Name: 鱼类生殖生态学研究的基本方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习在活体鱼类中植入VIE标记的无损伤技术，用于水族箱内的生殖生态学和行为生态学研究。该方法可在最小化应激的前提下追踪个体行为，适用于多种鱼类的野外采集与长期观察实验。

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我们感谢 S. Yokoyama 在鱼类采集方面提供的帮助。我们还感谢 W. Kawamura 在养殖方法上给予的有益建议。本研究由日本促进科学学会（KAKENHI）资助，资助编号分别为 24370006 和 16K07507，授予 T.S.。

1. 活鱼的采集与运输
注意：本方案描述了如何从深度 ≥15 m 处将具有鳔的鱼类收集至水面。快速运送至水面会因压力变化导致鳔膨胀，可能严重伤害或致死鱼类。需格外谨慎，因为在该第一步操作中对鱼类造成的损伤将对其存活率及后续行为产生负面影响。
<ol>
	<li>在进行水肺潜水之前，准备以下材料：适合在水下捕获目标物种的手持网；足够容纳鱼类的双层聚乙烯袋；橡胶圈（ø 80 mm × 6 mm）；用于在水面为采集袋充气的氧气瓶；Elbagin（一种含10%硝基苯乙烯酸钠的抗菌剂）；用于放置采集袋的聚苯乙烯泡沫箱；移液器；以及必要时（参见步骤1.4）一根长度等于最大潜水深度的绳索和至少2 kg的配重。</li>
	<li>使用手抄网在潜水时捕获目标鱼类；仍在水下时，将捕获的鱼放入聚乙烯袋中，并用橡皮筋扎紧袋口。若运送至水族箱所需时间≥1天，还需另用袋子保存其自然栖息地的水样，用于后续更换养殖用水。 
	注意：出于安全考虑，水下任务必须由至少两人共同完成。</li>
	<li>从采集点以不超过1米/分钟的速度上浮：在深度10米或更深时，每上升2米停止1至5分钟；从10米深度至水面，每上升1米停止1至5分钟。当捕获的鱼类在袋中无法维持浮力时即，如果它们因膨胀的鱼鳔而上浮但仍试图向下游动），则保持在同一深度1-5分钟，或下潜至深1-2米处。一旦鱼类似乎恢复了浮力控制，即可继续缓慢上浮至水面。 
	注意：如果在上浮过程中存在水肺气瓶空气可能耗尽的情况，应将一根绳索系在聚乙烯袋上，并悬挂一个≥2 kg的重物；待水下操作人员安全上浮后，以与上述规定相同的速度将该装置拉回水面。</li>
	<li>在海滩或船上，每次上浮后，向每个聚乙烯袋的水中加入 Elbagin 至浓度为 10 ppm 并使其溶解。 
	注意：尽管一些鱼类在被带到水面后可能无法立即维持浮力，但大多数鱼类预计在一天内可恢复。</li>
	<li>如果收集袋中鱼的密度较高，应将鱼分装到更多的袋子中，以防止运输过程中因相互摩擦而造成损伤。若该鱼类为攻击性物种，应将其单独分装在不同的袋子中。</li>
	<li>用氧气充盈采集袋，然后再次用橡皮筋密封袋口。向袋内通入氧气时，应将喷嘴伸入袋内的水中，以增加溶解氧含量；完全膨胀的袋子中，水应占袋容积的1/4。</li>
	<li>将装有鱼的收集袋置于聚苯乙烯泡沫箱中，以在黑暗条件下维持水温稳定并降低鱼的应激反应。</li>
	<li>若运输至水族箱所需时间≥1天，则每天需更换每袋养鱼用水的1/4至1/3，所用水为从原栖息地保留并添加10 ppm Elbagin的水，并重新充氧封装。每天用手持网或移液器清除袋底的死鱼和排泄物。 
	注意：如果涉及空运，应在运输前至少等待1天，使鱼类适应地表气压，因为在短时间内经历两次压力变化（从水下到地表，再从地表到高空）可能对鱼类的存活产生不利影响。</li>
</ol>
2. 将鱼类适应至水族箱
<ol>
	<li>将装有鱼的袋子放入水族箱中漂浮30分钟，以平衡水温。</li>
	<li>在10分钟内逐步将袋中的水替换为水族箱中的水，以避免因水质化学成分 sudden 变化而引起的冲击例如pH、盐度 
	注意：鱼类若因水质化学差异过大而受到刺激，可能出现体色和/或行为的异常变化。在适应过程中应密切监测。</li>
	<li>将10 ppm的Elbagin溶解于水族箱水中。</li>
	<li>此后，连续3天每天更换1/3的鱼缸水，并在新换的水中加入10 ppm的Elbagin。</li>
	<li>最后，通过每天更换一半的水族箱水来开始清除Elbagin，直至颜色消退。</li>
</ol>
3. 注射可视植入弹性体（VIE）标记以识别个体鱼类
注意：本研究中使用 VIE 标签对个体鱼类进行标识；示例可参见 Frederick10、Olsen 和 Vøllestad11 以及 Leblanc 和 Noakes12。此外，若研究物种体型足够大，可直接用手操作，则步骤 3.2 中使用的手术台将无需使用。
<ol>
	<li>确定每个个体的注射位置和标签颜色。最安全的选择是在身体肌肉较厚的背侧或尾部区域进行注射，应避免在腹部注射，以防刺伤内部器官。 
	注意：文中描述了一种编号系统 图1：如果研究物种体型足够大，可进行8个位置的注射，则使用单一颜色即可识别154个个体。市面上有10种颜色的VIE标记可供选择。应根据鱼类的体色选择易于区分的颜色。</li>
	<li>对于体型小于手握范围的鱼类，按如下方法准备手术台（另可参考 Kinkel 等.13) (图2).
	<ol>
		<li>剪取一块尺寸为5 cm长×5 cm宽的软质海绵，其厚度至少比培养皿的高度低5–10 mm。</li>
		<li>在海绵上切出一条深约5 - 10 mm的凹槽，并根据鱼体的大致宽度调整其宽度。将聚氯乙烯（PVC）板（厚度0.3 mm）裁剪为5 cm长 × 5 cm宽，然后弯折成V形（或M形）。</li>
		<li>将带槽的PVC板放在带槽的海绵上，然后将海绵放入培养皿（ø 160 mm，深度30 mm）中。使用回收水箱中的水填充培养皿，直至PVC板充分浸没。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据VIE标记手册制备VIE标记物。混合弹性体材料，并将混合物加入试剂盒中包含的带有29号针头的3 mL注射器中。</li>
	<li>准备两个用于标记注射过程的水箱：一个用于麻醉，另一个用于恢复；调节这两个水箱的温度和盐度，使其与养殖水族箱中的水质一致。在恢复水箱中使用气泵和气石对水体进行轻微循环。</li>
	<li>将2-甲基喹啉与等体积的99.5%乙醇混合，配制麻醉液；将其加入麻醉罐中，使终浓度达到18 ppm。 
	注意：麻醉液的最佳浓度取决于个体的物种和体型大小。因此，应预先确定所研究物种的最佳浓度。</li>
	<li>将单条鱼转移至麻醉缸中使其进入麻醉状态：即等待鱼对触碰或轻敲缸壁引起的水体振动无反应。由于许多鱼类在麻醉时体色会发生变化，因此需仔细观察体色变化，并据此判断鱼是否已进入麻醉状态。由于鱼有可能从麻醉缸中跳出，至少在鱼开始缓慢游动之前，应使用透明亚克力板覆盖缸口。 
	注意：根据研究物种及其体型大小，微调麻醉所需时间和/或调整麻醉液浓度。若麻醉导致鳃盖运动停止，鱼类将面临极高的死亡风险。</li>
	<li>由于鱼类在体温升高时会变虚弱，因此在麻醉鱼类时应将手指保持在相对较冷的水中。</li>
	<li>从麻醉缸中取出一条鱼，迅速测量或记录所需数据（总长度、性别， 等等如果在测量过程中鱼似乎已恢复，应立即将其转回麻醉池。</li>
	<li>将鱼转移到手术台上，使其腹面朝下置于PVC凹槽中。若鱼体较小，注射时需使用双目显微镜辅助操作。若研究对象体型足够大，可直接用手固定并进行VIE标记注射。</li>
	<li>将针头斜面朝外、针尖朝向鱼头方向。以大致与鱼体平行的角度，尽可能贴近皮下位置进行皮下注射。根据鱼体大小以及标签是否易于观察，调整进针深度。</li>
	<li>在退出针头的同时注射VIE标记物，并在针尖斜面到达进针点之前停止注射（若在相对较宽的区域注射标记物，则此操作较易辨别）。</li>
	<li>完成标签注射后，立即将鱼转移到恢复池中。如果恢复过程显得过慢，可用手轻轻搅动水体以促进循环。</li>
	<li>恢复后，将鱼放回养殖水族箱，并继续在水中添加 10 ppm Elbagin，持续 3 天。 
	注意：在VIE标记可视性较低的条件下，使用UVA滤光灯可有助于识别标记。</li>
</ol>
4. 计数底栖黏性卵
<ol>
	<li>为了创建一个人工产卵巢，使鱼类能够在其上产下黏性卵，将一根不透明的PVC管（ø 5 cm，长6 cm）沿直径方向垂直切成两半。 
	注意：上述管材尺寸适用于体型较小的虾虎鱼 T. marinae 的产卵。因此，应根据研究物种的具体情况调整PVC管的尺寸和形状。</li>
	<li>在一张防水纸上打印5 mm × 5 mm的网格，并将其裁剪成适合PVC管内壁面积的大小。</li>
	<li>使用橡皮筋将防水纸固定在PVC管内壁上。 
	注意：如果雌鱼难以在防水纸上附着卵，或卵容易从纸上脱落，可用砂纸将纸面处理成粗糙表面以增加附着力。</li>
	<li>在水族箱底部铺上一层1–2 cm厚的沙子。将PVC管约三分之一的部分倾斜插入沙中，固定有防水纸的一侧朝下。</li>
	<li>鱼类成功产卵后，将带有卵块的防水纸从PVC管中取出，放入盛有水族箱水的培养皿中。在PVC管内安装一张新的防水纸，并将其放回水族箱底部原位。最后，通过拍摄卵块照片来计数卵的数量。
	<ol>
		<li>或者，若需在产卵后观察亲鱼护卵行为，则应小心避免将卵带离水面。可使用培养皿连同水族箱水一起将卵和防水纸舀起，快速拍摄卵块照片后，再小心地将带有卵块的防水纸重新固定回原来的PVC管中，并将其放回水族箱底部的原始位置。最后，根据照片进行卵的数量统计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用ImageJ软件计数卵（图3）。以下资源详细说明了自动和手动细胞计数方法：基础细胞计数（芝加哥大学综合光学显微镜核心设施，http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php）；颗粒分析（http://imagej.net/Particle_Analysis）；细胞计数器（https://imagej.net/Cell_Counter）。
	<ol>
		<li>否则，若卵分布密集，可通过计算面积密度比来估算卵的数量：在打印出的5 × 5 mm2网格内计数卵，计算卵的密度；使用ImageJ测量被卵覆盖的表面积；再根据单位面积卵密度和总表面积估算卵的总数。上述使用ImageJ进行表面积测量的方法详见以下资源：设定比例尺…（研究服务部门，https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html），该页面说明如何定义图像的空间比例尺；使用ImageJ测量表面积（凯恩州立学院学术技术中心，https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/）。 
		注意：若卵为透明状，使用黑色防水纸更适用于自动计数方法，因为ImageJ能够更清晰地识别单个卵的轮廓。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Helfman, G., Collette, B. B., Facey, D. E., Bowen, B. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHelfman%2C+G+%22The+Diversity+of+Fishes%3A+Biology%2C+Evolution%2C+and+Ecology%22">The Diversity of Fishes: Biology, Evolution, and Ecology</a>. , Wiley-Blackwell. Oxford. (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

许多鱼类的繁殖生态学研究通常通过实验性培育得以揭示。尤其是性别转变6,8,14、配偶选择15,16以及种内竞争7,17等主题，常以水族箱中饲养的鱼类为对象进行深入研究。此外，一些在水族箱中观察到的结果后来在野外研究中得到了证实8,18。这些发现支持了利用野外捕获鱼类在水族箱中开展培育实验的有效性和可信度。同时，通过培育实验模拟那些在自然条件下可能发生但较为罕见的情境，对于后续大规模的野外研究而言，也具有重要的前期探索价值。
本方案描述了适用于小型底物...

鱼类在形态、生态和行为方面表现出显著的适应性进化1。尤其是与繁殖相关的生态特征具有高度多样性，其中大多数特征可直接受到个体适合度的影响2。为了深入了解导致不同鱼类物种演化出独特特征的选择压力，通常通过活体鱼类直接观察其繁殖和社会行为，以验证理论假设，这种方法往往具有重要意义。
然而，对鱼类进行持续的野外观察可能需要专门的水下设备和设施，而这些设备和设施难以维护。在这种情况下，对野外捕获并在水族箱中饲养的鱼类进行观察可能会有所帮助3,4,5。此外，通过在水族箱中操控实验，原本在自然条件下罕见或难以观察到的鱼类行为也可能实现高效观察6,7,8。通过尽量减少人为应激和物理损伤，在良好条件下饲养鱼类，对于准确的生态学研究至关重要。
侏儒虾虎鱼Trimma marinae体长可达23-25毫米，分布于西太平洋海域，栖息于平静且受庇护的海湾中，深度为9-26米9。本研究以T. marinae为模型，介绍一系列基本技术，包括使用自给式水下呼吸装置（SCUBA）采集鱼类、鱼类运输，以及最终将鱼类适应性驯养于水族箱中，以便直接观察该研究物种的繁殖行为与生态特征。

<table><tbody><tr><td>手网</td><td>Nisso</td><td>AQ-17</td><td>根据目标物种的体型进行选择。</td></tr><tr><td>聚乙烯袋</td><td>San-U Fish Farm</td><td>8194</td><td></td></tr><tr><td>橡胶带</td><td>ESCO Co. LTD.</td><td>78-0420-64</td><td>&amp;oslash; 80 mm × 6 mm</td></tr><tr><td>氧气瓶</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于潜水设备的氧气瓶。</td></tr><tr><td>Elbagin</td><td>Japan Pet Design Co. Ltd.</td><td>75950</td><td>同公司提供的Pafurazine F与Elbagin为等效药物。</td></tr><tr><td>聚苯乙烯泡沫箱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>AS ONE</td><td>1-8625-04</td><td></td></tr><tr><td>绳索</td><td>Mizukami Kinzoku Co. LTD.</td><td>95301601</td><td></td></tr><tr><td>配重块</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于潜水设备的配重块。</td></tr><tr><td>水箱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>气泵</td><td>KOTOBUKI</td><td>4972814 062115</td><td></td></tr><tr><td>气石</td><td>KOTOBUKI</td><td>4972814 232204</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基喹啉&amp;nbsp;</td><td>Wako</td><td>170-00376</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>可视植入弹性体标记试剂盒</td><td>Northwest Marine Technology</td><td>N/A</td><td>http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml</td></tr><tr><td>软海绵</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PVC板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>厚度为0.3 mm的PVC板便于使用。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>较大的培养皿（例如&amp;nbsp; &amp;oslash; 160 mm，深度30 mm）便于进行VIE标记注射。</td></tr><tr><td>透明亚克力板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UVA滤光灯&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PVC管</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&amp;oslash; 5 cm</td></tr><tr><td>防水膜</td><td>SOMAR Corp.</td><td>3EKW03</td><td>适用于普通复印机的薄膜。</td></tr><tr><td>沙子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

水族箱中鱼类生殖生态学研究的基本方法

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

在无法进行连续野外调查的情况下，人工圈养观察对于揭示鱼类行为与生态学特征具有重要价值。本文以一种野生捕获的虾虎鱼科鱼类为模型，介绍了一系列基本技术，以实现对其繁殖行为的观察。该方法主要包含三个步骤：采集、运输以及对底物产卵鱼类繁殖生态学的观察。活鱼采集与运输的关键环节包括：（1）防止鱼类受伤；（2）谨慎地使其适应水族箱环境。在采集活鱼过程中，必须避免因刮伤或水压骤变等造成伤害，因为任何身体损伤都可能对鱼类的存活及其后续行为产生负面影响。仔细的水族箱适应过程可降低死亡率，并减轻运输带来的应激反应。圈养期间的观察内容包括：（1）个体鱼的识别；（2）在不对鱼类或卵造成负面影响的前提下，对产出的卵进行监测，从而能够深入研究该物种的繁殖生态学特征。皮下注射可视植入性弹性体（VIE）标记是一种准确识别个体鱼类的有效方法，适用于多种体型大小的鱼类，且对其存活和行为影响极小。若研究物种为产黏性卵的底物产卵者，则可通过使用聚氯乙烯（PVC）管构建人工巢穴，并附加可移除的防水薄片，以方便对卵的数量统计和持续监测，同时减少研究人员对鱼类护巢及护卵行为的干扰。尽管这些基础技术在科研论文中往往鲜有详细描述，但对于需要开展野生鱼类人工圈养实验的研究而言，它们至关重要。

根据上述方法，分别于2014年、2015年和2016年4月在日本鹿儿岛县奄美大岛近海采集到41、15和96只T. marinae个体（表1）。在每种情况下，分别有25只（61%）、14只（93%）和91只（95%）个体存活至在水族箱中产卵。如Fukuda et al.3报道，在2014年的观察期间仅有一条鱼死亡，且鱼类产卵通常在捕获后7天开始，表明这些个体处于良好的养殖条件下。
VIE 标签清晰可见，能够对个体进行识别，即使是在这种小型鱼类中也是如此（图 4A，4B）。图 4C 展示了产在防水垫上的卵的 photograph，证明其清晰度足以进行计数。移出并拍照后，将防水垫放回水族箱中...

本文介绍了一系列用于研究养殖鱼类繁殖生态学的基本方法。这些方法包括使用水肺潜水采集鱼类、运输活鱼，以及观察在水族箱中饲养的野生鱼类的繁殖行为，均为实用的操作方案。

圈养繁育观察在无法开展连续野外调查时，对于揭示鱼类行为与生态特征具有重要价值。本文介绍了一种……

本实验的总体目标是在不对活鱼造成伤害的情况下植入识别标记，以便利用野外捕获的鱼类在水族箱中开展各种生态学研究。该方法有助于回答鱼类行为生态学领域的一些关键问题，例如鱼类的繁殖行为和社会行为。该技术的主要优势在于，我们能够在对鱼类行为无明显负面影响的情况下开展实验。本部分展示了如何对鱼类植入VIE标记。如果鱼类体型过小而无法用手固定，应制作一个手术台来固定此类鱼类。首先将一块软质海绵切割成一个边长约5平方厘米、高20至25毫米的截面。然后在海绵上切出一个深5到10毫米、宽度与所容纳鱼类相当的凹槽。接着裁剪一块厚度为0.3毫米的聚氯乙烯（PVC）材料，使其恰好覆盖在海绵上。随后在PVC上添加一条谷折线，并将其嵌入中央凹槽中。现在将组装好的装置转移至一个直径160毫米、壁高30毫米的培养皿中，并从回收水箱中向皿内注水，直至PVC板完全浸没。至此，手术台制备完成。接下来开始对一条鱼进行标记操作。首先，选择注射部位和标签颜色。注射较厚的肌肉区域（如背部或尾部）比注射腹部更安全，因为腹部注射可能刺伤内脏器官。如果研究物种体型足够大，则有八个较为合适的标签植入位置。仅使用一种标签颜色并利用全部八个位置时，可生成154种独特的识别图案。选择标签颜色时，应选用与生物体体色对比最明显的颜色。随后使用标签试剂盒制备VIE标签。混合弹性体材料，并将其装入带有29号针头的三毫米注射器中。接下来准备两个水箱用于标签注射过程，一个用于麻醉，另一个用于恢复。使用气石使恢复缸中的水轻微循环。对于麻醉缸，配制一份二甲基喹啉与99.5%乙醇按1:1比例混合的储备液。加入量以使缸中二甲基喹啉浓度达到18 ppm为宜，并将溶液充分混匀于缸内水中。完成这些准备工作后，开始对鱼类进行标记。将一条鱼转移至麻醉缸中，并盖上盖子以防止其逃逸。根据具体物种调整此步骤的细节。麻醉剂的浓度是一个重要因素。应等待至斑马鱼对水流振动或触碰均无反应为止。切勿等到鳃盖完全停止运动，否则斑马鱼有很高的死亡风险。当鱼准备就绪后，用手将其取出。操作时应使用经冷水适应的手，以避免鱼体温度过高，从而保持其活力。从麻醉缸中捞出一条鱼，迅速进行体征测量。如果在此期间鱼类出现恢复迹象，应立即将其转回麻醉池。若鱼类体型较小，将其腹面朝下转移至PVC凹槽的手术台上。若鱼类体型非常小，需使用双目显微镜进行注射。如果鱼的体型足够大，可以手持操作，则进行手持注射。将针头斜面朝外，针尖朝向鱼体。然后以大致与鱼体平行且非常浅的角度将针头插入皮下，仅位于皮肤下方。最终目标是使标签可见，因此需根据需要进行调整。接下来，在撤出针头的同时注入VIE标签，并在针尖斜面到达穿刺点之前停止注射。在鱼体上注射相对较大的区域，有助于判断停止注射的位置。如果注射不顺利，需确保麻醉已起效，并迅速将针头插入适当深度。注射后立即将鱼转移到恢复缸中。如果恢复时间超过两分钟，应手动

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水族箱中鱼类生殖生态学研究的基本方法

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