<li>检查步骤 4.7.1 中的 LB 琼脂平板在培养 12 小时和 28 小时后的菌落生长情况，以确认各培养罐的无菌状态。若发现污染，则不得将相应编号的培养罐（接种了细菌的培养罐）用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如有需要，可监测生长情况 A. tumefaciens 定期从培养罐中取出培养基样品并测量其OD值600 使用分光光度计，以未接种的对照培养基作为空白对照（图4). 
	注意：植物病害症状应在接种后7天内显现（图5).</li>
	<li>分离 A. thaliana 通过提起网状板将根部从细菌悬浮液中取出；此步骤的时间取决于后续实验流程。详见步骤5-8。</li>
	<li>若后续分析使用根部，请用双蒸水快速冲洗根部。若使用叶片或其他组织，则剪下相应组织。若进行RNA分析，立即进入步骤7.1。</li>
</ol>
<img alt="细胞生长动力学；光密度（OD600nm）曲线；共培养与非共培养研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：农杆菌在水培共培养系统中的生长情况。每隔4小时监测一次有或无植物寄主（拟南芥）存在时农杆菌的生长情况。农杆菌细胞在AB培养基中过夜培养后，用0.85% NaCl洗涤3次，并以初始OD600约为0.1的浓度接种至水培系统中，进行有或无拟南芥共培养的实验。OD600值为三次生物学重复的平均值，误差线表示标准差（OD600为1.0时相当于1 × 109个细胞/mL）。
<img alt="展示在培养皿中共培养实验中生长差异的示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：共培养期间代表性植物表型及可观察到的病害症状。 接种后 4 天内，未见明显病害症状（A），与未接种植物相比无差异（B）。共培养（感染）7 天后，接种植株出现病害症状（C），而未接种植株仍保持健康状态（D）。
5. 荧光显微镜
<ol>
	<li>使用 A. tumefaciens 携带用于共培养体系的自荧光蛋白报告基因构建体 步骤 4.5. 
	注意：一种表达 pCherry（dsRed 的衍生物）的改良型 pJP2 质粒36，此处使用。</li>
	<li>经过适当的共培养后（例如， 在步骤4.8中，使用无菌剪刀将次级根（主根的侧枝）单独分离，处理时间为48 h。</li>
	<li>用双蒸水冲洗根部，以去除松散结合的物质。将每条根浸入 30 µL 在载玻片上滴加一滴水，并用盖玻片覆盖。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片边缘，以防止根部脱水。</li>
	<li>可视化黏附过程 A. tumefaciens 到 A. thaliana 通过荧光显微镜观察根部。 
	注意：此处使用配备氦氖（He-Ne）543/594 nm 激光器的共聚焦显微镜，通过数值孔径为 1.4 的倒置 63X 水镜物镜，在 590–630 nm 波长范围内观察 pCherry 红色荧光图6).</li>
</ol>
<img alt="mCherry蛋白的荧光显微镜图像与明场叠加；细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：通过共聚焦显微镜测定的根癌农杆菌（Agrobacterium）根部附着情况。 使用红色荧光标记的pCherry标签根癌农杆菌（Agrobacterium），在氦氖（He-Ne）543/594 nm激光激发下，于590–630 nm波长范围内进行可视化检测。成像采用63倍水浸倒置物镜，数值孔径为1.4。比例尺 = 11 µm。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55955/55955fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 细菌转录本分析
<ol>
	<li>经过适当的共培养后（例如， 在步骤4.8中孵育8 h后，按照步骤4.9的操作将根系与水培培养基分离。取1.5 mL水培培养基转移至1.5 mL微量离心管中，在12,000 × g离心2 min以沉淀细胞。</li>
	<li>移去上清液。将另外1.5 mL水培培养基转移至同一支1.5 mL微量离心管中，在12,000 g离心2 min以沉淀细胞。</li>
	<li>移除上清液。 
	注意：此时可通过将样品在 -80 °C 直至使用。</li>
	<li>从样本中提取 RNA A. tumefaciens 使用标准方法处理细胞37 或使用带有DNase处理步骤的合适商业RNA提取与纯化试剂盒，以避免DNA污染。 
	注意：此处可通过将 RNA 分装后于 -80°C 冻存来暂停实验流程。80 °C 直至使用。</li>
	<li>使用分离得到的RNA，采用标准方法进行多种分析，包括以下内容。
	<ol>
		<li>根据制造商的说明书，使用商用微阵列检测共培养与对照培养中差异表达的基因集合。</li>
		<li>使用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测特定基因的表达或验证微阵列数据38.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 植物转录本分析
<ol>
	<li>经过适当的共培养后（例如， 在步骤4.8中静置8小时后，按照步骤4.9的方法将根系从水培介质中分离，或根据需要分离其他组织。立即将约150 mg的根系或其他植物组织放入液氮中。 
	注意：此时可通过将样品在 -80 °C 直至使用。</li>
	<li>在液氮中使用研钵和研杵将冷冻样品研磨成粉末。</li>
	<li>使用标准方法从粉末中提取RNA39 或使用带有DNase处理步骤的合适商业RNA提取纯化试剂盒，以避免DNA污染。 
	注意：此处可通过将 RNA 分装后于 -80°C 冻存来暂停实验流程。80 °C 直至使用。</li>
	<li>使用分离得到的RNA，采用标准方法进行多种分析，包括以下内容。
	<ol>
		<li>根据制造商的说明书，使用商用微阵列检测共培养植物与对照植物中差异表达的基因集合。</li>
		<li>使用qRT-PCR检测特定基因的差异表达或验证微阵列数据38.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 分泌组分析
<ol>
	<li>经过适当的共培养后（例如， 72 小时）在步骤 4.8 中，按照步骤 4.9 的方法将根系从水培培养基中分离。将 18 mL 水培培养基通过滤膜灭菌 0.2 µm 将孔滤器放入50 mL锥形管中。</li>
	<li>将样品在 -80 °C 过夜</li>
	<li>松开50 mL离心管的管盖，将其放入冻干机中冻干36 h。随后储存或处理样品（如下所述），用于HPLC分析和化合物检测。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	<li>在可密封的试管中，将每个样品用 5 mL 双蒸水重悬。</li>
	<li>加入5 mL乙酸乙酯，通过反复倒置试管数次进行混合。</li>
	<li>室温下静置5分钟，使相分离。</li>
	<li>用移液器将上层（有机相）转移至新容器中。如有需要，可合并多个有机相组分。</li>
	<li>在氮气流下干燥（约45分钟）。</li>
	<li>在适当的HPLC溶液中重新悬浮样品（例如， 100% 甲醇</li>
	<li>根据标准方法进行高效液相色谱分析40.</li>
	<li>采用适当方法检测化合物。 
	注意：电喷雾电离飞行时间质谱法（ESI-TOF-MS）40 此处使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴于根部分泌物的释放具有渐进性，其所产生的诱导毒力的化学物质浓度 在植株中 其对动态植物-微生物相互作用的影响在空间和时间梯度上发生。在此水培共培养系统中，不添加任何合成植物激素或诱导微生物致病性或植物防御反应的化学物质。相比之下，传统方法中添加乙酰丁香酮等合成化学物质会导致浓度突然且人为地升高。因此，该水培共培养系统更接近于自然环境，其中微生物与宿主植物以空间和时间依赖的方式进行识别与响应。
在此，可以证明 农杆菌 毒力基因在共培养条件下被激活 拟南芥这表明天然植物来源的化学物质可诱导 农杆菌 毒力。未来需要进一步努力以鉴定这些化学物质，并验证毒力诱导化合物乙酰丁香酮是否在其中。此外，发生显著变化的 拟南芥 共培养后观察到根部基因表达和分泌组特征 农杆菌展示了水培共培养系统在研究植物宿主响应及植物-微生物互作过程中分泌谱方面的潜力。事实上，利用水培共培养技术，可在微生物互作发生前后的任意阶段研究植物宿主的基因表达和分泌组谱，这将有助于阐明这些转录水平或分泌组的变化如何促进或...

与植物相关的微生物在生物地球化学循环、生物修复、减缓气候变化、植物生长与健康以及植物对生物和非生物胁迫的耐受性方面发挥着重要作用。微生物通过与植物细胞壁直接接触，或通过化学分泌和信号传递间接地与植物相互作用1,2,3。作为固着生物，植物已进化出直接和间接机制以抵抗病原体的侵染。直接防御包括结构防御和防御蛋白的表达，而间接防御则包括次生植物代谢物的产生以及吸引对入侵病原体具有拮抗作用的生物体4,5。植物根系分泌物、渗出物、黏液、根冠黏胶和裂解产物会改变根际的理化性质，从而吸引或排斥微生物向其寄主聚集6。根系分泌物的化学成分具有物种特异性，因此可作为选择性过滤器，使某些能够识别这些化合物的微生物在根际中得以富集和增殖6。因此，相容的微生物种类可能被激活并增强其与植物的互作关系，这种关系可能对植物寄主有利，也可能有害1。
了解根际中植物与微生物的相互作用对于提高植物生产力和生态系统功能至关重要，因为大多数微生物和化学物质的接触都发生在根系结构与土壤-空气界面2,6,7,8。然而，由于地下植物-微生物相互作用及其相互响应具有高度复杂且动态的特性，且缺乏在严格可控生长条件下具备自然根系结构和植物形态的合适实验模型，相关研究一直面临挑战。作为被研究最为广泛的植物病原菌之一，Agrobacterium 能够侵染多种具有重要农业和园艺价值的植物，包括樱桃、苹果、梨、葡萄和玫瑰9。Agrobacterium 是研究植物-病原体相互作用的重要模式生物，同时也是植物转化和植物基因工程中的有力工具10,11,12,13,14。
分子植物农杆菌 相互作用已被深入研究数十年，目前对 农杆菌 致病性广泛9,11,15,16. 农杆菌 致病性在很大程度上归因于其感知植物来源信号的进化能力，从而精细调控其毒力程序和细胞间通讯，即所谓的群体感应17。该 农杆菌 毒力程序受根际中存在的多种信号调控，涉及两组双组分系统，即ChvG/I系统和VirA/G系统。根际的酸性条件可激活转录 chvG/I, virA/G以及参与其中的其他多个基因 农杆菌 致病性，包括 virE0, virE1, virH1, virH2以及VI型分泌系统（T6SS）的基因18植物来源的酚类化合物，包括乙酰丁香酮（4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮），可通过磷酸化信号机制激活VirA/G双组分系统。19VirA/G 随后激活整个 病毒 调控子，导致约20 kb的细菌DNA片段（称为转移DNA，T-DNA）从其肿瘤诱导（Ti）质粒转移并整合到植物细胞核中16.T-DNA 携带负责合成植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）的基因（iaaM 和 iaaH）和细胞分裂素（ipt），一旦在植物细胞中表达，便会产生成大量这些植物激素。这会导致异常的组织增生和植物肿瘤的形成，称为冠瘿病，是植物中一种长期存在且反复发生的问题9,11,20IAA 还与水杨酸和γ-氨基丁酸协同作用，共同抑制 农杆菌 毒力或降低 农杆菌 群体感应（QS）17,21,22. 为了抵消这种抑制作用，T-DNA 还携带编码冠瘿碱生物合成的基因，从而激活 农杆菌 群体感应以促进 农杆菌 致病性，同时也为病原体提供营养来源22,23.
尽管对整体已有深入理解 农杆菌-植物相互作用以及T-DNA向植物宿主的转移，其相互作用初始阶段的复杂信号事件仍知之甚少。这在一定程度上是由于传统研究方法的局限性所致 农杆菌- 植物信号传导。植物细胞悬浮培养物和人工位点特异性损伤常用于研究分子水平的植物-微生物相互作用24,26,27然而，细胞悬浮液缺乏典型的植物形态特征；特别是植物悬浮细胞没有根系结构和根系分泌物，而这些对于激活微生物的趋化性和毒力至关重要28,29通过人工损伤植物以维持其形态和根部结构，可促进特异性位点的感染，从而在直接受感染的植物组织中检测到诱导产生的植物防御相关基因30,31然而，人工创伤与自然界中的病原体侵染存在显著差异，尤其是创伤会导致茉莉酸（JA）的积累，从而系统性干扰植物天然的信号传导与防御反应26此外，通常使用合成化学物质人工诱导植物寄主反应或病原体毒力。尽管添加这些化学化合物可反映一定浓度 在植株内 是可能的，但此类补充无法模拟根系分泌物逐渐向周围根际扩散的过程，而这一过程会形成微生物可感知的化学趋向性梯度28,32鉴于传统方法在研究植物-微生物互作方面的局限性，所获得数据的准确性和深度可能受到阻碍和限制，且传统方法所产生的知识可能无法直接转化应用 在植株中植物的许多方面农杆菌 信号传导机制尚未被完全阐明，尤其是在相互作用的早期阶段，此时疾病症状尚未出现。
为了弥补传统方法的局限性，本研究提出了一种经济、可控性强且灵活的水培共培养系统，使研究人员能够更深入地了解分子植物-微生物互作初始阶段复杂的信号传导与响应通路。水培技术已被广泛用于研究植物营养、根系分泌物、生长条件以及金属毒性对植物的影响33,34。水培模型具有多种优势，包括空间需求小、便于获取各类植物组织、对营养和环境条件的精确控制，以及对病虫害的有效防控。与琼脂/植物凝胶平板培养技术相比，水培系统对植物生长的限制更小，后者通常在2-3周后即会限制植物生长。尤为重要的是，完整植株结构的维持有利于根系自然分泌物质，从而支持微生物的趋化性及毒力诱导8,29。本文所描述的系统相较于其他方法更为简便且劳动强度更低33,34。该系统组件更少，除标准剪刀外无需其他工具。采用金属网（而非尼龙33）作为植物生长的稳固支撑，并通过振荡实现无菌条件下的简单通气，以支持微生物生长。此外，该系统可使用不同规格的金属网来支持植物生长，能够适应多种植物种类，且不会限制其根系的扩展宽度。
在本研究所介绍的水培共培养系统中，植物在无菌水培环境中生长，其根系分泌的有机化合物可支持接种细菌的生长。该共培养系统中不添加任何人工化学物质，如植物激素、防御诱导剂或毒力诱导化合物，从而真实反映植物与微生物相互作用过程中的天然细胞信号稳态。利用此水培共培养系统，可同时测定共培养体系中基因的表达情况 拟南芥 Col-0 根组织在受到感染后 农杆菌以及激活 农杆菌 共培养条件下基因的表达变化 拟南芥进一步证明该系统适用于研究 农杆菌 与植物根部共培养（感染）后，根部定殖及植物根系分泌物谱的变化 农杆菌 (图1).
<img alt="植物-细菌共培养过程示意图；转录组学、基因组学、代谢组学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：水培共培养系统及样品分析概览。 植物生长于网状结构上方（地上部分位于网之上），根部浸入水培培养基中，并接种细菌以进行共培养。随后将植物组织与细菌分离，用于同步提取与分析。该图已根据参考文献35 修改。

<table><tbody><tr><td>植物种子（拟南芥 Col-0）</td><td>拟南芥生物资源中心</td><td>CS7000</td><td>https://abrc.osu.edu/order-stocks</td></tr><tr><td>细菌（根癌农杆菌 C58）</td><td>华盛顿大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>标记的细菌</td><td>实验室自制</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 次氯酸钠</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器&amp;nbsp;</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog (MS) 基础盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B5 维生素混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>植物琼脂</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>深型培养皿</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢网筛</td><td>费里尔金属制品有限公司</td><td>N/A</td><td>等级：304；网目数：40 &amp;times; 40；丝径：0.01</td></tr><tr><td>微孔胶带，1&quot;</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>昼夜生长培养箱</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>圆柱形玻璃罐，100 &amp;times; 80 mm&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>3250</td><td>可使用其他尺寸，此时液体含量可能需要调整</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>（多种）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>显微镜载玻片和盖玻片</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>细菌RNA提取试剂盒</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>植物RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）</td><td>Qiagen</td><td>74903 或 74904</td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>qRT-PCR 所需材料与设备</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>微阵列分析所需材料与设备</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>液氮</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 孔径滤膜</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>可密封试管</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>氮气</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>HPLC 所需材料与设备</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr><tr><td>ESI-TOF-MS 所需材料与设备</td><td>（多种）</td><td></td><td>可选，取决于下游分析</td></tr></tbody></table>

一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

模拟自然植物-微生物相互作用的实验设计对于阐明复杂的植物-微生物信号传导过程至关重要。Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens 是研究细菌致病性及植物相互作用的优良模式系统。以往对植物-农杆菌相互作用的研究主要依赖于植物细胞悬浮培养、人为损伤植物组织，或通过合成化学物质人工诱导微生物毒力因子或植物防御反应。然而，这些方法与自然状态下的体内信号传导存在差异，在自然条件下，植物与微生物以时空特异性的方式相互识别并产生响应。本研究介绍了一种水培共培养系统，其中完整植株由金属网筛支撑，并与农杆菌进行共培养。在此共培养系统中，无需添加任何合成植物激素或可诱导微生物毒力及植物防御反应的化学物质。该水培共培养系统更接近于自然的植物-微生物相互作用以及体内信号稳态。植物根系可从含有农杆菌的培养基中分离，从而能够同时且系统地研究植物宿主与互作微生物双方的信号传导与响应过程。在任意设定的时间点或时间间隔，可分别采集植物组织或细菌，用于各种&#34;组学&#34;分析，充分体现了该系统的强大功能与高效性。该水培共培养系统可便捷地应用于以下研究：1）多种植物-微生物系统的双向信号交流；2）植物宿主与多种微生物物种之间的信号传递（即&#160;微生物群落或微生物组）；3）营养物质和化学物质在植物-微生物信号传导中的作用；以及4）微生物如何与植物宿主互作，并促进植物对生物或非生物胁迫的耐受性。

水培共培养系统中的生长
生长曲线 A. tumefaciens C58在共培养的前16小时表现出显著的滞后期，随后在与 A. thaliana Col-0，最大 OD 值600 约0.9，起始于接种后48小时。相比之下，在未接种的对照培养物中几乎未观察到细菌生长 A. thaliana (图4这些结果表明，在无人工额外提供营养的情况下，植物根系分泌的化学物质能够支持 农杆菌 在水培共培养系统中的生长情况。共培养初期16小时显著的滞后期可能是由于宿主感知较为复杂，以及在与病原体共培养时根系分泌物逐渐释放所致。
共培养 A. thaliana 植物在最初3天内未表现出病害症...

所述的水培共培养系统利用金属网筛支撑完整植物，并与细菌进行共培养。随后可分别收集植物组织、细菌及分泌的分子，用于下游分析，同时可对植物宿主及其相互作用的微生物或微生物组的分子响应进行研究。

模拟自然植物-微生物相互作用的实验设计对于阐明复杂的植物-微生物信号传导过程至关重要。

该系统的主要目标是在一种简单且接近自然环境的实验设置中，研究植物与微生物伙伴之间的双向信号互作及响应，或植物对化学物质及非生物因素的响应。本视频展示了植物与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的共培养过程。该方法有助于解答植物-微生物互作、微生物或植物应激反应以及分子信号传导领域中的关键科学问题，包括在植物与微生物相互作用初期阶段的复杂信号交流。该技术的主要优势在于，它能够在包含模拟自然环境的简单体系中，帮助理解植物与微生物相互作用中的信号传导与响应特性。尽管该方法可用于研究植物与单一微生物物种之间的相互作用，也可用于研究植物与多种微生物物种或非生物因素的相互作用。我们最初构想该方法时，正在探索在尽可能接近自然状态的植物-微生物相互作用过程中，细胞信号稳态的机制。实验开始前，必须对种子进行灭菌处理。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana），取约200粒种子与500 µL去离子水加入微量离心管中，高速涡旋振荡混匀。然后将离心管置于台式微量离心机中，以9000 ×g离心30秒。用移液器去除上清液。随后，向种子中加入 300 µL 的 2% 次氯酸钠溶液，并涡旋混匀。将混合物在室温下静置沉降。一分钟后，离心种子。用移液枪移除次氯酸钠溶液，然后向种子中加入500微升无菌去离子水，并涡旋混合。离心管后，弃去上清液。向种子中加入500微升70%乙醇，涡旋混匀。静置种子1分钟后，再次离心管。用移液器除去70%乙醇。用500微升无菌去离子水清洗种子5次。然后，将灭菌后的种子重悬于500微升无菌超纯水中。将25毫升含0.4%植物琼脂的半倍浓度Murashige和Skoog（MS）培养基倒入每个无菌的深型培养皿中。为每个培养皿剪取一块90毫米×90毫米的不锈钢网。将每块网格的四个角稍微弯曲，使其刚好能够放入培养皿内。将网片的四个角弯折至与网片主体呈90度角，使网片可通过四角支撑架起，下方留出足够的空间供根系生长。将裁剪好的网片方块放入烧杯中，并用铝箔覆盖。采用30分钟干热循环程序，通过高压灭菌器对网片方块进行灭菌。当培养基在培养皿中凝固且筛网已灭菌后，将每块筛网小方块放置于固体培养基表面，弯曲的角朝下。轻压筛网，使四个角插入培养基中，同时筛网主体与培养基表面充分接触。随后，使用无菌的 200 微升移液器吸取经过表面灭菌的拟南芥种子，将每粒种子轻轻转移至筛网上方。将种子按照植物种类和实验需求的间距摆放。用培养皿盖封好，并在培养皿边缘贴上多孔外科胶带。用铝箔纸包裹种子。将整个培养皿置于适宜条件下进行种子分层处理。两天后，在22至24摄氏度、16小时光照周期的条件下培养培养皿中的种子10至14天。在无菌操作台中，将18毫升经高压灭菌的液体MS培养基倒入带有无菌盖子的无菌圆柱形玻璃罐中。接下来，使用无菌镊子将每个带有10至14天幼苗的网格方块从半固体培养基的培养皿中轻轻转移至水培圆柱形罐中。此处所示幼苗为苜蓿。使用多孔外科胶带将罐盖密封。然后，在22至24摄氏度、16小时光照周期及50 rpm振荡条件下培养幼苗。接种前，仔细检查幼苗培养罐是否存在任何潜在污染。未受污染的培养罐中的培养基应保持清澈透明。若培养罐因污染而浑浊，则将其丢弃，并对剩余的培养罐进行编号。从每个编号的培养罐中取 20 微升水培培养基，点样于含有LB肉汤或LB琼脂的培养皿中。将培养皿在 28 摄氏度下孵育 28 小时。立即向每个编号的水培罐中加入50微升农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）悬浮液。将幼苗与农杆菌在22至24摄氏度、16小时光照周期条件下共培养，并以50 rpm振荡培养。在培养12小时和28小时后检查LB平板上的菌落，以验证水培培养基的无菌状态。如果存在任何污染，请勿将相应编号的接种了细菌的培养罐用于后续的下游检测。接下来，通过提起筛网板将根系与细菌悬浮液分离。若需将根系用于后续分析，应切割根系，用双蒸水快速冲洗，并在灭菌的滤纸上干燥。若使用叶片或其他组织，需剪下相应组织。进行植物转录分析时，应立即将根或地上部分放入液氮中。进行细菌转录分析时，从共培养罐中转移1.5毫升培养物，并通过离心收集菌体细胞。经过适当的共培养后，使用无菌剪刀分离单个的二级根，即主根的侧枝。接着，用双蒸水冲洗根部，以去除松散附着的物质。将每根根置于载玻片上30 µL水中，完全浸没，然后加盖盖玻片。用指甲油密封盖玻片边缘，以防止根部脱水。然后通过荧光显微镜观察根癌农杆菌（A. tumefaciens）与拟南芥（A. thaliana）根部的附着情况。经过适当的共培养后，将植株从水培培养基中分离。将18毫升水培培养基通过0.2微米孔径滤膜过滤，收集至50毫升锥形管中进行灭菌。将样品在-80摄氏度下冷冻过夜。次日，松开50毫升锥形管的管盖，将其放入冷冻干燥机中冻干36小时。最后，将样品储存或处理以进行高效液相色谱（HPLC）分析和化合物检测。在未人工添加营养物质的条件下，根癌农杆菌c58在共培养体系中生长。相比之下，在不含拟南芥的对照培养中，几乎未观察到细菌生长。通过这种显微可视化观察，可以看出水培共培养系统可用于研究细菌在植物根部结构上的附着情况，其中用PCherry红色荧光标记的细菌定位于植物根部结构，呈现出典型的岩石状或丝状形态。可通过qRT-PCR确定植物组织与互作微生物的基因表达谱。在共培养8小时后，八株根癌农杆菌细胞显示出毒力基因表达的上调。与此同时，拟南芥（A thaliana）的根部在共培养条件下表现出差异性基因表达。与对照组相比，在共培养72小时后，接种植物分泌组中的35种化合物含量升高，76种化合物含量降低。该技术为研究人员提供了一种简单且接近自然环境的实验体系，可用于研究植物与微生物之间的相互作用，以及植物与微生物或微生物群落之间相互响应的过程，或植物对非生物因素的响应。观看本视频后，我们希望您能够建立一种在水培条件下研究分子植物、微生物相互作用及其信号响应的植物-微生物共培养系统，该系统具有更接近自然且易于操控的环境。

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生物学

用于植物/微生物分子相互作用和信号的同时系统分析的水培共培养系统

来源：Nathoo, N.，等．一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统．J. Vis. Exp.

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